We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).

1. Cell Culture
<ol>
	<li>Transform the appropriate auxotrophic yeast cells, such as Try467 (Table 2), with a plasmid containing (a) a URA3-degron fusion and (b) an additional metabolic marker for plasmid selection and maintenance. 
	NOTE: An example of a suitable plasmid is YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1-UV). This is a yeast integrative plasmid containing a fusion protein comprising of Deg1 &#8212; a degron derived from the yeast transcription factor Mat217, FLAG epitope &#8212; for detection by immunoblotting, Vma12 &#8212; a stable ER protein, and Ura315,18 (Figure 3A). (See Table 3 for plasmids used in this study and for additional examples of suitable plasmids.)</li>
	<li>For plasmid selection and maintenance, keep cells in agar plates under a suitable Synthetic Defined (SD) medium lacking amino acid selection markers19 (For example, Deg1-UV is selected and maintained under SD-LYS selective media).</li>
	<li>Grow cells O/N at 30 &#176;C in a suitable selective SD medium for plasmid maintenance until a stationary phase is reached. Grow the cells in test tubes or in a 96-well plate, depending on the number of samples to be examined (section 2).</li>
</ol>
2. Cell Preparation for Analysis
<ol>
	<li>When a small number of samples (N&#8804;15) are to be assayed, dilute the cells and replace the medium as follows:
	<ol>
		<li>Dilute 50 &#181;l of cells from an O/N culture with 150 &#181;l of SD medium per well in a 96-well plate (clear bottom). Note, the first sample is designated as blank contains medium only.</li>
		<li>Determine the OD600 values of the samples in the 96-well plate using a microplate reader.</li>
		<li>Calculate the actual OD600 in each well by multiplying the OD600 reading by the dilution factor (x4), from which the value of the blank reading is subtracted. Normalize the resulting values by dividing by 0.55 to obtain a calculated path-length of 1 cm according to the Beer-Lambert law. Note, this value is constant when measuring the OD600 of 200 &#181;l of cells in a standard 96-well plate.</li>
		<li>Calculate the exact volume needed for obtaining yeast cells at amount equivalent to OD600 of 0.25 and transfer it to an Eppendorf tube.</li>
		<li>Spin down the cells at high speed (12,000 x g) for 1 min.</li>
		<li>Remove the supernatant and resuspend the cells in 1 ml of the appropriate selective medium (see section 3.1) to obtain OD600 of 0.25.</li>
		<li>Transfer 200 &#181;l of the diluted strains to a new well in a 96-well plate.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>When a large number of samples (N&#62;15) are to be tested, dilute the cells and replace the medium without prior OD600 measurement, as follows:
	<ol>
		<li>Transfer 10 &#956;l of stationary cells grown O/N in a 96-well plate into a new 96-well plate containing 190 &#956;l (dilution 1:20) of the appropriate selective media (see section 3.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Growth Kinetics in Liquid Culture Under Selective Conditions (GiLS)
<ol>
	<li>Use the following media for growth measurements using the Ura3-degron reporter:
	<ol>
		<li>For positive controls of yeast growth under non-restrictive conditions, use plasmid selective SD media (see section 1.2). If no plasmid selection is required, for example, when using an integrative plasmid such as Deg1-UV, SD medium containing all necessary amino acids (SD complete) can be used.</li>
		<li>For experimental samples measuring growth under restrictive conditions, use SD-URA medium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Set a multimode microplate reader to: an incubation temperature of 30 &#176;C, OD600 measurement intervals of 15 min, and an orbital and linear shaking cycles of 1 min every seven min. 
	NOTE: This dual-mode shaking was optimized to obtain homogenous distribution of cells; however, other shaking modes or even no shaking may work as well.</li>
	<li>Incubate the cells at 30 &#176;C in a microplate reader O/N or until cells have reached the stationary phase (12-24 hr).</li>
	<li>Export the raw data to a spreadsheet file.</li>
	<li>Determine yeast growth kinetics using MDTcalc, a customized software program that calculates the minimal time (in hr) for cells to double their population size (Minimal Doubling Time (MDT); for details see section 4).</li>
</ol>
4. Calculation of Minimal Doubling Time (MDT): Principles of the MDTcalc Algorithm

NOTE: Principles of the MDTcalc algorithm, using a representative sample of Try467 yeast cells (Table 2) grown in SD complete media, are illustrated in Table 1 and Figure 1, showing a data spreadsheet and growth plots, respectively.

