Die Autoren bedanken sich bei Förderung durch die UCSF Ressourcenzuordnung Programm vorgesehen anzuerkennen.

Alle Tier Arbeit wurde unter strenger Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of California, San Francisco genehmigt. 1. embryonalen Maus-Tränendrüsen (LG): Ernten und Mikrodissektion <ol><li> Folgenden Verfahren durch die Institutional Tiere für wissenschaftliche Forschung Ethik-Kommission genehmigt, einschläfern timed schwanger CD-1 (oder transgene) Weibchen mit steigenden CO 2 Inhalation, gefolgt von der Bestätigung durch Genickbruch zu ernten Embryonen auf den entsprechenden embryonalen Tag. Bestimmen Sie den Tag der Vaginalpfropf Entdeckung e0. Hinweis: Tränendrüsen (LGs) aus dem e14 einzelnen Knospenstadium ab geerntet werden. Allerdings e16 - geben (5 10 Knospen) Embryonen die konsequentesten Ergebnisse für die ex vivo Kultur. </li><li> Sterilisieren Sie die ventral Seite der Maus unter Verwendung von 70% Ethanol. Pinch die Haut und machen einen Einschnitt an der Mittellinie mit sterilen chirurgischen Schere; schneiden durch die Haut und Bauchfell, die Bauchhöhle aus. Die 2 Uterushörner durch Schneiden entlang der Mesometrium an der Oberseite jedes Uterushorn und in kaltem PBS (Phosphate Buffered Saline) oder DMEM F12-Medium mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt. </li><li> Mit einer Pinzette (# 5), zu entfernen Embryonen aus den Fruchtblasen und in einen zweiten sterilen Petrischale mit kaltem PBS. Seien Sie vorsichtig, um die Augen oder Kopfbereich nicht berühren. </li><li> Zeigen Embryo auf einem Binokular mit einer Durchleuchtung Basis. Wenn der Embryo &lt;e17, führen Sie die Schritte 1,5-1,7. Wenn Embryonen&gt; e17, diese Schritte können hilfreich sein, sind aber nicht unbedingt erforderlich, daher gehen Sie zu Schritt 1.8. </li><li> Sever den Kopf vom Rumpf knapp unter dem Unterkiefer (Schritt 1, Abbildung 2) Usinga sterilen Skalpell (# 10 Klinge). Drehen Sie den Kopf, so dass der Unterkiefer ist jetzt auf dem Seziertisch Platte. Verwenden einer Pinzette, um den Kopf und ein Skalpell, um etwa ¼ der dorsalen Seite des Gehirns (Schritt 2, 1. Schnitt, Abbildung 2) zu entfernen stabilisieren - dies ist besonders wichtig, wenn Knorpel versteift rund e15. </li><li> Richten Sie den Kopf, so dass das Skalpell kann die Nase zwischen den Augen durchbohren. Machen Sie einen Schnitt durch die Mitte des Kopfes, so dass die Augen sind jetzt auf getrennten Hälften (Schritt 2, 2. Schnitt, Abbildung 2). </li><li> Mit Hilfe von zwei # 5 Zangen, nehmen Sie eine Hälfte des Kopfes und entfernen überschüssiges Gewebe (siehe Schritt 3, Abbildung 2). Achten Sie darauf, den Kopf so zu orientieren, das LG (in der unteren hinteren Ecke des Auges befindet) wird in diesem Entfernungsprozess verloren. Entfernen überschüssigen zerebralen, Knorpel und Nasengewebe umgibt und unter dem Auge. Da die Verschraubung an dieser Stelle kaum sichtbar, sicherzustellen, ist das Auge nach dem überschüssigen Gewebeentfernung t richtig orientierto nicht zu verlieren die Lage des LG. </li><li> Vorsichtig greifen die Haut von der hinteren, unteren Ecke des Auges mit beiden Zangen. Entfernen Sie die Haut vorsichtig abziehen offen mit der Pinzette, um die LG aussetzen. Verwenden Sie zusätzliche Beleuchtung oberhalb und unterhalb des Gewebes zu helfen visualisieren die LG. Hinweis: Das LG, unterscheidbar durch sein Aussehen als Knospe auf einem Kanal in einen dunkleren, Kondensmilch Mesenchym, sichtbar an dieser Stelle. </li><li> Vorsichtig beginnen zu LG und zugehörige Mesenchym (siehe Diagramm und Bilder) aus dem umgebenden Gewebe mit einer Pinzette, wobei Sie darauf achten das LG oder den angeschlossenen Kanal nicht zu greifen sezieren. Sobald die Drüse ist frei von dem umgebenden Gewebe, entfernen Sie vorsichtig die gesamte Drüse durch Ergreifen des Epithelien um die Augen an der Basis des LG Kanal. Achten Sie auf die