Name: reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
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We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).

1. 세포 배양 <ol><li> 플라스미드의 선택 및 유지를위한 융합 및 (b) 추가의 대사 마커 -degron (a) URA3을 함유하는 플라스미드, 예컨대 Try467 (표 2)와 같은 적절한 영양 요 구성 효모 세포를 변형. . NOTE - 효모 전사로부터 유도 degron 적절한 플라스미드의 예는 YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV)이이 Deg1 구성된 융합 단백질을 함유하는 효모 통합 플라스미드이다 요인 Mat2 17 FLAG 에피토프 - 안정적인 ER 단백질 및 URA3 15,18 (그림 3A) - 면역, Vma12에 의해 감지. (본 연구에 적합한 플라스미드의 추가 예제에 사용되는 플라스미드는 표 3을 참조하십시오.) </li><li> 플라스미드의 선택과 유지 관리를 위해 정의 적절한 합성에서 한천 플레이트에 세포를 유지는 (SD) 매체는 아미노산 선택 마커 부족 <s&gt; 19까지 (예를 들어, Deg1-UV를 선택하고 SD-LYS 선택적 미디어에서 관리됩니다). </li><li> 정상기에 도달 할 때까지, 플라스미드 유지를위한 적절한 선택적 SD 배지에서 30 ° C에서 세포 O / N 성장. 샘플 수 (섹션 2) 피검에 따라 테스트 튜브 또는 96- 웰 플레이트에서 세포를 성장. </li></ol> 분석 2. 셀 준비 <ol><li> 샘플의 소수 (N≤15)를 분석 할 때, 세포를 희석하여 다음과 같이 매체를 교체 : <ol><li> 96 웰 플레이트 (일반 아래)에서 잘 당 SD 매체의 150 μL와 O / N 문화에서 세포의 50 μl를 희석. 빈은 매체를 포함로 첫 번째 샘플이 지정되어 있습니다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 96- 웰 플레이트에 샘플의 OD 600의 값을 결정한다. </li><li> ㅁ에서 잘 희석 계수 (X4)에 의한 600 OD 판독을 곱하여 각 실제 OD 600 계산빈 독서의 가치를 무형 문화 유산하는 뺀​​다. 맥주 - 램버트 법칙에 따라 1cm의 계산 된 경로 길이를 얻기 위해 0.55으로 나눈 결과 값을 정규화. 표준 96 웰 플레이트에서 세포에 OD 600 200 μl를 측정 할 때,이 값이 일정한 참고. </li><li> 0.25 600 OD하고 에펜 도르프 튜브로 전송 상당액에서 효모 세포를 얻기 위해 필요한 정확한 부피를 계산. </li><li> 1 분 동안 고속 (12,000 XG)에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 상등액을 제거하고 적절한 선택 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁 OD에게 0.25 600을 얻었다 (3.1 절 참조). </li><li> 96 웰 플레이트에 새 우물에 희석 된 균주의 200 μl를 전송합니다. </li></ol></li><li> 샘플들의 다수 (N&gt; 15)이 테스트 될 때, 다음과 같이, 세포를 희석 전에 OD 600 측정없이 매체를 교체 : <ol><li> 고정 된 세포의 10 μl를 전송적절한 선택 배지 190 μL (희석 1:20)를 포함하는 새로운 96 웰 플레이트에 96 웰 플레이트에서 자란 O / N (3.1 절 참조). </li></ol></li></ol> 선택적 조건에서 액체 배양 3. 성장 속도론 (GILS) <ol><li> URA3-degron 기자를 사용하여 성장 측정을 위해 다음과 같은 용지를 사용하십시오 : <ol><li> 비 제한 조건에서 효모의 성장, 사용 플라스미드 선택적 SD 미디어의 긍정적 인 컨트롤 (1.2 절 참조). 어떠한 플라스미드의 선택이 필요하지 않은 경우, 예를 들면 Deg1-UV, 필요한 모든 아미노산 (완전한 SD)를 함유하는 SD 배지로 통합 된 플라스미드를 사용하는 경우 사용할 수있다. </li><li> 제한적인 조건에서 성장을 측정하는 실험 샘플은, SD-URA 매체를 사용합니다. </li></ol></li><li> 멀티 마이크로 플레이트 리더로 설정 :. 