Name: manipulating the murine lacrimal gland
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Los autores desean agradecer el financiamiento proporcionado por el Programa de Asignación de Recursos de la UCSF.

Todo el trabajo de los animales se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco. 1. embrionarias de ratón lagrimal Glándulas (LG): La recolección y Microdisección <ol><li> Siguiendo los procedimientos aprobados por los Animales institucionales para comité de ética de la investigación científica, la eutanasia programada embarazadas CD-1 (o transgénicos) las hembras con el aumento de inhalación de CO2, seguido de confirmación por dislocación cervical a los embriones de cosecha en el día embrionario adecuado. Designar el día de la vagina e0 descubrimiento enchufe. Nota: las glándulas lagrimales (LGS) puede ser cosechada desde el escenario solo brote e14 en adelante. Sin embargo, e16 (5-10 yemas) embriones dan los resultados más consistentes para el cultivo ex vivo. </li><li> Esterilizar la ventral lado del ratón usando etanol al 70%. Apriete la piel y hacer una incisión en la línea media con unas tijeras quirúrgicas estériles; cortar a través de la piel y el peritoneo para exponer la cavidad abdominal. Retire los 2 cuernos uterinos cortando a lo largo de la mesometrio en la parte superior de cada cuerno uterino y el lugar en PBS frío (tampón fosfato salino) o medio DMEM F12 suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Con unas pinzas (# 5), eliminar los embriones de las bolsas amnióticas y colocar en una segunda placa de Petri estéril que contiene PBS frío. Tenga cuidado de no tocar los ojos o la zona de la cabeza. </li><li> Coloque embrión en un microscopio de disección con una base de transiluminación. Si el embrión es &lt;e17, realice los pasos 1.5 a 1.7. Si los embriones son&gt; e17, estos pasos pueden ser útiles, pero no son esenciales, por lo tanto, continúe con el paso 1.8. </li><li> Cortar la cabeza del torso justo por debajo de la mandíbula inferior (paso 1, Figura 2) usinga bisturí estéril (# 10 cuchilla). Girar la cabeza de manera que la mandíbula se encuentra ahora en la placa de disección. Utilice pinzas para estabilizar la cabeza y el bisturí para eliminar alrededor de ¼ de la parte dorsal del cerebro (el paso 2, 1 de corte, figura 2) - esto es especialmente importante una vez que el cartílago se endurece alrededor de e15. </li><li> Oriente la cabeza para que el bisturí puede perforar la nariz entre los ojos. Haga un corte a través del centro de la cabeza, de modo que los ojos están puestos en mitades separadas (paso 2, 2º corte, Figura 2). </li><li> El uso de dos # 5 pinzas, tomar la mitad de la cabeza y quite el exceso de tejido (véase el paso 3, Figura 2). Asegúrese de orientar la cabeza por lo que el LG (que se encuentra en la esquina posterior inferior del ojo) no se pierde en este proceso de eliminación. Eliminar el exceso de cerebral, cartílago y tejido nasal circundante y debajo del ojo. Puesto que la glándula es apenas visible en este momento, garantizar el ojo está orientada correctamente después de exceso de tejido eliminación to evitar la pérdida de la ubicación de la LG. </li><li> Agarrar con cuidado la piel de la parte posterior, en la esquina inferior del ojo con las dos pinzas. Quitar la piel tirando cuidadosamente abierta con las pinzas para exponer el LG. Utilice iluminación adicional por encima y por debajo del tejido para ayudar a visualizar el LG. Nota: El LG, distinguibles por su aparición como un botón en un conducto dentro de un mesénquima condensado más oscuro, debe ser visible en este punto. </li><li> Empezar con cuidado para diseccionar el LG y mesénquima asociado (consulte el diagrama e imágenes) de distancia del tejido que rodea el uso de fórceps, teniendo cuidado de no agarrar el LG o su conducto asociado. Una vez que la glándula está libre del tejido circundante, eliminar suavemente toda la glándula agarrando el epitelio que rodea