umgebende Mesenchym das Epithel, das als kondensiertes Mesenchym in welche die Epithel stülpt beobachtet werden kann erhalten. HINWEIS: Einige zusätzliche Entfernung von tissue (jedoch kleine Knochenfragmente, Muskeln und Bindegewebe) kann notwendig sein, um zu vermeiden, Signalisierung / Wachstumsfaktoren aus dem benachbarten Gewebe. </li><li> Für Kultur, Ernte 4-5 Drüsen und die damit verbundenen Mesenchym pro Platte (LGs sind sofort nach Dissektion plattiert); Sammeln mindestens 14 Drüsen pro 100 &amp; mgr; l RNA-Lysepuffer für RT-PCR 6. </li></ol> 2. Bereiten Teller für Ex-vivo-Kultur Dieses Verfahren wird auf die für die Entwicklung von Speicheldrüsen 7,8, bezogen. <ol><li> Mit 200 &amp; mgr; l DMEM F12 Kulturmedium mit 50 &amp; mgr; g / ml Ascorbinsäure und 50 &amp; mgr; g / ml holo-Transferrin mit einem Glasboden-Mikrotiterplatten mit 50 mm Durchmesser Teller 7 (mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin). Hinweis: DMEM F12 wurde gewählt, da wir zuvor fand es Morphogenese in der embryonalen Speicheldrüse zu maximieren. </li><li> Float eine 13 mm PolycarbOnate Membranfilter mit 0,1 um Poren auf der Oberseite der Medien. </li><li> Optionaler Schritt: Verdünnen 3-D Laminin 1: 1 mit DMEM / F12, um eine Endkonzentration von 3 mg / ml zu (verwenden Sie 200 ul Pipette vorsichtig mischen; Zentrifuge für 1 min, wenn Blasenbildung). Werden 15 &amp; mgr; l dieser verdünnten 3-D Laminin zu filtern. Hinweis: Diese Verdünnung wurde als optimal für die Aufrechterhaltung der LG in seiner 3D-Zustand ohne Kompromisse epithelialen Verzweigung zu sein. Es ist jedoch nicht wesentlich für die Kultur von LG. </li><li> Zeigen 4-5 LG auf Filter oder in Laminin. Kultur LGs ex vivo für 24 - 48 h (Figur 3) oder fix mit 4% PFA für 20 min für eine weitere Analyse durch qPCR oder Immunfärbung (Abbildung 4). Für qPCR Analyse der embryonalen Drüsengewebe entnehmen Sie bitte Rebustini et al beziehen. 2011. Für Immunfluoreszenz-Analyse der embryonalen Drüsengewebe entnehmen Sie bitte den folgenden Zitaten: Hoffman et al, (2002) und Steinberg e.t al., (2005). </li></ol> 3. Maus Postnatale und Erwachsenentränendrüsen (LG): Dissection <ol><li> Euthanize der postnatalen Maus nach Normen geeigneten Tierethikausschuss. Für die postnatale Welpen Tag 8 oder jünger, einschläfern durch Abtrennen des Kopfes mit einer sterilen Schere. Für postnatalen Tag 8 oder älter, Spray Fell mit 70% Ethanol. </li><li> Um die LG zu finden, lag der Maus seitlich von oben Seite nach oben unter einem Binokular mit Beleuchtung. Hinweis: Die postnatale und Erwachsenen LG werden durch die Halsschlagader, M. masseter und der Dermis (siehe Abbildung 5) begrenzt. </li><li> Mit kleinen Dissektion Schere, machen kleinen Einschnitt in der Epidermis seitlich von dem die LG befinden soll. </li><li> Mit einer Pinzette, öffnen Sie die Epidermis in Richtung Ohr, um den LG aussetzen. </li><li> Verwenden einer Pinzette vorsichtig lockern LG vom umgebenden Gewebe. </li><li> Sobald das LG wird vom umgebenden Gewebe freigesetzt wird, entfernen Sie vorsichtig das LG durch den Kanal,durch Ergreifen wobei der Kanal und die Epithelien Umgebung des Auges zu verbinden (Figur 1). </li><li> Platzieren LGS RNA Lysepuffer für RT-PCR, oder fix mit 4% PFA für 20 min zur Immunfärbung. </li></ol>

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	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Vielseitigkeit der Kultur und manipulieren das LG ex vivo bietet erhebliche Vorteile für das Studium ihrer Entwicklung. Dies schließt die Geschwindigkeit, mit der sich der Forscher in der Lage, Hypothesen und die Vielzahl von Störungen, die ausgeführt ist, um zu beurteilen, wie Epithelzellen, neuronale, Endothel- und mesencyhmal Zellen interagieren, um das Organ zu bilden, zu testen. Es gibt jedoch eine Reihe von Einschränkungen bei der Nutzung dieses Modell. Erstens durch seine Isolierung die Drüse n...

