نعترف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01 DE021683، R01 DE019434، U01 HL099776، مؤسسة ومختبر أوك Hagey للأطفال الطب التجديدي.

ملاحظة: البيان الأخلاقي: تم تنفيذ كافة البحوث التي تنطوي على الحيوانات الفقارية في بروتوكولات فقا افق الفريق الإداري ستانفورد في رعاية الحيوان المعملية (APLAC). 1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمكين 10 مل من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا الفصل كثافة الخلية التدرج (الذي يحتوي polysucrose والصوديوم دياتريزوات، تعديلها لكثافة 1.077 غ / مل) للقدوم إلى RT في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدفق الخلوي (نظام مراقبة الأصول الميدانية) العازلة مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و 2٪ مصل العجل الجنين (FCS). اتخاذ قسامة 50 مل والحفاظ على هذه قسامة على RT لاستخدامها خلال خطوة وسائل الاعلام فصل الخلايا كثافة التدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديك دلو من الجليد على استعداد للحفاظ على الأنسجة والخلايا المعزولة في أثناء إجراء العزل. </li></ol> 2. إعداد الثقافة وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام القاعدية: MEM (الحد الأدنى الضروري المتوسطة)، دون أحمر الفينول (500 مل)، الغلوتامات (1X)، FCS (10X)، 10،000 وحدة / مل العسائلن (1X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية وسائل الاعلام القاعدية مع فلتر 0.22 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نخاع العظم وسائل الإعلام بلعم الاستقراء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ 50 مل من وسائل الإعلام القاعدية التي أعدت في الخطوة 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروستاغلاندين E2 إضافة (PGE2، السيد 352،465 غ / مول) في 10 -7 M تركيز النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) في 10 نانوغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تصفية الحل النهائي لنخاع العظم بلعم تحفيز وسائل الإعلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد وسائل الإعلام تحريض ناقضة العظم: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ 50 مل من وسائل الإعلام القاعدية التي أعدت في الخطوة 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروستاغلاندين E2 إضافة (PGE2، السيد 352،465 غ / مول) في 10 -7 M التركيز النهائي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) في 10 نانوغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة RANKL في 10 نانوغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تصفية الحل النهائي للتحريض وسائل الإعلام ناقضة العظم. </li></ol></li></ol> 3. عزل نخاع العظم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء واحدة C57BL / 6 الماوسثاني أكسيد الكربون باستخدام طريقة الاستنشاق، تليها خلع عنق الرحم. ملاحظة: يجب أن يتم التخلص القوارض من قبل الموظفين المدربين باستخدام التقنية المناسبة والمعدات وكلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف وتأمين الماوس على لوحة التشريح ورذاذ مع 70٪ كحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج عظام الفخذ، الظنبوب، للعضد والعمود الفقري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع الماوس في موقف ضعيف. إجراء شق عموديا على طول الطرف السفلي وتبدأ من خلال تشريح على طول عظم الفخذ والظنبوب بقسمة إرفاق ملفات الأنسجة اللينة. أخيرا، خلخل العظام من مفصل الركبة والورك لاطلاق سراح العظام تماما من الهيكل العظمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشروع في إجراء شق على طول الطرف العلوي لعزل العضد. خلخل العضد في الكتف والكوع المفاصل من خلال تشريح لينة مرفق المحفظة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، وتحويل الماوس فوق، بحيث الماوس يكمن عرضة. جعل شق الجلد على طول العمود الفقري، في خط الوسط. مراقبة مجاور للفقار ينةالأنسجة على كل جانب من العمود الفقري وشق على طول الحافة العظمية في العمود الفقري، من خلال تشريح مجاورة للفقرة كتلة الأنسجة اللينة. باستخدام مقص، وجعل قطع الأفقي عبر العمود الفقري عند قاعدة العنق، وعند نهاية العمود الفقري والداني فقط لإدخال الذيل، وتحرير العمود الفقري من التعلق الأنسجة اللينة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ويتم حصاد العظام، والاحتفاظ بها في المخزن FACS على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المناديل الورقية لتنظيف العضلات والأنسجة اللينة من العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العظام وتنظيفها في مدقة وهاون مع 3 مل من العازلة FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحق العظام برفق في مدقة وهاون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من السائل ملطخة بالدماء ونقل في أنبوب 50 مل المخروطية عن طريق تمرير الحل من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل FACS العازلة إلى العظام سحق وسحق أكبر. مرة أخرى، وإزالة السائل باستخدام ماصة ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل من خلال مصفاة 70 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة سحق عظام التويم إلى ثلاث مرات في المخزن FACS جديدة، وذلك باستخدام هاون ومدقة، في كل مرة إضافة 5 مل مزيد من العازلة FACS جديدة، حتى لا صمة عار السائل الأحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في حل نخاع العظام في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لانتاج بيليه الخلية. </li></ol> 4. الفصل المتدرج من خلايا نخاع العظام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وطاف resuspend في 10 مل من العازلة FACS (الحفاظ على RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ 50 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا الفصل كثافة الخلية التدرج (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة الحل نخاع العظام على كثافة التدرج وسائل الاعلام فصل الخلايا. القيام بذلك ببطء باستخدام ماصة الكهربائية. زاوية غيض ماصة ضد السطح الداخلي بالقرب من أعلى أنبوب مخروطي الشكل ويميل أنبوب