el ojo en la base del conducto de LG. Tenga cuidado para preservar el mesénquima que rodea el epitelio, que se puede observar como un mesénquima condensado en el que los invagina epitelio. NOTA: Algunos eliminación adicional de tissue (los pequeños fragmentos de hueso, músculo y tejido conectivo) pueden ser necesarias para evitar factores de señalización / crecimiento de los tejidos vecinos. </li><li> Para el cultivo, la cosecha 4 - 5 glándulas y mesénquima asociado por placa (GL se colocan inmediatamente después de la disección); recoger un mínimo de 14 ganglios por cada 100 l de tampón de lisis de ARN por RT-PCR 6. </li></ol> 2. Prepare las placas para ex vivo Cultura Este procedimiento se basa en que la empleada para el desarrollo de la glándula salival 7,8. <ol><li> Añadir 200 l de DMEM F12 (suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) medios de cultivo con 50 mg / ml de ácido ascórbico y 50 mg / ml holo-transferrina a un plato de 50 mm de diámetro de micropocillos con fondo de vidrio 7. Nota: F12 DMEM fue elegido ya que previamente nos pareció que para maximizar la morfogénesis de la glándula salival embrionaria. </li><li> Flotador un Polycarb 13 mmfiltro de membrana de 0,1 micras Oñate con poros en la parte superior de los medios de comunicación. </li><li> Paso opcional: Diluir laminina 3-D 1: 1 con DMEM / F12 para hacer una concentración final de 3 mg / ml (200 l utilizar la pipeta para mezclar suavemente; centrifugar durante 1 min si aparecen burbujas). Añadir 15 l de esta diluyeron laminina 3-D para filtrar. Nota: Esta dilución se encontró que era óptimo para el mantenimiento de la LG en su estado 3D sin comprometer ramificación epitelial. Sin embargo, no es esencial para la cultura de LG. </li><li> Coloque 4 - 5 LG en filtro o en laminina. Cultura GL ex vivo por 24 - 48 h (Figura 3) o fijar con PFA al 4% durante 20 min para su posterior análisis por qPCR o inmunotinción (Figura 4). Para el análisis qPCR de tejido glandular embrionario, por favor consulte Rebustini et al., 2011. Para el análisis de inmunofluorescencia de los tejidos glandulares embrionarias por favor consulte las siguientes citas: Hoffman et al, (2002) y Steinberg correo.t al., (2005). </li></ol> 3. Ratón postnatal y adulto lagrimal Glándulas (LG): Disección <ol><li> La eutanasia del ratón postnatal de acuerdo a las normas del comité de ética animal apropiado. Para cachorros postnatal día 8 o más jóvenes, la eutanasia por el corte de la cabeza con unas tijeras estériles. Para el día postnatal 8 años o más, rociar la piel con etanol al 70%. </li><li> Para localizar el LG, yacía ratón lateral lado bajo un microscopio de disección con iluminación desde arriba. Nota: El LG postnatal y adulto se limita con la arteria carótida, el músculo masetero y la dermis (ver Figura 5). </li><li> El uso de pequeñas tijeras de disección, hacer pequeña incisión en la epidermis lateralmente desde donde se debe colocar el LG. </li><li> Con unas pinzas, abra la epidermis hacia la oreja para exponer el LG. </li><li> Utilice pinzas para aflojar suavemente LG del tejido circundante. </li><li> Una vez que el LG se libera del tejido circundante, retire con cuidado el LG por el conducto,agarrando donde el conducto y el epitelio que rodea el ojo se conectan (Figura 1). </li><li> Coloque los GL en tampón de lisis de ARN para RT-PCR, o fijar con PFA al 4% durante 20 min para inmunotinción. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La versatilidad de la cultura y manipular el LG ex vivo ofrece ventajas significativas para el estudio de su desarrollo. Esto incluye la velocidad a la cual el investigador es capaz de probar las hipótesis y la multitud de las perturbaciones que se pueden realizar para evaluar cómo epitelial, neuronal, endotelial y células mesencyhmal interactúan para formar el órgano. Sin embargo, hay una serie de advertencias cuando se utiliza este modelo. En primer lugar, en virtud de su aislamiento de la glándula ya n...

