We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).

1. Culture cellulaire <ol><li> Transformer des cellules de levure auxotrophes appropriés, tels que Try467 (tableau 2), avec un plasmide contenant (a) un URA3 -degron fusion et (b) un marqueur métabolique supplémentaire pour la sélection de plasmide et d&#39;entretien. REMARQUE: Un exemple d&#39;un plasmide approprié est YDpK-MET25p-DEG1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Ceci est un plasmide intégratif de levure contenant une protéine de fusion comprenant de DEG1 - un degron dérivé de la transcription de levure. mat2 facteur 17, épitope FLAG - pour la détection par immuno-empreinte, Vma12 - une protéine ER stables, et Ura3 15,18 (figure 3A). (Voir le tableau 3 pour les plasmides utilisés dans cette étude et pour d&#39;autres exemples de plasmides appropriés.) </li><li> Pour la sélection du plasmide et la maintenance, conserver les cellules dans des plaques d&#39;agar sous un synthétique appropriée (SD) définis milieu dépourvu de marqueurs de sélection d&#39;acides aminés <sjusqu&#39;à&gt; 19 (Par exemple, DEG1-UV est choisi et maintenu sous SD-LYS milieu sélectif). </li><li> Cultiver les cellules O / N à 30 ° C dans un milieu sélectif SD approprié pour le maintien du plasmide jusqu&#39;à ce que la phase stationnaire est atteinte. Cultiver les cellules dans des tubes à essai ou dans une plaque à 96 puits, en fonction du nombre d&#39;échantillons à analyser (section 2). </li></ol> 2. Préparation des cellules pour l&#39;analyse <ol><li> Quand un petit nombre d&#39;échantillons (N≤15) sont à doser, de diluer les cellules et remplacer le milieu comme suit: <ol><li> Diluer 50 pi de cellules à partir d&#39;une culture O / N avec 150 pi de milieu SD par puits dans une plaque de 96 puits (fond clair). A noter, le premier échantillon est désigné comme milieu ne contient vide. </li><li> Déterminer les OD 600 valeurs des échantillons dans la plaque de 96 puits en utilisant un lecteur de microplaques. </li><li> Calculer le diamètre extérieur réel 600 dans chaque puits en multipliant la lecture DO 600 par le facteur de dilution (x4), à partir de which la valeur de la lecture à blanc est soustraite. Normaliser les valeurs obtenues en divisant par 0,55 pour obtenir une longueur de trajet de 1 cm calculée selon la loi de Beer-Lambert. Notez que cette valeur est constante en mesurant la DO600 de 200 ul de cellules dans une plaque à 96 puits standard. </li><li> Calculer le volume exact nécessaire à l&#39;obtention des cellules de levure à un montant équivalent à DO600 de 0,25 et le transférer dans un tube Eppendorf. </li><li> Isoler les cellules à grande vitesse (12 000 xg) pendant 1 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu sélectif approprié (voir la section 3.1) pour obtenir DO600 de 0,25. </li><li> Transférer 200 ul des souches dilué à un nouveau puits dans une plaque de 96 puits. </li></ol></li><li> Quand un grand nombre d&#39;échantillons (N&gt; 15) sont à tester, diluer les cellules et remplacer le milieu sans préalable mesure OD 600, comme suit: <ol><li> Transférer 10 ul de cellules stationnairesadulte O / N dans une plaque de 96 puits dans une nouvelle plaque de 96 puits contenant 190 pi (dilution 1:20) des milieux sélectifs appropriés (voir section 3.1). </li></ol></li></ol> 3. cinétique de croissance en culture liquide dans des conditions sélectives (Gils) <ol><li> Les supports suivants sont pour des mesures de croissance à l&#39;aide de la journaliste Ura3-degron: <ol><li> Pour les contrôles positifs de la croissance de la levure dans des conditions non restrictives, utilisation plasmide médias SD sélectif (voir section 1.2). Si aucune sélection de plasmide est requise, par exemple, lors de l&#39;utilisation d&#39;un plasmide intégratif comme DEG1 -UV, milieu SD contenant tous les acides aminés nécessaires (SD complète) peut être utilisé. </li><li> Pour les échantillons expérimentaux mesure de la croissance dans des conditions restrictives, utilisez milieu SD-URA. </li></ol></li><li> Fixer un lecteur de microplaques multimode à:. Une température d&#39;incubation de 30 ° C, OD 600 intervalles de mesure de 15 min, et un cycle d&#39;orbite linéaire et agitation de 1 minute toutes les sept minutes &lt;br /&gt; NOTE: Ce double mode secousse a été optimisé pour obtenir une répartition homogène de cellules; Cependant, d&#39;autres modes de secouer ou même sans agitation peuvent fonctionner aussi bien. </li><li> Incuber les cellules