<ol>
	<li>Subtract OD600 blank values, obtained in the respective well, from each of the readings obtained in the sample well. Divide the resulting differences by 0.55 (for 96-well plates) to correct for the light path length. Plot the final values (Table 1, Trans.) against time to produce the actual yeast growth curve (OD600/hr) (Figure 1A).</li>
	<li>Calculate log2 (OD600) for each of the transformed values to convert the logarithmic growth phase into a linear curve (Figure 1B).</li>
	<li>Calculate the slope of a 10 time-points interval (N=10) starting at time 0 and moving one time-point at a time until N&#60;10 (Table 1, Slope; Figure 1C).</li>
	<li>Calculate the inverse value of each slope to obtain the time required for the cell population to double (Table 1, 1/Slope; Figure 1C). Calculate the minimal 1/Slope value to determine the MDT (Table 1, black rectangle; Figure 1C). Extract the calculated MDT for cells in the sample (Table 1, 1/Slope, black rectangle) from the selected time interval (Table 1, outlined by red rectangle, Figures 1B, 1D). 
	NOTE: The rate of cell growth on SD-URA medium is inversely proportional to the MDT.</li>
</ol>
5. Using MDTcalc
<ol>
	<li>Copy the supplemented program files into a designated folder in the computer.</li>
	<li>Make sure the spreadsheet file containing the growth data is saved and closed. Open the MDTcalc application program to see the start screen appears.
	<ol>
		<li>Insert the required information, as demonstrated in Figure 2:
		<ol>
			<li>Under &#39;File path&#39;, click on the rectangle on the right to locate the spreadsheet file.</li>
			<li>Under &#39;Sheet name&#39;, write the spreadsheet name where the raw data is located.</li>
			<li>Under &#39;Starting position&#39;, insert the spreadsheet coordinate of time 0 of the first sample.</li>
			<li>Under &#39;Time column&#39;, insert the letter defining the location of the time point column (time should be provided in seconds).</li>
			<li>Under &#39;Blank column&#39;, insert the letter defining the location of the blank column (usually but not necessarily in well A1 of the 96-well plate).</li>
			<li>Under &#39;OD value&#39;, choose the minimal transformed OD600 value required for the initiation of MDT calculation (usually 0.15-0.25). Setting this value prevents calculations of MDT for cultures in lag phase due to excessive dilution so that MDT is calculated only for samples that reach the defined OD600 value or higher.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Once the last value has been entered, press the &#39;calculate&#39; button at the bottom of the screen. Ensure that the progress bar on the right gradually changes to green. Do not open the spreadsheet file during the calculation process.</li>
		<li>Export the two sets of data that appear automatically on the screen at the completion of the MDT calculation into a spreadsheet. Ensure that the data includes: (a) the MDT value for each well that passes the minimal OD value test (as set in section 5.2.1.6) and (b) the initial time point of the interval from which the MDT was calculated (Start time).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li><li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis.">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li><li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+and+the+cell+cycle:+with+this+RING+I+do+thee+destroy.">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li><li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT&#945;2+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Degradation signal masking by heterodimerization of MAT&#945;2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility.">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li><li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates.">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li><li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes.">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., &amp; Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li><li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li><li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses.">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li><li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms:+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast.">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li><li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope/endoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation.">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li><li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways.">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li><li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li><li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator:+the+yeast+2+repressor.">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li><li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery.">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).</li><li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins.">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li><li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation.">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li><li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family.">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics.">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li><li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation.">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li><li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein.">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Here we describe an assay based on cell growth for determining relative protein degradation rates, termed &#39;Growth kinetics in Liquid culture under Selective conditions&#39; (GiLS). The GiLS assay has several advantages: It is simple to set up, data acquisition and analysis is straightforward and it is extremely modular. Consequently, GiLS can be applied simultaneously to multiple samples in a user friendly multi-well plate format that can be adapted to automation for high throughput applications. Most importantly, Gi...