La glándula lagrimal (LG) es responsable de la secreción de lágrima acuosa crítica para la agudeza visual y la salud, el mantenimiento y la protección de las células de la superficie ocular. LG resultados disfunción en uno de los trastornos oculares más comunes y debilitantes: acuoso deficiente en seco de Enfermedades de los ojos, que se caracteriza por la irritación ocular, sensibilidad a la luz y la disminución de la visión 1. En el ser humano la LG reside en la órbita por encima del extremo lateral del ojo donde 3 - 5 excretores lágrimas de depósito conductos sobre la superficie ocular. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal (LG) situado anterior y ventral de la oreja (exorbital) con lágrimas que viajan al ojo a través de un solo conducto excretor. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto a parasoy una intrincada red interconectada de acinos y conductos de secreción (Figura 1) 2. Durante el desarrollo del epitelio se vasculariza, así como en gran medida inervado por los nervios parasimpáticos del ganglio pterigopalatina y en menor medida por los nervios simpáticos del ganglio cervical superior 3. Las interacciones entre cada uno de estos tipos de células es decir, células neuronales, epiteliales, endoteliales y mesenquimales, son esenciales para la función y el mantenimiento del tejido adulto. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes de coordinación de desarrollo LG y regeneración, así como la forma en guías de comunicación de tipo de células entre estos procesos sigue siendo poco clara. El advenimiento de las embrionarias ex vivo las técnicas de cultivo ha permitido la identificación de las vías de desarrollo y regenerativos en múltiples órganos de ramificación 4. El cultivo ex vivo da el investigador la capacidad de manipular el órgano (memecánico, genético o químico) bajo condiciones definidas, así como para caracterizar el desarrollo de órganos y las interacciones célula-célula en tiempo real. El LG exorbital del ratón es altamente susceptible a esta técnica y estudios recientes han definido sistemas que regulan su desarrollo 2,5 señalización. Sin embargo, a pesar de la necesidad de comprender las señales moleculares que sustentan el desarrollo de LG y la regeneración, en la actualidad sigue siendo poco estudiada, probablemente debido a las dificultades técnicas para aislar el órgano. En este trabajo se describe cómo aislar y llevar a cabo el cultivo ex vivo de la embrionaria murina LG para definir los programas de desarrollo.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 without HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>P0781</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Albumin solution from bovine serum</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% Solution</td><td>15710</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Diluted to 4% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1x</td><td></td><td></td><td>Prepared from 10x stock</td></tr><tr><td>holo-Transferrin bovine</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid (Vitamin C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>Stereo Microscope with substage iluminator</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td></tr><tr><td>Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35&amp;nbsp;mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>50 mm uncoated glass bottom dishes</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Widefield fluorescence microscope</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td></tr><tr><td>SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2&amp;nbsp;cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td></tr><tr><td>Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11&amp;nbsp;cm)</td><td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td><td>Ideal for harvesting glands from embryos.</td></tr><tr><td>Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td><td></td><td>Charles River Labs</td><td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1&amp;nbsp;&amp;mu;m pore size, 13&amp;nbsp;mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td></tr></tbody></table>

manipulating the murine lacrimal gland

La glándula lagrimal (LG) segrega lágrimas acuosas necesarias para mantener la estructura y la función de la córnea, un tejido transparente esencial para la visión. En el ser humano una sola LG reside en la órbita sobre el extremo lateral de cada ojo la entrega de lágrimas a la superficie ocular a través de 3 - 5 conductos. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal exorbital (LG) situado anterior y ventral de la oreja. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto para formar una red interconectada intrincada de los acinos y conductos de secreción. Este elaborado proceso ha sido bien documentado en muchos otros órganos epiteliales, tales como el páncreas y la glándula salival. Sin embargo, el LG ha sido mucho menos explorada y los mecanismos que controlan la morfogénesis son mal bajoresistido. Tenemos la sospecha de que esta falta de representación como un sistema modelo es una consecuencia de las dificultades relacionadas con la búsqueda, la disección y el cultivo de la LG. Por lo tanto, aquí se describen técnicas de disección de embriones cosecha y post-natal LG y métodos de cultivo ex vivo de los tejidos.