Die Tränendrüse (LG) ist für wässrige Tränensekretion kritisch für die Sehschärfe und die Gesundheit, Pflege und zum Schutz der Zellen der Augenoberfläche verantwortlich. LG Dysfunktion führt zu einer der häufigsten und schwächenden Augenerkrankungen: wässrige mangel Trockenen Auges, die durch Augenreizung, Lichtempfindlichkeit auszeichnet und verminderte Sicht ein. Im menschlichen LG liegt in der Umlaufbahn über dem seitlichen Ende des Auges in dem 3 - 5 Werkausführungsgänge Ablagerung Tränen auf der Augenoberfläche. Die Maus verfügt über drei Paare von großen Augendrüsen, die am meisten untersuchte, von denen ist die Tränendrüse (LG) befindet vorderen und ventralen zum Ohr (exorbital) mit Tränen über einen einzigen Ausführungsgang Reisen in das Auge. Ähnlich wie bei anderen Drüsenorgane entwickelt das LG durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese bei dem eine einzelne epitheliale Knospe innerhalb eines kondensierten Mesenchym erfährt mehrere Runden von Knospe und Kanalbildung fürm eine komplizierte Verbundnetz von sekretorischen Acini und Leitungen (1) 2. Während der Entwicklung des Epithels vaskularisiert sowie stark von den parasympathischen Nerven des Ganglion pterygopalatinum und in geringerem Maße von der überlegenen zervikalen Ganglion 3 innerviert durch sympathische Nerven. Wechselwirkungen zwischen jedem dieser Zelltypen, dh neuronale, Epithelzellen, Endothelzellen und mesenchymalen Zellen, sind für die Funktion und Wartung der adulten Geweben. Allerdings bleibt die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen koordiniere LG Entwicklung und Regeneration und wie Inter-Zellen-Typ-Kommunikation führt diese Prozesse unklar. Das Aufkommen von embryonalen ex vivo Kulturtechniken hat die Identifizierung von Entwicklungs- und Regenerationswege in mehreren verzweigenden Organe 4 erlaubt. Züchten ex vivo gibt dem Forscher die Möglichkeit, die Orgel mich zu manipulieren (mechanisch, genetische oder chemische) unter definierten Bedingungen sowie die Organentwicklung und Zell-Zell-Wechselwirkungen in Echtzeit zu charakterisieren. Die exorbital LG der Maus ist sehr gut für diese Technik und neuere Studien haben festgelegt, Signalsysteme, die ihre Entwicklung 2,5 regulieren. Doch trotz der Notwendigkeit, Signalstoffe zugrunde LG Entwicklung und Regeneration zu verstehen, momentan bleibt wenig erforschten, wahrscheinlich aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Isolierung des Organs. In diesem Beitrag beschreiben wir, wie zu isolieren und zu führen ex vivo Kultur von embryonalen Maus-LG zu Entwicklungsprogramme definieren.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 without HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>P0781</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Albumin solution from bovine serum</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% Solution</td><td>15710</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Diluted to 4% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1x</td><td></td><td></td><td>Prepared from 10x stock</td></tr><tr><td>holo-Transferrin bovine</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid (Vitamin C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>Stereo Microscope with substage iluminator</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td></tr><tr><td>Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35&amp;nbsp;mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>50 mm uncoated glass bottom dishes</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Widefield fluorescence microscope</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td></tr><tr><td>SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2&amp;nbsp;cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td></tr><tr><td>Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11&amp;nbsp;cm)</td><td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td><td>Ideal for harvesting glands from embryos.</td></tr><tr><td>Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td><td></td><td>Charles River Labs</td><td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1&amp;nbsp;&amp;mu;m pore size, 13&amp;nbsp;mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td></tr></tbody></table>