à 30 ° C dans un lecteur de microplaques O / N ou jusqu&#39;à ce que les cellules ont atteint la phase stationnaire (12 à 24 h). </li><li> Exporter les données brutes dans un fichier tableur. </li><li> Déterminer la cinétique de croissance de levure en utilisant MDTcalc, un logiciel personnalisé qui calcule le temps minimum (en h) pour les cellules de doubler la taille de leur population (Minimal Doublement du temps (MDT); pour plus de détails, voir la section 4). </li></ol> 4. Calcul de Minimal temps de doublement (MDT): Principes de l&#39;algorithme MDTcalc NOTE: Les principes de l&#39;algorithme MDTcalc, en utilisant un échantillon représentatif de cellules de levure Try467 (tableau 2) cultivées dans des milieux complets SD, sont illustrés dans le Tableau 1 et la Figure 1, montrant une feuille de données et de croissance parcelles, respecment. <ol><li> Soustraire OD 600 valeurs à blanc, obtenu dans le puits respectif, à partir de chacune des valeurs obtenues dans le puits d&#39;échantillon. Diviser les différences résultant par 0,55 (pour des plaques à 96 puits) pour corriger la longueur du trajet de la lumière. Tracer les valeurs finales (tableau 1, Trans.) Contre le temps pour produire la courbe de croissance de la levure réelle (DO600 / h) (figure 1A). </li><li> Calculer log 2 (OD 600) pour chacune des valeurs transformées pour convertir la phase de croissance logarithmique dans une courbe linéaire (figure 1B). </li><li> Calculer la pente d&#39;un intervalle de 10 points dans le temps (N = 10) à partir de l&#39;instant 0 et déplacement d&#39;un point dans le temps à la fois jusqu&#39;à ce que N &lt;10 (tableau 1, la pente, la figure 1C). </li><li> Calculer la valeur inverse de la pente de chaque obtenir le temps nécessaire pour que la population de cellules de doubler (tableau 1, 1 / pente, la figure 1C). Calculer le minimum1 / valeur de la pente pour déterminer le MDT (tableau 1, rectangle noir; figure 1C). Extrait MDT calculé pour les cellules de l&#39;échantillon (tableau 1, 1 / pente, rectangle noir) de l&#39;intervalle de temps choisi (tableau 1, délimitée par le rectangle rouge, les figures 1B, 1D). NOTE: Le taux de croissance des cellules sur milieu SD-URA est inversement proportionnelle à la MDT. </li></ol> 5. Utilisation MDTcalc <ol><li> Copiez les fichiers du programme complété dans un dossier désigné sur l&#39;ordinateur. </li><li> Assurez-vous que le fichier de feuille de calcul contenant les données de croissance est enregistré et fermé. Ouvrez le programme d&#39;application MDTcalc pour voir le début apparaît. <ol><li> Insérez les informations nécessaires, comme le montre la figure 2: <ol><li> Sous &quot;Chemin du fichier&quot;, cliquez sur le rectangle sur la droite pour localiser le fichier de feuille de calcul. </li><li> Sous &quot;Nom de la feuille», écrire le nom de la feuille de calcul où til est situé données brutes. </li><li> Sous la rubrique «Position de départ», insérer la feuille de calcul de coordonnées de temps 0 du premier échantillon. </li><li> Sous «colonne Time», insérer la lettre définissant l&#39;emplacement de la colonne de point de temps (temps devrait être fournie en secondes). </li><li> Sous «colonne vide», insérer la lettre définissant l&#39;emplacement de la colonne vide (généralement, mais pas nécessairement dans le puits A1 de la plaque de 96 puits). </li><li> Sous «valeur de DO &#39;, choisissez l&#39;transformé DO600 valeur minimale requise pour l&#39;initiation de calcul MDT (généralement 0,15-0,25). La définition de cette valeur empêche les calculs de la PCT pour les cultures en phase de latence due à une dilution excessive de sorte que la PCT est calculée uniquement pour les échantillons qui atteignent la valeur DO 600 ou plus défini. </li></ol></li><li> Une fois la dernière valeur a été saisi, appuyez sur le bouton &#39;Calculer&#39; au bas de l&#39;écran. Assurez-vous que la barre de progression sur la droite se transforme progressivement en green. Ne pas ouvrir le fichier de feuille de calcul au cours du processus de calcul. </li><li> Exportez les deux ensembles de données qui apparaissent automatiquement à l&#39;écran à la fin du calcul MDT dans un tableur. Veiller à ce que les données comprennent: (a) la valeur MDT pour chaque bien qui passe le test de valeur de DO minimal (tel que défini à la section 5.2.1.6) et (b) le point de temps initial de l&#39;intervalle à partir de laquelle le PCT a été calculé (Démarrer temps). </li></ol></li></ol>

