Авторы хотели бы выразить признательность финансирование предусмотренных программой распределения UCSF ресурсов.

Все для животных Работа выполнена в рамках строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья. Протокол был одобрен уходу и использованию комитета за животными (IACUC) из Университета Калифорнии, Сан-Франциско. 1. мышиных эмбриональных слезных желез (LG): Сбор и микродиссекция <ol><li> После процедуры одобрены Институциональные животных в комитете Научно-исследовательский этики, усыпить приурочен беременных CD-1 (или трансгенных) самок с ростом CO 2 ингаляции с последующим подтверждением смещением шейных позвонков к эмбрионов урожая на соответствующем эмбрионального дня. Назначить день вагинального e0 открытия плагина. Примечание: слезных желез (LGS) могут быть собраны из E14 один бутон этапе и далее. Тем не менее, E16 (5 - 10 бутонов) эмбрионы дать наиболее достоверные результаты для экс естественных культуры. </li><li> Стерилизовать стЕНТРАЛЬНАЯ стороне мыши с помощью 70% этанола. Зажмите кожу и сделать надрез на средней линии с стерильных хирургических ножниц; прорезать кожу и брюшины, чтобы разоблачить брюшной полости. Удалите 2 рога матки путем разрезания вдоль mesometrium в верхней части каждого рога матки и место в холодном PBS (фосфатно-солевой буфер) или DMEM F12 среде с добавлением 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. </li><li> Использование щипцов (# 5), удалить эмбрионов из амниотической мешочков и помещают во вторую стерильную чашку Петри, содержащую холодный PBS. Будьте осторожны, чтобы не коснуться глаза или голова область. </li><li> Поместите эмбрион на вскрытии микроскопом с просвечивания основания. Если эмбрион &lt;e17, выполните шаги 1,5 - 1,7. Если эмбрионы&gt; e17, эти шаги могут быть полезны, но не являются существенными, поэтому перейдите к шагу 1.8. </li><li> Отрежьте голову от туловища чуть ниже нижней челюсти (шаг 1, рисунок 2) USINга стерильный скальпель (# 10 лезвие). Поверните голову так, чтобы нижняя челюсть находится сейчас на вскрытии пластины. Используйте пинцет, чтобы стабилизировать голову и скальпель для удаления около ¼ спинной стороне мозга (шаг 2, 1-й вырезом, Рисунок 2) - это особенно важно когда хрящ застывает вокруг e15. </li><li> Расположите головку так, что скальпель может проколоть нос между глазами. Сделайте надрез через центр головы, так что глаза сейчас на отдельных половинок (шаг 2, 2 нарезанных й, Рисунок 2). </li><li> Использование двух # 5 щипцы, взять одну половину головы и удалить лишнюю ткань (см шаг 3, рисунок 2). Будьте уверены, чтобы ориентировать голову так, LG (расположен в нижней задней углу глаза) не теряется в этом процессе удаления. Удалите излишки мозговой, хрящи и носовые ткани, окружающие и ниже глаз. Поскольку железы едва виден в этот момент, обеспечить глаз в правильной ориентации после удаления избытка ткани то не потерять расположение LG. </li><li> Осторожно захватить кожу от задней, нижней угла глаза с обеих щипцов. Снимите кожу, осторожно потянув открыт с пинцетом, чтобы разоблачить LG. Используйте дополнительное освещение выше и ниже ткани, чтобы помочь визуализировать LG. Примечание: LG, выделялся своей внешностью, как бутон на воздуховод в более темный, уплотненной мезенхимы, должны быть видны в этой точке. </li><li> Осторожно начинают рассекать LG и связанного мезенхиму (см диаграмму и изображения) от окружающих тканей с помощью щипцов, стараясь не захватить LG или связанный с ним канал. После железа от окружающей ткани свободно, осторожно удалить всю железу путем захвата эпителий, окружающие глаз у основания канала LG. Позаботьтесь, чтобы сохранить мезенхиму окружающий эпителий, который можно наблюдать в виде уплотненной мезенхимы в которых эпителий инвагинирует. ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые дополнительные удаление Tissuе (любые мелкие фрагменты костей, мышц и соединительной ткани) может быть необходимо, чтобы избежать сигнализации факторы / роста из соседних тканей. </li><li> Для культуры, урожай 4 - 5 желез и связанный мезенхимы за тарелку (ОМС высевают сразу же после вскрытия); собрать минимум 14 желез на 100 мкл буфера для лизиса РНК для ОТ-ПЦР 6. </li></ol> 2. Подготовьте Тарелки для Ex Vivo культуры Эта процедура основана на том, что используются для развивающегося слюнной железы 7,8. <ol><li> Добавить 200 мкл DMEM F12, дополненной (100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) культуральной среде с 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 50 мкг / мл трансферрина голо-к прозрачным дном диаметром 50 мм микролуночным блюдо 7. Примечание: DMEM F12 был выбран, как мы ранее обнаружили, что он максимально морфогенез в эмбриональном слюнной железы. </li><li> Поплавок 13 мм polycarbOnate мембранный фильтр с порами 0,1 мкм на верхней части массовой информации. </li><li> Дополнительный этап Развести 3-D Ламинин 1: 1 с DMEM / F12, чтобы получить конечную концентрацию 3 мг / мл (использовать 200 мкл пипетки осторожно перемешать; центрифуги в течение 1 мин, если появляются пузырьки). Добавить 15 мкл этого разбавляют 3-D ламинином фильтровать. Примечание: Это разбавление было установлено, что оптимальным для поддержания LG в своем 3D состоянии без ущерба эпителиальных разветвление. Тем не менее, это не является необходимым для культуры LG. </li><li> Поместите 4 - 5 LG на фильтре или в ламинином. Культура ОМС экс естественных для 24 - 48 часов (рисунок 3) или исправить с 4% PFA в течение 20 мин для дальнейшего анализа по кПЦР или иммуноокрашивания (рисунок 4). Для КПЦР анализа эмбрионального железистой ткани, пожалуйста, обратитесь к Rebustini др., 2011. Для иммунофлуоресцентным анализа эмбриональных железистой ткани, пожалуйста, обратитесь к следующим цитатам: Хоффман и др, (2002) и Steinberg е.т др., (2005). </li></ol> 3. Мышь Послеродовая и взрослых слезных желез (LG): Вскрытие <ol><li> Усыпить послеродовой мышь в соответствии со стандартами соответствующий комитет по этике животного. Для послеродовых щенков день 8 или более молодых, усыпить путем разделения на голову стерильными ножницами. Для послеродового день 8 лет и старше, спрей мех с 70% этанола. </li><li> Чтобы найти LG, лежал мыши боковой стороне под микроскопом рассекает с подсветкой сверху. Примечание: послеродовой и взрослых LG окаймлены сонной артерии, жевательные мышцы и дермы (рисунок 5). </li><li> Использование малых ножницы рассечение, делают небольшой разрез в эпидермисе, где в боковом направлении от LG должны быть расположены. </li><li> Использование щипцов, выдвиньте эпидермис к уху, чтобы разоблачить LG. </li><li> Используйте пинцет, чтобы аккуратно ослабьте LG от окружающей ткани. </li><li> После того, как LG освобождается от окружающих тканей, осторожно удалите LG по воздуховоду,взявшись где воздуховод и эпителий, окружающий глаз подключения (рисунок 1). </li><li> Поместите ЛГС в буфере для лизиса РНК для ОТ-ПЦР, или закрепить с 4% PFA в течение 20 мин для иммунным окрашиванием. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Универсальность культуры и манипулировать LG экс естественных обеспечивает значительные преимущества для изучения его развитие. Это включает в себя скорость, с которой исследователь способен проверять гипотезы и множество возмущений, которые могут быть выполнены, чтобы оценить,...