manipulating the murine lacrimal gland

Die Tränendrüse (LG) sezerniert wäßrigen Tränen zur Aufrechterhaltung von Struktur und Funktion der Hornhaut, ein transparentes Gewebe wichtig für das Sehvermögen erforderlich. Im menschlichen einen einzigen LG liegt in der Umlaufbahn über dem seitlichen Ende eines jeden Auges liefern Tränen auf die Augenoberfläche über 3 - 5 Werkkanäle. Die Maus verfügt über drei Paare von großen Augendrüsen, die am meisten untersuchte, von denen ist die exorbital Tränendrüse (LG) befindet vorderen und ventralen an das Ohr. Ähnlich wie bei anderen Drüsenorgane entwickelt das LG durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese bei dem eine einzelne epitheliale Knospe innerhalb eines kondensierten Mesenchym erfährt mehrere Runden von Knospe und Kanalbildung, um eine komplizierte Verbundnetz von sekretorischen Acini und Kanäle bilden. Diese aufwendigen Verfahren wurde auch in vielen anderen epithelialen Organen wie der Bauchspeicheldrüse und der Speicheldrüse dokumentiert. Allerdings hat das LG viel weniger erforscht und die Mechanismen, die Morphogenese sind schlecht unterstand. Wir vermuten, dass diese Unterrepräsentanz als Modellsystem ist eine Folge der Schwierigkeiten bei der Suche, Präparieren und Kultivieren der LG verbunden. So beschreiben wir Dissektion Techniken für die Ernte embryonalen und postnatalen LG und Methoden für die ex vivo Kultur des Gewebes.

Das LG entwickelt sich durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese. Hell Bilder embryonaler LGs bei e14, e15, e16, e17 und P2 seziert illustrieren diese Veranstaltung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Das LG entwickelt sich durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese. Hell Bilder embryonaler LGs frisch bei e14, e15...

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Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Die Tränendrüse (LG) ist ein Verzweigungs Organ, das die wässrigen Bestandteile der Tränen notwendig für die Aufrechterhaltung der Vision und Augengesundheit produziert. Hier beschreiben wir murine LG Dissektion und ex vivo Kulturtechniken zu entziffern Signalwege in LG Entwicklung beteiligt.

Manipulation der Murine Lakrimal

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Aufrufe.  University of California San Francisco.  Die Tränendrüse (LG) ist ein Verzweigungs Organ, das die wässrigen Bestandteile der Tränen notwendig für die Aufrechterhaltung der Vision und Augengesundheit produziert. Hier beschreiben wir murine LG Dissektion und ex vivo Kulturtechniken zu entziffern Signalwege in LG Entwicklung beteiligt. 

Serie: Manipulating the Murine Lacrimal Gland

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Dlands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

Forschung

Medizin

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Etablierung eines schweren Trockenauges modell mit vollständiger Dakryoadenektomie bei Kaninchen

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Isolierung von myepithelialen Zellen aus der Urmorine, Lacrimal und Submandibular Drüsen

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Biologie

Scopolamin-induzierte Tränendrüsenfunktionsstörung bei Ratten

A Rat Dry Eye Model with Lacrimal Gland Dysfunction Induced by Scopolamine

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal tear production can lead to a disturbance in the ocular surface environment, including corneal damage and inflammation. In severe cases, ADDE can cause vision loss or even blindness. Currently, dry eye treatment is limited to eye drops or physical therapy, which can only alleviate eye discomfort symptoms and cannot fundamentally cure dry eye syndrome. To restore the function of the lacrimal gland in dry eye, we have created an animal model of lacrimal gland dysfunction in rats induced by scopolamine. Through the comprehensive evaluation of the lacrimal gland, corneas, conjunctivas, and other factors, we aim to provide a full understanding of the pathological changes of ADDE. Compared with the current dry eye mouse model, this ADDE animal model includes a functional evaluation of the lacrimal gland, providing a better platform for studying lacrimal gland dysfunction in ADDE.

Autor im Rampenlicht: Herausforderungen bei der Entwicklung von Tiermodellen für das trockene Auge und zukünftige Forschungsrichtungen

Here, we establish a rat model of lacrimal gland dysfunction to provide a basis for the study of aqueous-deficient dry eye.