El LG desarrolla a través del proceso de la morfogénesis de ramificación epitelial. Imágenes de campo claro de los gobiernos locales de embriones disecados en e14, e15, e16, e17, y P2 ilustran este evento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. El LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis de ramificación epitelial. Imágenes de campo clar...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

La glándula lagrimal (LG) es un órgano de ramificación que produce los componentes acuosos de lágrimas necesarias para el mantenimiento de la visión y la salud ocular. Aquí describimos murino LG disección y ex vivo las técnicas de cultivo de descifrar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de LG.

La manipulación de la murino Glándula Lagrimal

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K vistas.  University of California San Francisco.  La glándula lagrimal (LG) es un órgano de ramificación que produce los componentes acuosos de lágrimas necesarias para el mantenimiento de la visión y la salud ocular. Aquí describimos murino LG disección y ex vivo las técnicas de cultivo de descifrar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de LG. 

Video: Manipulating the Murine Lacrimal Gland

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

Un modelo de conejo de enfermedad ocular seca acuosa-deficiente inducida por la inyección de Concanavalin A en las glándulas lagrimales: Aplicación a estudios de eficacia de fármacos

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

Investigación

Medicina

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Establecimiento de un modelo de ojos secos severos mediante dacrioadenectomía completa en conejos

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

El aislamiento de las células mioepiteliales de la murina lagrimal adulta y las glándulas submandibulares

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Biología

Disfunción de la glándula lagrimal inducida por escopolamina en ratas

A Rat Dry Eye Model with Lacrimal Gland Dysfunction Induced by Scopolamine

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal tear production can lead to a disturbance in the ocular surface environment, including corneal damage and inflammation. In severe cases, ADDE can cause vision loss or even blindness. Currently, dry eye treatment is limited to eye drops or physical therapy, which can only alleviate eye discomfort symptoms and cannot fundamentally cure dry eye syndrome. To restore the function of the lacrimal gland in dry eye, we have created an animal model of lacrimal gland dysfunction in rats induced by scopolamine. Through the comprehensive evaluation of the lacrimal gland, corneas, conjunctivas, and other factors, we aim to provide a full understanding of the pathological changes of ADDE. Compared with the current dry eye mouse model, this ADDE animal model includes a functional evaluation of the lacrimal gland, providing a better platform for studying lacrimal gland dysfunction in ADDE.

Autor destacado: Desafíos en el desarrollo de modelos animales de ojo seco y futuras direcciones de investigación

Here, we establish a rat model of lacrimal gland dysfunction to provide a basis for the study of aqueous-deficient dry eye.

Un modelo de ojo seco de rata con disfunción de la glándula lagrimal inducida por escopolamina

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture method to obtain a sufficient number of LG stem cells (LGSCs) is one obstacle for further research and application. The three-dimensional (3D), serum-free culture method for adult mouse LGSCs is well established and shown here. The LGSCs could be continuously passaged and induced to differentiate to acinar or ductal-like cells.
For the LGSC primary culture, the LGs from 6-8-week-old mice were digested with dispase, collagenase I, and trypsin-EDTA. A total of 1 &#215; 104 single cells were seeded into 80 &#181;L of matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in each well of a 24-well plate, precoated with 20 &#181;L of matrix gel-LGSCM matrix. The mix was solidified after incubation for 20 min at 37 &#176;C, and 600 &#181;L of LGSCM added.
For LGSC maintenance, LGSCs cultured for 7 days were disaggregated into single cells by dispase and trypsin-EDTA. The single cells were implanted and cultured according to the method used in the LGSC primary culture. LGSCs could be passaged over 40 times and continuously express stem/progenitor cell markers Krt14, Krt5, P63, and nestin. LGSCs cultured in LGSCM have self-renewal capacity and can differentiate into acinar or ductal-like cells in vitro and in vivo.

The three-dimensional, serum-free culture method for adult lacrimal gland (LG) stem cells is well established for the induction of LG organoid formation and differentiation into acinar or ductal-like cells.

Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its underlying mechanisms. Therefore, we developed a mouse model of dry eye disease by surgically removing both the extraorbital lacrimal glands (ELG) and intraorbital lacrimal glands (ILG) to investigate the ocular surface pathology in the context of aqueous deficiency dry eye. Two weeks post operation, the mice exhibited severe dry eye manifestations, including reduced tear secretion, corneal epithelial irregularities, positive fluorescein sodium staining, and neovascularization. Histological examination via hematoxylin and eosin staining revealed inflammatory cell infiltration and corneal epithelium dysplasia. Immunofluorescence staining and quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction revealed decreased expression of the normal corneal epithelial biomarkers K12 and Pax6 and increased expression of Sprr1b in the corneal epithelium. These ocular manifestations indicated abnormal corneal epithelial differentiation. Furthermore, immunofluorescence staining of Ki67 revealed the increasing cell proliferation. In conclusion, the ELG plus ILG excision model proved suitable for studying changes in the ocular surface and elucidating the mechanisms underlying aqueous deficiency dry eye.

Here, we present a method to establish a mouse model of aqueous-deficient dry eye by excising the extraorbital and infraorbital lacrimal glands and evaluate the changes in the ocular surface in aqueous deficiency dry eye.

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from desiccation stress and external insults. Little is known about lacrimal gland (patho)physiology because of the lack of adequate in vitro models. Organoid technology has proven itself as a useful experimental platform for multiple organs. Here, we share a protocol to establish and maintain mouse and human lacrimal gland organoids starting from lacrimal gland biopsies. By modifying the culture conditions, we enhance lacrimal gland organoid functionality. Organoid functionality can be probed through a "crying" assay, which involves exposing the lacrimal gland organoids to selected neurotransmitters to trigger tear release in their lumen. We explain how to image and quantify this phenomenon. To investigate the role of genes of interest in lacrimal gland homeostasis, these can be genetically modified. We thoroughly describe how to genetically modify lacrimal gland organoids using base editors-from guide RNA design to organoid clone genotyping. Lastly, we show how to probe the regenerative potential of human lacrimal gland organoids by orthotopic implantation in the mouse. Together, this comprehensive toolset provides resources to use mouse and human lacrimal gland organoids to study lacrimal gland (patho)physiology.

This protocol describes how to establish, maintain, genetically modify, differentiate, functionally characterize, and transplant lacrimal gland organoids derived from primary mouse and human tissue.

Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Superior Lacrimal Gland Removal: A Surgical Technique to Remove the Palpebral and Orbital Parts of Superior Lacrimal Gland from Rabbit Model

Source: Honkanen, R. A. et al., <a href="https://www.jove.com/v/60126">Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the surgical procedure to remove the two parts: palpebral and orbital of the superior lacrimal gland from a rabbit to create a dry eye disease model. This rabbit model is suitable for studies of ocular surface homeostasis, pathophysiology and ocular therapeutics.

Extirpación de la glándula lagrimal superior: una técnica quirúrgica para extirpar las partes palpebral y orbitaria de la glándula lagrimal superior de un modelo de conejo

Source: Honkanen, R. A. et al., Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (2020).
This video ...

La manipulación de la murino Glándula Lagrimal

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Un modelo de conejo de enfermedad ocular seca acuosa-deficiente inducida por la inyección de Concanavalin A en las glándulas lagrimales: Aplicación a estudios de eficacia de fármacos

Establecimiento de un modelo de ojos secos severos mediante dacrioadenectomía completa en conejos

El aislamiento de las células mioepiteliales de la murina lagrimal adulta y las glándulas submandibulares

Un modelo de ojo seco de rata con disfunción de la glándula lagrimal inducida por escopolamina

Un modelo de ojo seco de rata con disfunción de la glándula lagrimal inducida por escopolamina

Un modelo de ojo seco de rata con disfunción de la glándula lagrimal inducida por escopolamina

Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana

Extirpación de la glándula lagrimal superior: una técnica quirúrgica para extirpar las partes palpebral y orbitaria de la glándula lagrimal superior de un modelo de conejo