El sistema de degradación ubiquitina-proteasoma es una máquina reguladora importante, que ha sido implicado en el mantenimiento de la homeostasis de la proteína en todos los eucariotas. El UPS conjuga inicialmente múltiples moléculas de ubiquitina a una proteína diana después de lo cual la proteína poli-ubiquitina-etiquetado es degradada por el proteasoma 26S. En la mayoría de los casos, el paso limitante de la degradación mediada por ubiquitina es ubiquitylation sustrato, mediada por la conjugación de enzimas E2 y E3 ligando enzimas (E3 ligasas) 1. En consecuencia, la estabilidad intracelular de proteínas específicas refleja su susceptibilidad a la ubiquitina-conjugación y la actividad de sus enzimas ubiquitylation afines. Ligasas E3 son los principales componentes de reconocimiento de sustrato de la UPS. Como tal, estas enzimas reconocen degrons dentro de sus sustratos que están ausentes o no expuestos en sus contrapartes estables 2. Por ejemplo, muchos reguladores del ciclo celular mUST ser sintetizado y degradado de manera temporal específica, a fin de mantener la progresión del ciclo celular en orden. La degradación de estas proteínas a menudo se controla por fosforilación, mediada por quinasas reguladas de señalización celular 3,4. Por otro lado, las proteínas plegadas de forma aberrante, se reconocen a través de degrons crípticos. Se trata de regiones que normalmente están ocultos en la estructura nativa y están expuestos a la estructura de la perturbación. Tales degrons incluyen dominios hidrofóbicos 5-7 y segmentos intrínsecamente desordenados 8. Desde el descubrimiento seminal del sistema-ubiquitina para la degradación de proteínas y la caracterización de sus fundamentos en lisados ​​de reticulocitos 9, la genética de la levadura fue instrumental en el descubrimiento de muchos de los componentes del sistema de ubiquitina 10. El éxito de la levadura como organismo modelo para el análisis sistemático de la degradación de proteínas por el UPS se debe principalmente al hecho de que el SAI es altoLy conserva en todos los eucariotas 4, junto con su amenability como un sistema experimental. De hecho, los sistemas basados ​​en levaduras se emplean comúnmente para descifrar los mecanismos de acción de la maquinaria de ubiquitinación. El estudio de la degradación de proteínas por medios bioquímicos por lo general requiere la preparación de extractos celulares. Mientras que las proteínas de células animales pueden ser extraídos en condiciones relativamente suaves que conservan las interacciones proteína y la función, la presencia de una pared celular de levadura robusto en condiciones de interrupción 11 requiere considerablemente más severas que pueden afectar a la recuperación de proteínas. De hecho, diferentes procedimientos para la interrupción de la célula de levadura varían considerablemente en su capacidad para recuperar las proteínas intactas en cantidades que representan correctamente su abundancia relativa celular. Además inexactitud inherente a los diferentes métodos utilizados para la determinación de las tasas de degradación de proteínas específicas: experimentos metabólicos basado etiquetado &#39;pulso-caza&#39; seguido de immunoprecipitation, para aislar proteínas específicas 12, a menudo no es estrictamente cuantitativo. Por lo tanto, cuando la degradación de proteínas se compara con este método, la precaución adicional debe tener precaución en la interpretación de los resultados. Para evitar este inconveniente, una alternativa cicloheximida (CHX) ensayo de persecución se puede emplear 12. En este ensayo, se añade el inhibidor de la traducción a cultivos de células y los cambios temporales en los niveles de estado estable de proteínas son monitoreados posteriormente. Sin embargo, el uso de CHX se limita a las proteínas con vidas medias relativamente cortas (&lt;90 min), como la inhibición a largo plazo de la síntesis de proteínas es citotóxico. En particular, tanto de los ensayos mencionados anteriormente requieren el uso de anticuerpos específicos para la proteína, que no siempre están disponibles. Para superar estas limitaciones técnicas, los investigadores han desarrollado varios enfoques que no requieren la extracción de células y la manipulación directa de proteínas. Un enfoque se basa en el establecimiento de sí auxotróficocepas del st, obtenidos mediante la supresión de los genes que codifican las enzimas metabólicas esenciales. Tales genes incluyen HIS3, LEU2, LYS2 y TRP1, que codifica para las enzimas necesarias para la biosíntesis de aminoácidos, así como URA3 que codifica OMP descarboxilasa (Ura3), una enzima esencial de la biosíntesis de pirimidina ribonucleótido. Ura3 ha sido ampliamente utilizado en estudios de degradación de proteínas. En estos ensayos, la expresión constitutiva de Ura3 rescata crecimiento de las células ura3 en medio sin uracilo deficiente 13. En consecuencia, desestabilizando Ura3 a través de la fusión de un degron puede disminuir el crecimiento de células en medio mínimo carente de uracilo. Este método se ha utilizado en varios estudios de degradación de proteínas, incluyendo la identificación de determinantes de la degradación de 5, ligasas E3 14 y ubiquitylation auxiliar factores de 15 y el descubrimiento de nuevos UPS degrons 16. Todos estos métodos empleados crecimiento de las células en placas de agar como lectura del ensayo. Sin embargo, tque el criterio de crecimiento (crecimiento positivo / negativo), mientras robusta y eficiente, es sobre todo cualitativo y no proporciona información cuantitativa que es importante para evaluar la potencia de un degron o la contribución relativa de los diversos factores de degradación auxiliares. Por ello, hemos desarrollado y utilizado los vectores de levadura y los métodos de detección que permite un análisis sistemático y cuantitativo de la degradación de proteínas por el URA3 -degron sistema de fusión. El protocolo se basa en un ensayo fácil de manejar que mide la cinética de crecimiento en cultivo líquido bajo condiciones selectivas (GILS) y en la generación de curvas de crecimiento estándar. Cinética de crecimiento de la levadura se caracterizan por tres fases principales - el desfase, la exponencial (de registro) y la fase estacionaria. Cálculo de la cinética de replicación de levadura durante la fase de registro en condiciones selectivas, que se determina por los niveles de expresión de la Ura3-degron, proporciona una medición cuantitativa o imparcialf degradación de proteínas. Este método se puede aplicar a la medición y la comparación de las tasas de degradación de múltiples sustratos UPS simultáneamente en múltiples cepas y bajo diversas condiciones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:339px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:184px;">Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td rowspan="6" style="width:339px;">For yeast growth on SD minimal media.&#160; Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>16325</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino acids</td>
			<td>Highest purity available&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">96 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">167008</td>
			<td>Any other compatible brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Cyclohexamide&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Sigma - Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>Working conc. 0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Infinite 200 PRO series</td>
			<td style="width:149px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">MDTcalc</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Experimental software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation

La degradación de proteínas por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) es un mecanismo regulador importante para la homeostasis de la proteína en todos los eucariotas. El enfoque estándar para la determinación de la degradación intracelular de proteínas se basa en ensayos bioquímicos para el seguimiento de la cinética de disminución de la proteína. Tales métodos son a menudo laborioso y consume mucho tiempo y por lo tanto no susceptible de experimentos dirigidos a evaluar múltiples sustratos y condiciones de degradación. Como alternativa, los ensayos basados ​​en el crecimiento de células se han desarrollado, que son, en su formato convencional, ensayos de punto final que no puede determinar cuantitativamente los cambios relativos en los niveles de proteína. Aquí se describe un método que determina fielmente los cambios en las tasas de degradación de proteínas mediante el acoplamiento a la cinética de crecimiento celular de la levadura. El método se basa en un sistema de selección establecido donde uracilo auxotrofía de URA3 -deleted células de levadura es rescatado por una proteína reportera expresada exógenamente, Compuesto de una fusión entre el gen URA3 esencial y determinante de degradación (degron). La proteína indicadora está diseñado de manera que su tasa de síntesis es constante mientras que su velocidad de degradación se determina por la degron. Como el crecimiento de células en medio sin uracilo deficiente es proporcional a los niveles relativos de Ura3, la cinética de crecimiento dependen enteramente de la degradación de la proteína reportera. Este método mide con precisión los cambios en la cinética de degradación de proteínas intracelulares. Se aplicó a: (a) Evaluación de la contribución relativa de los factores de ubiquitina-conjugación conocidos a la proteolisis (b) la conjugación de la enzima E2 estructura-función analiza (c) Identificación y caracterización de nuevos degrons. La aplicación del sistema basado en URA3 degron- trasciende el campo de la degradación de proteínas, ya que también se puede adaptar a los cambios de monitorización de los niveles de proteína asociadas con las funciones de otras vías celulares.

Investigating the role of enzymes of the Doa10 pathway in the degradation of a reporter substrate 
To test the validity of the GiLS method it was compared to a traditional degradation assay. This experiment assesses the relative contribution of components of the ER-membrane localized Doa10 E3-ligase complex20,21 to the degradation of the protein quality control reporter substrate Deg1-VU (Figure 3A). The Deg1-VU plasmid was integra...

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Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Ensayo de crecimiento basado en reportero para el Análisis Sistemático de la degradación de proteínas

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vistas.  The Hebrew University of Jerusalem. Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.