Ein Rattenmodell für trockenes Auge mit durch Scopolamin induzierter Funktionsstörung der Tränendrüse

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture method to obtain a sufficient number of LG stem cells (LGSCs) is one obstacle for further research and application. The three-dimensional (3D), serum-free culture method for adult mouse LGSCs is well established and shown here. The LGSCs could be continuously passaged and induced to differentiate to acinar or ductal-like cells.
For the LGSC primary culture, the LGs from 6-8-week-old mice were digested with dispase, collagenase I, and trypsin-EDTA. A total of 1 &#215; 104 single cells were seeded into 80 &#181;L of matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in each well of a 24-well plate, precoated with 20 &#181;L of matrix gel-LGSCM matrix. The mix was solidified after incubation for 20 min at 37 &#176;C, and 600 &#181;L of LGSCM added.
For LGSC maintenance, LGSCs cultured for 7 days were disaggregated into single cells by dispase and trypsin-EDTA. The single cells were implanted and cultured according to the method used in the LGSC primary culture. LGSCs could be passaged over 40 times and continuously express stem/progenitor cell markers Krt14, Krt5, P63, and nestin. LGSCs cultured in LGSCM have self-renewal capacity and can differentiate into acinar or ductal-like cells in vitro and in vivo.

The three-dimensional, serum-free culture method for adult lacrimal gland (LG) stem cells is well established for the induction of LG organoid formation and differentiation into acinar or ductal-like cells.

Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its underlying mechanisms. Therefore, we developed a mouse model of dry eye disease by surgically removing both the extraorbital lacrimal glands (ELG) and intraorbital lacrimal glands (ILG) to investigate the ocular surface pathology in the context of aqueous deficiency dry eye. Two weeks post operation, the mice exhibited severe dry eye manifestations, including reduced tear secretion, corneal epithelial irregularities, positive fluorescein sodium staining, and neovascularization. Histological examination via hematoxylin and eosin staining revealed inflammatory cell infiltration and corneal epithelium dysplasia. Immunofluorescence staining and quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction revealed decreased expression of the normal corneal epithelial biomarkers K12 and Pax6 and increased expression of Sprr1b in the corneal epithelium. These ocular manifestations indicated abnormal corneal epithelial differentiation. Furthermore, immunofluorescence staining of Ki67 revealed the increasing cell proliferation. In conclusion, the ELG plus ILG excision model proved suitable for studying changes in the ocular surface and elucidating the mechanisms underlying aqueous deficiency dry eye.

Here, we present a method to establish a mouse model of aqueous-deficient dry eye by excising the extraorbital and infraorbital lacrimal glands and evaluate the changes in the ocular surface in aqueous deficiency dry eye.

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from desiccation stress and external insults. Little is known about lacrimal gland (patho)physiology because of the lack of adequate in vitro models. Organoid technology has proven itself as a useful experimental platform for multiple organs. Here, we share a protocol to establish and maintain mouse and human lacrimal gland organoids starting from lacrimal gland biopsies. By modifying the culture conditions, we enhance lacrimal gland organoid functionality. Organoid functionality can be probed through a "crying" assay, which involves exposing the lacrimal gland organoids to selected neurotransmitters to trigger tear release in their lumen. We explain how to image and quantify this phenomenon. To investigate the role of genes of interest in lacrimal gland homeostasis, these can be genetically modified. We thoroughly describe how to genetically modify lacrimal gland organoids using base editors-from guide RNA design to organoid clone genotyping. Lastly, we show how to probe the regenerative potential of human lacrimal gland organoids by orthotopic implantation in the mouse. Together, this comprehensive toolset provides resources to use mouse and human lacrimal gland organoids to study lacrimal gland (patho)physiology.

This protocol describes how to establish, maintain, genetically modify, differentiate, functionally characterize, and transplant lacrimal gland organoids derived from primary mouse and human tissue.

Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Superior Lacrimal Gland Removal: A Surgical Technique to Remove the Palpebral and Orbital Parts of Superior Lacrimal Gland from Rabbit Model

Source: Honkanen, R. A. et al., <a href="https://www.jove.com/v/60126">Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the surgical procedure to remove the two parts: palpebral and orbital of the superior lacrimal gland from a rabbit to create a dry eye disease model. This rabbit model is suitable for studies of ocular surface homeostasis, pathophysiology and ocular therapeutics.

Entfernung der oberen Tränendrüse: Eine chirurgische Technik zur Entfernung der palpebralen und orbitalen Teile der oberen Tränendrüse aus einem Kaninchenmodell

Source: Honkanen, R. A. et al., Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (2020).
This video ...

Manipulation der Murine Lakrimal

Zusammenfassung

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A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Dlands: Application to Drug Efficacy Studies

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Ein Rattenmodell für trockenes Auge mit durch Scopolamin induzierter Funktionsstörung der Tränendrüse

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