مخروطي الى نحو 30 درجة. باستخدام إعداد سرعة بطيئة على ماصة، وطرد بلطف الحل نخاع العظم حتى لا تعكر صفو كثافة التدرج وسائل الاعلام فصل الخلايا. ملاحظة: في نهاية المطاف سوف هناكيكون تعريفا واضحا بين الحلين (حل الخلوية وكثافة وسائل الاعلام حل فصل الخلايا التدرج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جهاز للطرد المركزي RT، الطرد المركزي كثافة التدرج وسائل الاعلام فصل الخلايا والحل خلية في جهاز للطرد المركزي متوازن في 200 x ج لمدة 15 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، إزالة التسارع والتباطؤ في أجهزة الطرد المركزي لضمان فصل مرحلة كافية باستخدام التدرج الكثافة وسائل الاعلام فصل الخلايا التدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، ونضح قبالة الطبقة الوسطى غائم التي تحتوي على خلايا نخاع العظم من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل هذه الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل الجديد. إضافة 20 مل من العازلة FACS إضافية (حافظ على الجليد) لغسل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لانتاج بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية النهائي في 1ml من البلاعم تحفيز وسائل الإعلام للسماح عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li></ol> 5. خلية العد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 ميكرولتر من الحل خلية ومزيجمع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. تحميل 10 ميكرولتر من المزيج الناتج على عدادة الكريات والحصول على عدد خلايا لكل مل من محلول. </li></ol> التثقيف 6. خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 2 مل من البلاعم تحفيز وسائل الإعلام في كل بئر من 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200،000 الخلايا لكل بئر. ملاحظة: في تجربتنا، وكثافة الخلايا والطلاء هي واحدة من أهم المتطلبات الحاسمة لزراعة كافية في المختبر من الخلايا الآكلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم بلطف لوحة ومكان في حاضنة العادية عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تغيير في وسائل الاعلام لمدة 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 أيام في البلاعم تحفيز وسائل الإعلام، وتغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام ناقضة العظم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآخرة، وتغيير وسائل الإعلام يوميا لمدة 5-7 أيام، وعند هذه النقطة، يجب أن تكون كبيرة، الآكلة مرئية متعددة النوى على لوحة الثقافة. </li></ol> 7. تلطيخ مع طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5-7 أيام في المختبر طريق مسدودالبنية، ونضح وسائل الإعلام من الثقافة أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار بلطف مع 1X PBS ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 4٪ محلول امتصاص العرق ويترك لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذا الوقت، وإعداد وصمة عار TRAP (وهي متاحة تجاريا) من خلال ما قبل ارتفاع درجات الحرارة إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة في امتصاص العرق، ونضح من امتصاص العرق وغسل بلطف 3 مرات مع 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من قبل تحسنت TRAP وصمة عار في كل بئر من لوحة لتكون ملطخة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، نضح من وصمة عار TRAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار 3 مرات مع الماء منزوع الأيونات قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين البئر مع الهيماتوكسيلين جيل ل(تنبيه) لمدة 1-2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا الآكلة الصورة باستخدام مشرق المجهري المجال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار بالماء منزوع الأيونات حتى كثافة اللون كافية من وصمة عار ويتحقق، وعادة عندما تظهر نوى بلوه. </li></ol> 8. تآكل العظام Osteoclast إعادة امتصاص الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المتاحة تجاريا طبق ثقافة 24-جيدا البوليسترين التي هي المغلفة مسبقا مع الركيزة إما العظام أو الكالسيوم البلورية طلاء الفوسفات غير العضوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 2 مل من البلاعم تحفيز وسائل الإعلام في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200،000 خلايا نخاع العظام المعزولة حديثا حصلت في نهاية الخطوة 2 إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم بلطف لوحة قبل وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3، وتغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام ناقضة العظم التمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تغييرات وسائل الإعلام اليومية مع وسائل الإعلام ناقضة العظم التمايز لمدة 5-7 أيام. </li></ol> 9. الكمي للتآكل العظام Osteoclast إعادة امتصاص آخر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5-7 أيام للثقافة في المختبر في وسائل الإعلام ناقضة العظم التمايز على ركيزة المعدنية وتحليل سطح المعادن، كما هو موضح أدناه، لتقييم قدرة الخلايا الآكلة لتشكيل resorptiعلى الحفر، وهو مؤشر للنشاط ناقضة العظم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام نضح من لوحة فحص ارتشاف وإضافة 100 ميكرولتر من 10٪ محلول التبييض على كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع محلول التبييض 10٪ لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار 3 مرات مع الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح إيقاف أي المياه المتبقية والتخلص من الماء الزائد من لوحة والسماح للهواء الجاف لمدة 3-5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين لوحة مع المتاحة تجاريا فون كوسا عدة تلطيخ للسماح التصور أسهل للامم المتحدة resorbed الركيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر مشرق الميدان لالتقاط صور من أجزاء تمثيلية من سطح resorbed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة باستخدام برامج التحليل، وحساب النسبة المئوية للسطح resorbed للسماح لتقدير حجم النشاط resorptive ناقضة العظم. </li></ol>