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S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation.">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li><li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein.">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nous décrivons ici un essai basé sur la croissance des cellules pour déterminer le taux relatif de dégradation des protéines, appelée «cinétique de croissance en culture liquide dans des conditions sélectives de (Gils). Le test Gils a plusieurs avantages: Il est simple à mettre en place, l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données est simple et il est extrêmement modulaire. Par conséquent, Gils peut être appliquée simultanément à plusieurs échantillons dans un format de plaque conviviale multi-puits...

Le système de dégradation ubiquitine-protéasome est un appareil de régulation principal, qui a été impliquée dans le maintien de l&#39;homéostasie des protéines dans tous les eucaryotes. L&#39;onduleur conjugue initialement plusieurs molécules d&#39;ubiquitine à une protéine cible, après quoi la protéine de poly-ubiquitine marqué est dégradée par le protéasome 26S. Dans la plupart des cas, le taux étape pour l&#39;ubiquitine médiation dégradation limitant est ubiquitylation substrat, médiée par la conjugaison d&#39;enzymes E2 et E3 ligature enzymes (E3 ligases) 1. Par conséquent, la stabilité intracellulaire de protéines spécifiques reflète leur sensibilité à la conjugaison à l&#39;ubiquitine et l&#39;activité de leurs enzymes ubiquitylation apparentées. Ligases E3 sont les principaux composants de reconnaissance de substrat de l&#39;onduleur. En tant que tels, ces enzymes reconnaissent degrons au sein de leurs substrats qui sont absents ou ne sont pas exposés à leurs isotopes stables 2. Par exemple, de nombreux régulateurs du cycle cellulaire must être synthétisé et dégradé de façon spécifique dans le temps afin de maintenir la progression du cycle cellulaire dans l&#39;ordre. La dégradation de ces protéines est souvent contrôlée par la phosphorylation médiée par les kinases régulées de signalisation cellulaire 3,4. D&#39;autre part, les protéines aberrante-croisés sont reconnus par degrons cryptiques. Ce sont des régions qui sont normalement cachés dans la structure native et sont exposés à la structure perturbation. Ces degrons comprennent des domaines hydrophobes et 5-7 segments intrinsèquement désordonnées 8. Depuis la découverte de la charnière, le système de l&#39;ubiquitine de la dégradation des protéines et de la caractérisation des bases dans des lysats de réticulocytes 9, la génétique des levures a joué un rôle dans la découverte de plusieurs des composants du système 10 de l&#39;ubiquitine. Le succès de la levure comme organisme modèle pour l&#39;analyse systématique de la dégradation des protéines par l&#39;onduleur est principalement dû au fait que l&#39;onduleur est élevément conservé chez tous les eucaryotes 4, couplée à leur susceptibilité comme un système expérimental. En effet, les systèmes à base de levure sont couramment utilisés pour déchiffrer les mécanismes d&#39;action de l&#39;appareil d&#39;ubiquitination. L&#39;étude de la dégradation des protéines par des moyens biochimiques nécessite généralement la préparation d&#39;extraits cellulaires. Bien que les protéines de cellules animales peuvent être extraites dans des conditions relativement douces qui préservent les interactions et la fonction des protéines, la présence d&#39;une paroi cellulaire robuste dans la levure 11 exige des conditions de perturbation considérablement plus sévères qui peuvent affecter la récupération des protéines. En effet, différentes procédures de rupture des cellules de levure varient considérablement dans leur capacité à récupérer les protéines intactes dans les montants qui représentent correctement leur abondance cellulaire relative. En outre imprécision est inhérente aux différentes méthodes utilisées pour déterminer les taux de protéines spécifiques de dégradation: expériences métaboliques base étiquetage-pulse-chase &#39;&#39; suivi par immunoprecipitation, pour isoler des protéines spécifiques 12, est souvent pas strictement quantitative. Ainsi, lorsque la dégradation des protéines est comparée par cette méthode, des précautions particulières doivent être prises dans l&#39;interprétation des résultats. Pour contourner cet inconvénient, une