15 분의 30 ° C, 600 OD 측정 간격의 배양 온도, 1 분 매 7 분의 궤도 및 선형 진탕 사이클 &lt;BR /&gt; 참고 :이 듀얼 모드는 세포의 균일 한 분포를 얻기 위해 최적화 된 진탕; 그러나, 다른 진동 모드 또는 어떠한 흔들림도 작동 할 수 있습니다. </li><li> 30 ° C에서 세포를 인큐베이션 마이크로 플레이트 리더 O / N 또는 세포 정지상 (12-24 시간)에 도달 할 때까지. </li><li> 스프레드 시트 파일에 원시 데이터를 내 보냅니다. </li><li> (; 자세한 내용은 4 절을 참조하십시오 최소 두배 시간 (MDT)) 세포가 인구의 크기를 두 배로 할 MDTcalc, (시간에) 최소한의 시간을 계산하는 사용자 정의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 효모의 성장 속도론을 결정합니다. </li></ol> 최소 두배 시간 4. 계산 (MDT) : MDTcalc 알고리즘의 원리 NOTE : MDTcalc 알고리즘의 원리, SD 완전 배지에서 자란 Try467 효모 세포 (표 2)의 대표 샘플을 사용하여이 데이터를 스프레드 시트 및 성장 플롯을 보여주는 표 1 및도 1에 도시되어, 스펙상대적으로. <ol><li> 웰 샘플에서 얻어진 측정 값 각각으로부터, 각 웰에서 얻어진 OD 600 블랭크 값을 차감한다. 0.55에 의해 얻어진 차이 나눈다 (96 웰 플레이트의 경우)의 광로 길이를 보정한다. 최종 값을 (표 1, 트란스.) 시간에 대하여 플롯 실제 효모 성장 곡선 (OD 600 / 시간) (도 1a)을 생성한다. </li><li> 선형 곡선 (도 1B)으로 대수 증식기를 변환하는 변환 된 값 각각에 대한 2 로그 (OD 600)를 계산한다. </li><li> (도 1C 표 1, 경사) 10 시간 포인트 간격 (N = 10)는 시간 0에서 시작하여 N &lt;10까지 한 번에 하나의 시간 - 점을 이동의 기울기를 계산한다. </li><li> 배로 세포 집단에 필요한 시간 수득 각 슬로프의 역수를 계산 (표 1, 1 / 기울기도 1C). 최소한의 계산1 / 기울기 값은 MDT (; 그림 1C 표 1, 검은 사각형)을 결정합니다. 선택한 시간 간격에서 샘플에서 세포 (표 1, 1 / 기울기, 검은 사각형)에 대한 계산 된 MDT를 추출 (빨간색 사각형으로 설명 표 1, 1B, 1D도). NOTE : SD-URA 매체상의 세포 성장 속도는 MDT에 반비례한다. </li></ol> 5. MDTcalc 사용 <ol><li> 컴퓨터의 지정된 폴더로 보충 프로그램 파일을 복사합니다. </li><li> 성장 데이터가 포함 된 스프레드 시트 파일이 저장되고 폐쇄되어 있는지 확인합니다. 화면이 나타납니다 시작을 볼 수있는 MDTcalc 응용 프로그램을 엽니 다. <ol><li> 그림 2에서 입증 된 바와 같이, 필요한 정보를 삽입합니다 : <ol><li> &#39;파일 경로&#39;에서 스프레드 시트 파일을 찾으려면 오른쪽에있는 사각형을 클릭합니다. </li><li> 여기서 t &#39;시트 이름&#39;에서 스프레드 시트 이름을 쓰기그는 원시 데이터가 있습니다. </li><li> &#39;시작 위치&#39;에서 스프레드 시트가 첫 번째 샘플의 시간 0의 좌표를 삽입합니다. </li><li> &#39;시간 열&#39;에서 시점 컬럼의 위치 (시간은 초 단위로 제공되어야한다) 형성 문자를 삽입한다. </li><li> &#39;빈 열&#39;에서 빈 컬럼의 위치를​​ 정의하는 문자 삽입 (보통을하지만, 96 웰 플레이트의 반드시 잘 A1). </li><li> &#39;OD 값&#39;에서 MDT 계산의 시작 (일반적으로 0.15-0.25)에 필요한 최소한의 변형 OD 600 값을 선택합니다. MDT는 정의 된 OD 600 값 이상에 도달 샘플에 대해 계산 될 수 있도록이 값을 설정하면 과도한 희석 지연 단계에서 문화에 대한 MDT의 계산을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 마지막 값이 입력되면, 화면 하단의 &#39;계산&#39;버튼을 누른다. 오른쪽에 진행 표시 줄이 점차 g로 변경되었는지 확인리엔. 계산 과정에서 스프레드 시트 파일을 열지 마십시오. </li><li> 스프레드 시트로 MDT 계산의 완료시 자동으로 화면에 나타나는 두 세트의 데이터 내보내기. (a) 최소 OD 값 (섹션 5.2.1.6에 설정된 바와 같이) 테스트 및 (b) MDT가 산출되는 구간의 초기 시점을 통과하는 각각의 웰에 대한 MDT 값 (시작 : 데이터가 포함되어 있는지 확인 시간). </li></ol></li></ol>