<ol>
	<li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption:+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit.">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue.">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li><li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells.">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li><li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes.">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast.">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bench+to+bedside:+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab.">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li><li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast.">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li><li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+OPG/RANKL/RANK+system.">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li><li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss.">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology.">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li><li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget's+Disease+of+Bone.">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li><li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function.">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li><li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD/SCID+IL-2Rgamma(null)+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies.">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells.">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand.">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function.">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li><li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism.">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li><li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease.">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li><li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+osteoclast+function.">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts.">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li><li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interleukin-6,+osteoclastogenesis,+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor.">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li><li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+among+cells+of+bone,+immune+system,+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases.">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., &amp; developmental immunology. 2013, (2013).</li><li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer.">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., &amp; oncology. 11, 134-143 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases.">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li></ol>

لا أحد المؤلفين لديه الإفصاح أو تضارب في المصالح ليعلن.

وكانت القدرة على عزل بسهولة وزراعة أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة في المختبر مسؤولا عن المساعدة على تعزيز فهم البيولوجيا العظام والأمراض بوساطة ناقضة العظم. كان تحديد RANKL التي تؤدي إلى هذا، عندما تم التعرف عليه مؤخرا كمنظم رئيسي لتشكيل ناقضة العظم، والتمايز وال?...