solution de rechange cycloheximide (CHX) essai de chasse peut être utilisé 12. Dans cet essai, l&#39;inhibiteur de la traduction est ajouté à des cultures de cellules et des variations temporelles du niveau d&#39;état stable de protéines sont ensuite surveillés. Néanmoins, l&#39;utilisation de CHX est limitée à des protéines relativement courte demi-vie (&lt;90 min), que l&#39;inhibition à long terme de la synthèse de protéine est cytotoxique. En particulier, à la fois des dosages mentionnés ci-dessus nécessitent l&#39;utilisation d&#39;anticorps spécifiques de la protéine, qui ne sont pas toujours disponibles. Pour surmonter ces limitations techniques, les chercheurs ont développé plusieurs approches qui ne nécessitent pas l&#39;extraction de cellule et de la manipulation directe de la protéine. Une approche est basée sur la mise en place de oui auxotrophiquest souches, obtenues par la délétion des gènes codant pour des enzymes métaboliques essentielles. De tels gènes comprennent HIS3, LEU2, LYS2 et TRP1, codant pour des enzymes nécessaires à la biosynthèse d&#39;acides aminés, ainsi que URA3 qui code pour l&#39;OMP décarboxylase (Ura3), une enzyme essentielle de la biosynthèse de la pyrimidine ribonucléotide. Ura3 a été largement utilisé dans les études de dégradation des protéines. Dans ces essais, l&#39;expression constitutive de Ura3 sauve la croissance des cellules dans un milieu de ura3 déficient en uracile 13. Par conséquent, la déstabilisation Ura3 par la fusion d&#39;une degron peut diminuer la croissance des cellules sur milieu minimum dépourvu d&#39;uracile. Cette méthode a été utilisée dans plusieurs études de dégradation des protéines, y compris l&#39;identification des déterminants de la dégradation 5, E3 ligases 14 et facteurs ubiquitylation auxiliaire 15 et la découverte de nouveaux UPS degrons 16. Toutes ces méthodes employées croissance des cellules sur des plaques de gélose que l&#39;essai de lecture. Cependant, le til critère de croissance (croissance positive / négative), tandis que robuste et efficace, est surtout qualitative et ne fournit pas d&#39;information quantitative qui est important pour l&#39;évaluation de la puissance d&#39;un degron ou la contribution relative des différents facteurs de dégradation auxiliaires. Nous avons donc mis au point et utilisé des vecteurs de levure et les méthodes de criblage permettant une analyse systématique et quantitative de la dégradation des protéines par le URA3 -degron système de fusion. Le protocole est basé sur un test-à-poignée facile qui mesure la cinétique de la croissance en culture liquide dans des conditions sélectives (SLIG) et sur la génération de courbes de croissance standard. cinétique de croissance de la levure sont caractérisées par trois phases principales - le décalage, l&#39;exponentielle (LOG) et la phase stationnaire. Le calcul de la cinétique de réplication de levure au cours de la phase logarithmique dans des conditions sélectives, qui est déterminée par les niveaux d&#39;expression de la Ura3-degron, fournit une mesure quantitative non biaisée of dégradation des protéines. Ce procédé peut être appliqué à la mesure et la comparaison des taux de plusieurs substrats de l&#39;onduleur de dégradation simultanément dans de multiples souches et dans diverses conditions.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
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		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:184px;">Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td rowspan="6" style="width:339px;">For yeast growth on SD minimal media.&#160; Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>16325</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino acids</td>
			<td>Highest purity available&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">96 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">167008</td>
			<td>Any other compatible brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Cyclohexamide&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Sigma - Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>Working conc. 0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Infinite 200 PRO series</td>
			<td style="width:149px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">MDTcalc</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Experimental software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation

La dégradation des protéines par le système ubiquitine-protéasome (UPS) est un mécanisme majeur de la protéine de régulation de l&#39;homéostasie dans tous les eucaryotes. L&#39;approche standard pour déterminer la dégradation des protéines intracellulaires repose sur des tests biochimiques pour suivre la cinétique de la baisse de la protéine. Ces méthodes sont souvent laborieux et fastidieux et donc ne se prêtent pas à des expériences visant à évaluer plusieurs substrats et conditions de dégradation. Comme alternative, les dosages en fonction de la croissance de cellules ont été développés, qui sont, dans leur format classique, point final des analyses qui ne peuvent pas déterminer quantitativement les variations relatives des niveaux de protéines. Nous décrivons ici une méthode qui détermine fidèlement l&#39;évolution des taux de dégradation des protéines en les couplant à levure cinétique de croissance des cellules. La méthode est basée sur un système de sélection mis en place où l&#39;uracile auxotrophic de URA3 Supprimé par les cellules de levure est sauvé par une protéine rapporteur exogène exprimée, Composé d&#39;une fusion entre le gène URA3 et un déterminant essentiel de la dégradation (de degron). La protéine rapporteur est conçu de telle sorte que sa vitesse de synthèse est constant tandis que le taux de dégradation est déterminé par le degron. Comme la croissance de la cellule dans un milieu déficient en uracile est proportionnelle aux niveaux relatifs de Ura3, la cinétique de croissance dépendent entièrement de la dégradation de la protéine rapporteur. Cette méthode permet de mesurer avec précision les changements dans la cinétique de dégradation intracellulaire des protéines. Il a été appliqué à: (a) L&#39;évaluation de la contribution relative des facteurs de l&#39;ubiquitine conjugaison connus à la protéolyse (b) E2 enzyme conjuguant structure-fonction des analyses (c) Identification et caractérisation de nouveaux degrons. Application du système à base de URA3 degron- dépasse le domaine de la dégradation des protéines, comme il peut également être adapté à la surveillance des changements de niveaux de protéines associées à d&#39;autres fonctions des voies cellulaires.

Etude du rôle des enzymes de la voie Doa10 dans la dégradation d&#39;un substrat reporter Pour tester la validité de la méthode SLIG il a été comparé à un essai de dégradation traditionnel. Cette expérience évalue la contribution relative des composantes de l&#39;ER-membrane localisée Doa10 E3 ligase complexe 20,21 à la dégradation du substrat rapporteur de contrôle de la qualité des protéines Deg1- VU (figure 3A). Le pla...

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Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Croissance dosage à base de Reporter-une analyse systématique de la dégradation des protéines

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vues.  The Hebrew University of Jerusalem. Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Vidéo: Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Recherche

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

L&#39;analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Des dosages pour la dégradation des protéines mal repliées dans des cellules

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

Un système de co-culture hydroponique pour l&#39;analyse simultanée et systématique des interactions et signalisation moléculaire des plantes / microbes

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Analyse précise, haut débit de la croissance bactérienne

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...