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	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li><li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis.">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li><li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+and+the+cell+cycle:+with+this+RING+I+do+thee+destroy.">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li><li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT&#945;2+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Degradation signal masking by heterodimerization of MAT&#945;2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility.">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li><li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates.">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li><li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes.">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., &amp; Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li><li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li><li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses.">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li><li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms:+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast.">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li><li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope/endoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation.">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li><li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways.">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li><li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li><li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator:+the+yeast+2+repressor.">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li><li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery.">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).</li><li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins.">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li><li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation.">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li><li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family.">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics.">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li><li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation.">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li><li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein.">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에서 우리는 (GILS) &#39;선택적 조건에서 액체 배양에서 성장 속도론&#39;라고 상대 단백질 분해 속도를 결정하는 세포의 성장을 기반으로 분석을 설명합니다. 그것은 설정하는 간단한 데이터 수집 및 분석은 간단하고 매우 모듈 형 : GILS 분석은 몇 가지 장점이 있습니다. 따라서, 높은 처리량 GILS 애플리케이션을위한 자동화하도록 적응 될 수있는 사용자 친화적 인 멀티 웰 플레이트 형식으로 여...

유비퀴틴 - 프로 테아 분해 시스템은 모든 진핵 세포에서 단백질의 항상성 유지에 관여한다 주요 조절 시스템이다. UPS는 처음에 폴리 - 유비퀴틴 태그 단백질 26S 프로 테아 좀에 의해 분해 된 후, 표적 단백질에 여러 유비퀴틴 분자 공액. 대부분의 경우, 유비퀴틴 매개 된 분해에 대한 속도 제한 단계가 E2 효소 컨쥬 게이트 및 E3 효소 결찰에 의해 매개되는 기판 ubiquitylation (E3 리가 제) 1이다. 결과적으로, 특정 단백질의 세포 내 안정성은 유비퀴틴 접합 감수성과 동족 ubiquitylation 효소의 활성을 반영한다. E3 리가 제는 UPS의 주요 기판 인식 구성 요소입니다. 따라서,이 효소가 없거나 자신의 안정적인 대응이 노출되지 중 하나 그들의 기판 내 degrons을 인식하고 있습니다. 세포주기 m의 예를 들면, 많은 레귤레이터UST 합성 순서 세포주기 진행을 유지하기 위해 시간적으로 특이 적으로 분해 될 수있다. 이러한 단백질의 분해는 종종 세포 시그널링 조절 키나아제에 의해 매개되는 3,4-, 인산화에 의해 제어된다. 반면에, 비정상적으로 접힌 단백질 애매한 degrons 통해 인식된다. 이들은 일반적으로 기본 구조에 숨겨진 구조의 교란에 노출되는 지역이다. 이러한 degrons 소수성 도메인 5-7과 본질적으로 무질서 세그먼트 (8)을 포함한다. 망상 적혈구 용 해물 (9)에서 단백질 분해 및 펀더멘털 특성화 유비퀴틴 시스템의 정액 발견 이래, 효모는 유전학 유비퀴틴 시스템 (10)의 많은 구성 요소를 발견하는 수단이되었다. UPS에 의한 단백질 분해에 대한 체계적인 분석 모델 생물로서 효모의 성공은 UPS가 높다는 사실에 주로 기인LY는 실험 시스템으로 그들의 복종 할 의무와 결합, 모든 진핵 생물 4 보존. 실제로, 효모 기반 시스템은 일반적으로 ubiquitylation 기계의 작용 메커니즘을 해독하기 위해 사용된다. 생화학 적 수단에 의한 단백질 분해를 공부하는 것은 일반적으로 세포 추출물의 준비가 필요합니다. 동물 세포 단백질 단백질 상호 작용 및 기능을 보존 비교적 온화한 조건에서 추출 될 수있는 반면, 효모 11 튼튼한 세포벽의 존재는 단백질의 복구에 영향을 미칠 수있는 붕괴 상당히 엄격한 조건이 필요하다. 실제로, 효모 세포 파괴에 대해 서로 다른 절차가 제대로 상대적인 세포 풍부을 나타내는 양 그대로 단백질을 복구하는 능력에 상당히 다릅니다. 또한 부정확 특정 단백질의 분해 속도를 결정하기 위해 사용되는 다양한 방법에 내재 : IM 다음 대사 라벨 기반의 &#39;펄스 체이스&#39;실험munoprecipitation, 특정 단백질 (12)을 분리, 자주 엄격하게 정량적 없습니다. 단백질 분해가이 방법에 의해 비교 될 때 따라서, 특별한주의는 결과를 해석에서 수행되어야한다. 이러한 결점을 회피하기 위해, 대안 사이클로 헥시 미드 (CHX) 체이스 분석은 (12)를 채용 할 수있다. 이 분석에서, 번역 억제제는 이후 모니터되는 세포 배양 및 단백질 정상 상태 수준의 시간 변화에 첨가된다. 그럼에도 불구하고, CHX의 사용은 비교적 짧은 반감기 (&lt;90 분), 단백질 합성의 장기 억제 세포 독성 인 단백질로 한정한다. 특히, 상술 한 분석법 둘 항상 사용할 수없는 단백질 - 특이 적 항체의 사용을 필요로한다. 이러한 기술적 한계를 극복하기 위해, 연구자들은 세포 추출 및 직접 단백질 처리를 필요로하지 않는 여러 가지 방법을 개발했다. 하나의 접근법은 영양 요 참의 확립에 기초필수적인 대사 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 얻어진 세인트 균주. 이러한 유전자는 OMP 디카 르 복실 라제를 코딩 HIS3,는 Leu2, LYS2 및 TRP1, 아미노산 생합성에 필요한 효소 부호화뿐만 아니라 URA3 (URA3), 피리 미딘 리보 뉴클레오티드 생합성 필수적인 효소를 포함한다. URA3 광범위 단백질 분해 연구에서 사용되어왔다. 상기 분석에서, URA3의 구성 적 발현이 우라실 - 결핍 배지 13 URA3 세포의 성장을 구출. 따라서, degron의 융합을 통해 URA3를 불안정화하는 최소 배지에 우라실 결핍 세포의 성장을 감소시킬 수있다. 이 방법은 성능 저하의 식별을 포함하여 다양한 단백질 분해 연구에서 5 결정 사용되고, E3는 14 리가 및 보조 ubiquitylation 15 요인과 새로운 UPS의 degrons (16)의 발견. 이 모든 방법은 분석 판독 등의 한천 플레이트에 세포 성장을 고용했다. 그러나, t그 성장 조건 (양 / 음의 성장), 견고하고 효율적인 주로 질적이며 degron의 효능 또는 다양한 보조 열화 요인의 상대적 기여도를 평가하는 것이 중요하다 정량적 정보를 제공하지 않고있다. 따라서 우리는 개발 및 융합 시스템 -degron URA3에 의해 단백질 분해 체계적이고 정량적 인 분석을 가능하게 효모 벡터 및 심사 방법을 활용했다. 프로토콜은 선택적 조건 하에서 액체 배양 (GILS)과 표준 성장 곡선의 생성에 성장 동역학을 측정하기 쉬운 핸들 분석에 기초한다. 지연, 지수 (로그)과 정지상 - 효모 성장 속도론은 세 가지 주요 단계를 특징으로한다. URA3-degron의 발현의 수준에 의해 결정되는 조건 하에서 선택적 로그 단계 동안 효모 복제 동력학 계산, 공평 정량적 측정을 제공 오F 단백질 분해. 이 방법은 측정하고 동시에 다수의 변형 및 다양한 조건 하에서 여러 UPS 기판의 분해율을 비교에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>For yeast growth on SD minimal media.&amp;nbsp; Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids</td><td>Highest purity available&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Any other compatible brand can be used</td></tr><tr><td>Cyclohexamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>Working conc. 0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO series</td><td>Tecan</td><td></td><td>For yeast incubation and OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used.</td></tr><tr><td>MDTcalc</td><td></td><td></td><td>Experimental software</td></tr></tbody></table>

reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation

유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)에 의한 단백질 분해는 모든 진핵 생물의 단백질 항상성의 주요 규제 메커니즘입니다. 세포 내 단백질 분해를 결정하는 표준 접근 방식은 단백질 감소의 반응 속도를 다음과 같은 사항에 대해 생화학 적 분석에 의존합니다. 이러한 방법은 종종 시간과 노력이 소요되고 여러 기판 및 분해 조건을 평가하기위한 실험을하는 것이 의무가 없습니다. 대안으로, 세포 성장 기반 분석은 정량적 단백질 수준에서의 상대적인 변화를 결정할 수있는 그들의 종래의 형식, 종점 분석법이다이 개발되고있다. 여기에서 우리는 충실하게 효모 세포 성장 속도론에 결합하여 단백질 분해 속도의 변화를 결정하는 방법을 설명합니다. 방법은 URA3의 우라실 영양 요구 효모 세포 외 인적으로 발현 리포터 단백질에 의해 구출 -deleted 확립 선택 시스템에 기초, 필수적인 URA3 유전자 및 열화 행렬식 (degron) 간의 융합 구성. 리포터 단백질의 분해 속도가 degron 의해 결정되는 반면 그 합성 속도가 일정하게되도록 설계된다. 우라실이 결핍 된 배지에서 세포 성장이 URA3의 상대적 수준에 비례하기 때문에, 성장 속도론은 리포터 단백질 분해에 전적으로 의존한다. 이 방법은 정확하게 세포 내 단백질 분해 반응 속도의 변화를 측정한다. (a) E2 효소 컨쥬 게이트 구조 - 기능 (c) 식별 및 신규 degrons의 특성을 분석하여 단백질 분해 (b)에 공지 유비퀴틴 공역 요인의 상대적 기여도를 평가 : 그것은 적용 하였다. 그것은 또한 다른 세포질 통로의 기능과 연관된 단백질 수준의 변화를 모니터링하도록 구성 될 수 degron- URA3 기반 시스템의 적용은, 단백질 분해 필드를 초월.

리포터 기판의 열화 Doa10 경로의 효소의 역할을 조사 그것이 전통적인 분해 분석과 비교 하​​였다 GILS 방법의 유효성을 테스트한다. 이 실험은 ER-막의 성분의 상대적 기여도를 평가 지역화 단백질 품질 관리 리포터 기판 Deg1- VU (도 3A)의 열화에 20,21 복잡한 Doa10 E3-리가. Deg1- VU 플라스미드 야생형 세포 내로 또는 E2 공역 ?...

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Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

reporter-based-growth-assay-for-systematic-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K 조회수.  The Hebrew University of Jerusalem. Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

비디오: Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

연구

발생학

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small molecule drug discovery. This class of compounds induces protein degradation by bringing into proximity the target protein and the E3 ligase machinery proteins required to ubiquitinate and ultimately degrade the target protein through the ubiquitin-proteasomal pathway (UPP). Profiling of target protein degradation in a high-throughput fashion, however, remains highly challenging given the complexity of cellular pathways required to achieve degradation. Here we present a protocol and screening strategy based on the use of CRISPR/Cas9 endogenous tagging of target proteins with the 11 amino acid HiBiT tag which complements with high affinity to the LgBiT protein, to produce a luminescent protein. These CRISPR targeted cell lines with endogenous tags can be used to measure compound induced degradation in either real-time, kinetic live cell or endpoint lytic modes by monitoring luminescent signal using a luminescent plate-based reader. Here we outline the recommended screening protocols for the different formats, and&#160;also describe the calculation of key degradation parameters of rate, Dmax, DC50, Dmax50, as well as multiplexing with cell viability assays. These approaches enable rapid discovery and triaging of early stage compounds while maintaining endogenous expression and regulation of target proteins in relevant cellular backgrounds, allowing for efficient optimization of lead therapeutic compounds.

This protocol describes the quantitative luminescent detection of protein degradation kinetics in living cells that have been engineered using CRISPR/Cas9 to express antibody free endogenous protein detection tag fused to a target protein. Detailed instructions for calculating and obtaining quantitative degradation parameters, rate, Dmax, DC50, and Dmax50 are included.

HiBiT CRISPR 세포주를 사용한 표적 단백질 분해 화합물의 고처리량 세포 프로파일링

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

암 연구학

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

생화학

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

생물학

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

단백질 분해에서의 사이클로 헥시 미드 체이스 분석<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

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