إعادة تشكيل العظام هو دينامية وينطوي على اقتران تكوين العظام مع ارتشاف العظم 1. هذه العملية للتنظيم محكم مسؤولة عن الحفاظ على الهيكل العظمي خلال التوازن الطبيعي، وردا على الاصابة والمرض. الخلايا الآكلة هي الخلايا متعددة النوى الفريدة القادرة على resorbing كلا من المصفوفات العضوية وغير العضوية من العظام. وتستمد الخلايا الآكلة من نسب الوحيدات / بلعم من نخاع العظم 2-5. تشوهات في وظيفة أو تشكيل الخلايا الآكلة يمكن أن يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض السريرية، بما في ذلك الحالات الشائعة مثل مرض هشاشة العظام. وقد سمح القدرة على توليد الخلايا الآكلة في المختبر لتقدما كبيرا في فهمنا للبيولوجيا العظام 6. ونتيجة لذلك، عوامل علاجية جديدة آخذة في الظهور لعلاج الأمراض المرتبطة ناقضة العظم المسؤولة عن الحالات المرضية والوفيات كبيرة 7 </sتصل&gt;. صيانة التماثل الساكن من كتلة العظام وقوتها تتطلب اتخاذ إجراءات متضافرة من بانيات تشكيل العظام والخلايا الآكلة-resorbing العظام 8،9. يتم تبديل التوازن العظام في عدد من الأمراض، بما في ذلك مرحلة ما بعد انقطاع الطمث وهشاشة العظام، والتي زاد النشاط ناقضة العظم يؤدي إلى فقدان المسببة للأمراض من كتلة العظام وكثافتها 10. مع زيادة توافر نماذج الفئران المعدلة وراثيا من الأمراض التي تصيب البشر، هناك المزيد من الفرص لفك دور الخلايا الآكلة في أمراض العظام البشرية 11-13. ويبدو أن العديد من البروتوكولات لتقنيات زراعة ناقضة العظم في الأدب، مع العديد من الاختلافات وصفت 9،12،14. ووصف زملاء شينغ منهجية مماثلة لبروتوكول المبينة أدناه، في وصفها للفحوصات osteoclastogenic من خلايا نخاع العظام في الفئران. لكن للافراج عن خلايا نخاع العظام العظام الطويلة بعد الحصاد، شينغ وآخرون مسح تجويف نخاع مع α-MEM وسائل الإعلام كاملة14. Catalfamo يدرس تأثير ارتفاع السكر في الدم على وظيفة ناقضة العظم ويصف الطريقة التي حشدت من قبل جميع الخلايا نخاع العظم التنظيف ومثقف لمدة 24 ساعة، وعند هذه النقطة يتم تجاهل الخلايا غير ملتصقة 12، وهي تقنية تستخدم أيضا من قبل بويل وآخرون 9 هذه البروتوكولات نشرت سابقا تتطلب ممارسة بيغ نخاع العظام، وهي ممارسة شاقة، الذي يدخل أيضا من خطر الإصابة إبرة عصا وفقدان نخاع العظم قيمة، كما لا بد من قطع طرفي العظم. البروتوكول، الذي وصفنا، بتطبيق استخدام هاون ومدقة لعزل الخلايا الآكلة، وهي مشابهة لطريقة عزل بلعم صفها Weischenfeldt وآخرون (15). تجربتنا، ومع ذلك، هو أن العزلة ناقضة العظم والثقافة في المختبر باستخدام تقنيات النتائج المنشورة سابقا في نتائج متفاوتة من حيث الإنتاج ناقضة العظم، مما يؤدي في كثير من الأحيانفي عدم القدرة على زراعة الخلايا الآكلة. لذا، قمنا بوضع البروتوكول الذي يسمح لعزل متسقة من نخاع العظم لإنتاج الماوس أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة متعددة النوى في المختبر، مع العائد التقريبي 70-80٪ من خلايا مطلي في البداية تشكيل الضامة والخلايا الآكلة في وقت لاحق، في حضور ناقضة العظم وسائل الإعلام تحريض.

<table><tbody><tr><td>MEM, no glutamine, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinant mouse</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; expressed)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> الخلايا الآكلة هي الخلايا المتخصصة جدا التي هي مستمدة من النسب الوحيدات / بلعم من نخاع العظام. قدرة فريدة ليرتشف كل من المصفوفات العضوية وغير العضوية من العظام يعني أنها تلعب دورا رئيسيا في تنظيم إعادة الهيكل العظمي. معا، وبانيات الآكلة هي المسؤولة عن عملية الربط الديناميكية التي تنطوي على حد سواء ارتشاف العظام وتكوين العظام تعمل معا للحفاظ على الهيكل العظمي العادي أثناء الصحة والمرض. كما أن خلايا العظام resorbing الرئيسية في الجسم، ويمكن التغيرات في التفريق ناقضة العظم أو وظيفة يؤدي إلى آثار عميقة في الجسم. الأمراض المرتبطة ظيفة ناقضة العظم المتغيرة يمكن أن تتراوح في شدتها من أمراض حديثي الولادة قاتلة بسبب الفشل في تشكيل الفضاء لنخاع الدم، لاحظ أكثر شيوعا الأمراض مثل هشاشة العظام، والتي المفرط ارتشاف العظم ناقضة العظم يهيئ لكسر تشكيل. وقد سمح الأنف والحنجرة &quot;&gt; القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في المختبر لتقدم كبير في فهم دورة إعادة تشكيل العظام ومهدت الطريق لاكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة أن مكافحة هذه الأمراض. هنا، نحن تصف بروتوكول لعزل وزراعة الخلايا الآكلة من نخاع العظم الماوس التي من شأنها أن تسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة.