Слезной железы (LG) отвечает за водный секреции слезной критической для остроты зрения и здоровья, обслуживания и защиты клеток глазной поверхности. LG дисфункция приводит к одной из самых распространенных и изнурительных заболеваний глаз: болезни водный дефицит сухого глаза, который характеризуется раздражения глаз, чувствительность к свету и снижение зрения 1. В человеке LG находится в орбите выше боковой концу глаза, где 3 - 5 выводные протоки депозитные слезы на поверхности глаза. Мышь имеет три пары основных глазных желез, наиболее изученным из которых является слезной железы (LG) расположен передний и вентральный к уху (exorbital) со слезами, направляющимся в глаза через один выводной проток. Как и в других железистых органов, LG развивается через процесс эпителиального морфогенеза ветвления, в которой один эпителиальных почка в пределах уплотненной мезенхимы претерпевает несколько раундов зародыше и образование воздуховода длям сложную взаимосвязанную сеть секреторной ацинусов и протоков (рис 1) 2. В процессе разработки эпителий становится васкуляризации, а также в большой степени иннервируют парасимпатических нервов крылонебной ганглия и в меньшей степени по симпатических нервов от верхнего шейного ганглия 3. Взаимодействия между каждой из этих ячеек типа т.е. нервных, эпителиальных, эндотелиальных и мезенхимальных клеток, имеют важное значение для функционирования и поддержания взрослой ткани. Тем не менее, лежащие в основе молекулярные механизмы, координирующие развитие LG и регенерации, а также, как тип межсотовые связи направляет эти процессы, остается неясным. Появление эмбриональных Экс естественных методов культивирования позволило выявить развития и регенеративных путей в нескольких ветвящихся органов 4. Культивирование экс естественных дает исследователю возможность манипулировать орган (меняническое, генетическая или химического) при определенных условиях, а также для характеристики развития органов и межклеточных взаимодействий в реальном масштабе времени. Exorbital LG мыши является наиболее подходящей для этой техники и недавние исследования определяется систем, которые регулируют его развитие 2,5 сигнализации. Однако, несмотря на необходимость, чтобы понять молекулярные сигналы, лежащие в основе развития LG и регенерации, в настоящее время он остается недостаточно изученной, скорее всего, из-за технических трудностей в изоляции орган. В этой статье мы расскажем, как изолировать и выполнять Экс естественных культуру эмбриональных мышиных LG определить программ развития.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Name</td>
			<td style="width:129px;">Catalog #.</td>
			<td style="width:213px;">Company</td>
			<td style="width:997px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 without HEPES</td>
			<td>SH3027101</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin solution from bovine serum</td>
			<td>A9576</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% Solution</td>
			<td>15710</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Diluted to 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from 10X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">holo-Transferrin bovine</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">L- Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>130182</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Microscope with substage iluminator</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td rowspan="2">Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td>
			<td>TLB 4000</td>
			<td>Diagnostics Instruments, Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>353001</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mm uncoated glass bottom dishes</td>
			<td>P50G-1.5-14-F</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:213px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached 
			digital camera.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td style="width:213px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Integra LifeSciences Corporation</td>
			<td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td>
			<td>4-30</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td>
			<td>4-310</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td>
			<td>3446-005-01</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td>
			<td></td>
			<td style="width:213px;">Charles River Labs</td>
			<td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm</td>
			<td>110405</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice</td>
			<td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating the murine lacrimal gland

Слезной железы (LG) выделяет водные слезы, необходимые для поддержания структуры и функции роговицы, прозрачного ткани необходим для зрения. В человеке один LG находится в орбите над боковой конце каждого глаза доставки слезы на поверхности глаза через 3 - 5 каналов. Мышь имеет три пары основных глазных желез, наиболее изученным из которых является exorbital слезной железы (LG) расположен передний и вентральный к уху. Как и в других железистых органов, LG развивается через процесс эпителиального морфогенеза ветвления, в которой один эпителиальных почка в пределах уплотненной мезенхимы претерпевает несколько раундов зародыше и формирования канала, чтобы сформировать сложную взаимосвязанную сеть секреторной ацинусов и протоков. Это сложный процесс, были хорошо документированы во многих других эпителиальных органов, таких как поджелудочная железа и слюнной железы. Тем не менее, LG была гораздо менее изучены и механизмы, контролирующие морфогенез плохо подстоял. Мы подозреваем, что это недостаточная представленность в качестве модельной системы является следствием трудностей, связанных с поиском, рассекая и культивирование LG. Таким образом, здесь мы опишем методы рассечение для уборки эмбрионального и послеродового LG и методы для экс естественных культуры ткани.

LG разрабатывает в процессе эпителиального морфогенеза ветвления. Светлое образы эмбриональных МСУ расчлененный на e14, e15, e16, e17, и Р2 иллюстрируют это событие. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> Рисунок 1. LG разрабаты...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Слезной железы (LG) представляет собой ветвящийся орган, который производит водные компоненты слез, необходимых для поддержания зрение и глазное здоровье. Здесь мы опишем мышиный LG рассечение и Экс естественных методов культуры расшифровать путей, вовлеченных в развитие LG сигнализации.

Манипулируя мышиной слезной железы

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  University of California San Francisco.  Слезной железы (LG) представляет собой ветвящийся орган, который производит водные компоненты слез, необходимых для поддержания зрение и глазное здоровье. Здесь мы опишем мышиный LG рассечение и Экс естественных методов культуры расшифровать путей, вовле...

Video: Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from development to malignant transformation.&nbsp; In particular, interaction with neighboring stroma has been implicated in a plethora of biological phenomena; however, conventional techniques limit the ability to interrogate the spatial and dynamic elements of such interactions.
In Micromechanical Reconfigurable Culture (RC), we employ a micromachined silicon substrate with moving parts to dynamically control cell-cell interactions through mechanical repositioning. Previously, this method has been applied to investigate intercellular communication in co-cultures of hepatocytes and non-parenchymal cells, demonstrating time-dependent interactions and a limited range for soluble signaling 1.
Here, we describe in detail the preparation and use of the RC system. We begin by demonstrating the handling of the device parts using tweezers, including actuating between the gap and contact configurations (cell populations separated by a narrow 80-&micro;m gap, or in direct intimate contact). Next, we detail the process of preparing the substrates for culture, and the multi-step cell seeding process required for obtaining confluent cell monolayers. Using live microscopy, we then illustrate real-time manipulation of cells between the different possible experimental configurations. Finally, we demonstrate the steps required in order to regenerate the device surface for reuse: toluene and piranha cleaning, polystyrene coating, and oxygen plasma treatment.

This article describes an experimental approach for dynamic regulation of cell-cell interactions between adherent cells on a micrometer scale. Manipulation of intercellular communication between hepatocytes and stromal cell is demonstrated. The developed platform enables investigation of cell-cell interactions in a variety of biological processes, including development and pathogenesis.

Кремний Микрочипы для манипулирования межклеточных Взаимодействие

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

Использование лазерный пинцет для манипуляций Изолированные нейроны In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Мышей почечная Процедура трансплантации

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Оценка молочной железы развития и функции в моделях мыши

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Внутрипротоковый впрыска для локализованной доставки лекарств к молочной железы мыши

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Непрямой иммунофлюоресценции на замороженные Разделы молочной железы мыши

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Выделение мышиной коронарных сосудов клетках гладкой мускулатуры

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.