<html> وكان الهدف من هذا الأسلوب لعزل بسهولة أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة في المختبر، وعادة في أسبوع واحد. وقد أكد العزلة الناجحة لأعداد كبيرة من الخلايا الآكلة باستخدام المقاومة للحمض الفوسفاتيز طرطرات تلطيخ (الشكل 1A). وتصور الخلايا الآكلة الكبيرة وخلاي...

Watch this Scientific Journal Video about Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

الخلايا الآكلة هي الخلايا الرئيسية resorbing العظام في الجسم. وقد أدت القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في تحقيق تقدم جوهري في فهم علم الأحياء ناقضة العظم. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لعزل وزراعة وقياس النشاط ناقضة العظم في المختبر.

ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

24.0K Views.  Stanford University School of Medicine.  الخلايا الآكلة هي الخلايا الرئيسية resorbing العظام في الجسم. وقد أدت القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في تحقيق تقدم جوهري في فهم علم الأحياء ناقضة العظم. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لعزل وزراعة وقياس النشاط ناقضة العظم في ال?...

Video: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cancer Research

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

تحفيز اشارة الشق في ماوس تآكل العظام Osteoclast السلائف

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Developmental Biology

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

على أساس رانكل "اوستيوكلاست الثقافة المقايسة للماوس نخاع العظام" التحقيق في دور mTORC1 في "تشكيل اوستيوكلاست"

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

الفئران هند الاطراف طويل العظام تشريح ونخاع العظم عزل

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Immunology and Infection

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

الشخصية التوافق البيولوجي في الحيوية لتجديد العظام

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Bioengineering

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

تمايز وتوصيف الخلايا الآكلة للعظم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

تمايز الخلايا العظمية الوظيفية من الخلايا الوحيدة CD14 + للدم المحيطي البشري

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

العزلة ، تنقيه ، والتمايز من السلائف العظمية من نخاع العظم الفئران

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج محسن لإصابة نخاع العظم لدراسات إصلاح العظام داخل الغشائية

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage template, the process of intramembranous ossification involves the direct conversion of skeletal stem and progenitor cells (SSPCs) into bone-forming osteoblasts. There are limited surgical methods to model this process in experimental mice. Here, we have improved upon a bone marrow injury model in mice to facilitate the study of bone repair via intramembranous ossification and to assess postnatal regulators of osteogenesis. This method is highly reproducible and user-friendly, and it allows temporal assessment of new bone formation in a short period (3-7 days post-injury) using micro-computed tomography (&#181;CT) and frozen section histology. Furthermore, the contributions of SSPCs and mature osteoblasts can be readily assessed using a combination of fluorescent reporter mice and this intramembranous bone marrow injury model. In clinical contexts, intramembranous bone formation is relevant for healing critical size defects, stabilized fractures, cortical defects, trauma from tumor resections, and joint replacements.

<meta charset="utf8"></head><body>منهجية محسنة لدراسة تكوين العظم بعد الولادة عن طريق التعظم الغشائي في نموذج إصابة نخاع عظم الفئران

The murine bone marrow injury model is a useful tool for studying postnatal osteogenesis through intramembranous ossification. This simplified surgical protocol describes the bone marrow ablation procedure for downstream assessment of new bone formation and cellular responses following injury.

منهجية محسنة لدراسة تكوين العظم بعد الولادة عن طريق التعظم الغشائي في نموذج إصابة نخاع عظم الفئران

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...

ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST