Wir erkennen die Unterstützung der NIH Zuschüsse R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation und das Hagey Labor für Pädiatrische Regenerative Medizin.

HINWEIS: Ethische Aussage: Alle Forschungs mit Wirbeltieren wurde nach Protokollen von der Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) zugelassen geführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Geben Sie 10 ml des im Handel erhältlichen Dichtegradienten Zellentrennmedium (das Polysaccharose und Natriumdiatrizoat enthält, auf eine Dichte von 1,077 g / ml eingestellt) auf RT in einem 50 ml konischen Röhrchen kommen. </li><li> Vorbereitung Durchflusszytometrie (FACS) mit Puffer 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 2% fötalem Kälberserum (FCS). Nehmen Sie ein 50 ml Aliquot und dieses aliquoten bei RT für den Einsatz zu halten während des Dichtegradienten Zelltrennmedien Schritt. </li><li> Haben Sie einen Eimer mit Eis bereit, isolierten Gewebe und Zellen in während der Isolierungsverfahren beizubehalten. </li></ol> 2. Bereiten Kultur Medien <ol><li> Vorbereitung Basalmedium: MEM (Minimal Essential Medium) ohne Phenolrot (500 ml), Glutamat (1x), FCS (10x), 10.000 Einheiten / ml Penicillin (1x). </li><li> Filtern Basalmedium mit einem 0,22 um-Filter. </li><li> Bereiten Knochenmark-Makrophagen-Induktionsmedien: <ol><li> Nehmen Sie 50 ml der in Schritt 2.1 vorbereitet Basalmedien. </li><li> In Prostaglandin E2 (PGE2, Herr 352,465 g / mol) bei 10 -7 M Endkonzentration. </li><li> Hinzufügen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) bei 10 ng / ml. </li><li> Nicht filtern die endgültige Lösung von Knochenmark-Makrophagen-stimulierende Medien. </li></ol></li><li> Bereiten Osteoklasten Induktionsmedien: <ol><li> Nehmen Sie 50 ml der in Schritt 2.1 vorbereitet Basalmedien. </li><li> In Prostaglandin E2 (PGE2, Herr 352,465 g / mol) bei 10 -7 M Endkonzentration </li><li> Hinzufügen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) bei 10 ng / ml. </li><li> Hinzufügen RANKL bei 10 ng / ml. </li><li> Nicht filtern die endgültige Lösung von Osteoklasten Induktionsmedien. </li></ol></li></ol> 3. Knochenmark-Isolation <ol><li> Euthanize einer C57BL / 6-Maus,Verwendung von Kohlendioxid Inhalationsverfahren, gefolgt durch zervikale Dislokation. HINWEIS: Nagetiere müssen von geschultem Personal mit geeigneten Technik, Ausrüstung und Agenten eingeschläfert werden. </li><li> Position und sichern Sie die Maus auf eine Dissektion Bord und Spray mit 70% Alkohol. </li><li> Präparieren Sie die Oberschenkelknochen, Schienbeine, Oberarmknochen und Wirbelsäule. <ol><li> Beginnen Sie mit der Maus in Rückenlage. Einen Einschnitt vertikal entlang der unteren Extremität und beginnen durch Sezieren entlang der Länge des Oberschenkelknochens und des Schienbeins durch Division Weichgewebe-Anhänge. Schließlich verrenken Knochen vom Knie und Hüftgelenk Knochen vollständig aus dem Skelett zu befreien. </li><li> Gehen Sie, um einen Einschnitt entlang der Länge der oberen Extremitäten, den Oberarmknochen zu isolieren machen. Verrenken den Humerus an der Schulter und Ellenbogengelenke durch Sezieren Weichgewebe Kapselansatz. </li><li> Schließlich drehen Sie die Maus über, so dass die Maus liegt auf dem Bauch. Machen Sie eine Hautschnitt entlang der Länge der Wirbelsäule, in der Mittellinie. Beachten Sie die paravertebralen WeichGewebe auf jeder Seite der Wirbelsäule und Einschnitt entlang der knöchernen Rand der Wirbelsäule, Sezieren durch die paravertebralen Weichgewebemasse. Mit einer Schere, einen horizontalen Schnitt über der Wirbelsäule an der Basis des Halses, und am Ende der Wirbelsäule, genau proximal zum Schwanz Insertion, die Befreiung der Wirbelsäule vom Weichteilbefestigung. </li></ol></li><li> Sobald die Knochen geerntet werden, halten sie in FACS-Puffer auf Eis. </li><li> Verwenden Sie Seidenpapier, um Muskeln und Weichteile von den Knochen zu reinigen. </li><li> Legen Sie die gereinigten Knochen in einen Mörser und Stößel mit 3 ml FACS-Puffer. </li><li> Crush die Knochen sanft im Stößel und Mörser. </li><li> Absaugen der blutigen Flüssigkeit und Überführung in eine 50 ml konischen Röhrchen, indem die Lösung durch ein 70 &amp; mgr; m Zellsieb. </li><li> 5 ml FACS-Puffer, um das zerkleinerte Knochen und weitere zerquetschen. Wieder, entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und Transfer zum 50 ml konischen Röhrchen durch einen 70 &amp; mgr; m Sieb. </li><li> Die Knochen twi Typischerweise zerquetschence zu dreimal in frischem FACS-Puffer mit einem Mörser und Stößel, jedes Mal Zugabe von weiteren 5 ml frischem FACS-Puffer, bis die Flüssigkeit hinterlässt keine Flecken rot. </li><li> Zentrifugieren des Knochenmarks Lösung bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C, um ein Zellpellet zu erhalten. </li></ol> 4. Gradiententrennung von Knochenmarkszellen <ol><li> Aspiration des Überstands und Resuspension in 10 ml FACS-Puffer (bei RT gehalten). </li><li> Nehmen Sie die 50 ml konischen Röhrchen, enthaltend 10 ml von im Handel erhältlichen Dichtegradienten Zelltrennmedium (RT). </li><li> Schicht die Knochenmark-Lösung auf den Dichtegradienten Zellseparationsmedium. Tun Sie dies langsam mit Hilfe eines elektrischen Pipette. Winkel der Pipettenspitze gegen die Innenfläche in der Nähe der Spitze der konischen Rohr und Neigung der konischen Rohr auf ca. 30 °. Eine langsame Geschwindigkeitseinstellung für die Pipette vorsichtig vertreiben die Knochenmarklösung, um nicht den Dichtegradienten Zelltrennungsmedium stören. HINWEIS: Letztlich wird essein eine klare Definition zwischen den beiden Lösungen (Mobillösung und Dichtegradienten Zellseparation Media-Lösung). </li><li> Mit einem RT Zentrifuge Zentrifugation der Dichtegradienten Zelltrennmedien und Zelllösung in einem ausgewogenen Zentrifuge bei 200 xg für 15 min. Darüber hinaus entfernen Beschleunigung und Verzögerung an der Zentrifuge, um eine ausreichende Phasentrennung zu gewährleisten mit der Dichtegradienten Zelltrennmedien Gradienten. </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen den bewölkten Mittelschicht, die die Knochenmarkzellen von Interesse enthält. </li><li> Übertragen diese Zellen in ein neues konisches Rohr. 20 ml zusätzliches FACS-Puffer (auf Eis gehalten), um die Zellen zu waschen. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C, um ein Zellpellet zu erhalten. </li><li> Resuspendieren die endgültige Zellpellet in 1 ml Makrophagen stimulierende Medien zur Zellzählung mit einer Zählkammer ermöglichen. </li></ol> 5. Zellzählung <ol><li> Nimm 10 &amp; mgr; l der Zelllösung und Mischenmit 10 ul Trypanblau. Last 10 ul der resultierenden Mischung auf einem Hämozytometer und erhalten die Zellzahl pro ml Lösung. </li></ol> 6. Zellkultur <ol><li> Platzieren 2 ml Makrophagen stimulierende Medium in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Hinzufügen 200.000 Zellen in jede Vertiefung. HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist zell Plattierungsdichte eine der wichtigsten Voraussetzungen für eine angemessene in vitro Kultivierung von Osteoklasten. </li><li> Die Platte und in einem regelmäßigen Inkubator behutsam schütteln bei 37 ° C. </li><li> Die Medien für 3 Tage nicht verändern. </li><li> Nach 3 Tagen in Makrophagen stimulierende Medien verändern die Medien, um Osteoklasten Medien. </li><li> Jenseits, ändern Sie die Medien täglich für 5-7 Tage, an welchem ​​Punkt, große, mehrkernige Osteoklasten sollte auf der Kulturplatte sichtbar sein. </li></ol> 7. Färbung mit Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) <ol><li> Nach 5-7 Tagen in vitro cultur, saugen Sie den Medien aus der Kultur gut. </li><li> Vorsichtig mit 1x PBS dreimal waschen Brunnen. </li><li> Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehydlösung und lassen für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Während dieser Zeit bereiten die TRAP-Färbung (das im Handel erhältlich ist) durch Vorwärmen auf 37 ° C. </li><li> Nach 1 Stunde in Para, absaugen Para und vorsichtig waschen 3 Mal mit 1x PBS. </li><li> 1 ml der vorgewärmten TRAP-Färbung in jedes Well der Platte zu gefärbt werden. </li><li> Die Platte wird in einem Brutschrank bei 37 ° C für 1 h, vor Licht geschützt. </li><li> Nach 1 Stunde, absaugen das TRAP-Färbung. </li><li> 3 mal mit vorgewärmten deionisiertem Wasser waschen die Vertiefungen geben. </li><li> Gegenfärbung der gut mit Gill Hämatoxylin (VORSICHT) für 1-2 min. </li><li> Bild Osteoklasten mit Hellfeldmikroskopie. </li><li> Waschen Vertiefungen mit entionisiertem Wasser, bis eine ausreichende Farbintensität des Flecks erreicht ist, typischerweise, wenn Kerne erscheinen Blue. </li></ol> 8. Osteoklasten Resorption Assay <ol><li> Verwenden Sie einen handelsüblichen 24-Well-Polystyrol-Kulturschale, die entweder mit Knochen Substrat oder einem anorganischen kristallinen Calciumphosphat-Beschichtung vorbeschichtet ist. </li><li> Platz 2 ml Makrophagen stimulierende Medien in jedes Well. </li><li> Hinzufügen 200.000 frisch isolierte Knochenmarkszellen am Ende von Schritt 2 zu jeder Vertiefung erhalten. </li><li> Die Platte behutsam schütteln vor dem Einlegen in einem Brutschrank bei 37 ° C für 3 Tage. </li><li> Am Tag 3 Verändern Sie die Medien, um die Differenzierung von Osteoklasten Medien. </li><li> Führen Sie täglich Medienwechsel mit Osteoklastendifferenzierung Medien für 5-7 Tage. </li></ol> 9. Quantifizierung von Osteoklasten Resorptionsaktivität <ol><li> Nach 5-7 Tagen der in vitro-Kultur in der Osteoklastendifferenzierungsmedien auf einem mineralisierten Substrats, analysieren die mineralisierten Oberfläche, wie nachstehend beschrieben, um die Fähigkeit von Osteoklasten zu bilden resorpti beurteilenauf Gruben, ein Indikator für die Osteoklasten-Aktivität. </li><li> Saugen Sie Medien aus dem Resorption Assayplatte und fügen Sie 100 ul 10% Bleichmittel-Lösung in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren der Zellen mit 10% Bleichmittel-Lösung für 15 min bei RT. </li><li> 3 mal mit destilliertem Wasser waschen die Vertiefungen geben. </li><li> Absaugen restliche Wasser und schütteln Sie überschüssiges Wasser von der Platte und an der Luft trocknen für 3-5 Std. </li><li> Gegenfärbung der Platte mit einem im Handel erhältlichen Von Kossa-Färbung Kit zur leichteren Visualisierung des nicht resorbiert Substrat zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Hellfeldmikroskopie, um Bilder von repräsentativen Teilen der resorbiert Fläche zu nehmen. </li><li> Mit Bildanalyse-Software, die Berechnung der Prozentanteil der resorbierten Oberfläche für die Quantifizierung der Osteoklasten Resorptionsaktivität ermöglichen. </li></ol>

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Keiner der Autoren hat Offenlegung oder Interessenkonflikt zu erklären.

Eine Fähigkeit, leicht zu isolieren und zu kultivieren eine große Zahl von Osteoklasten in vitro wurde für die Hilfe, Verständnis für Knochenbiologie und Osteoklasten-vermittelten Krankheiten voranzutreiben verantwortlich. Es war die Identifizierung von RANKL, die zu diesem führen, als es vor kurzem als Hauptregulator der Osteoklastenbildung, Differenzierung und das Überleben von 16 bis 18 identifiziert. Es ist unsere Erfahrung, dass die in vitro-Kultivierung</...

Knochenumbau ist dynamisch und umfasst die Kopplung von Knochenbildung mit Knochenresorption 1. Diese stark regulierten Prozess ist für die Aufrechterhaltung der Skelett während normaler Homöostase verantwortlich ist und in Reaktion auf eine Verletzung und Krankheit. Osteoklasten sind einzigartig, mehrkernige Zellen, die fähig resorbierenden sowohl die organischen und anorganischen Matrizen von Knochen sind. Osteoklasten sind aus der Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark 2-5 abgeleitet. Anomalien in der Funktion oder Bildung von Osteoklasten in einer Vielzahl von klinischen Erkrankungen, einschließlich gemeinsamer Erkrankungen wie Osteoporose führen. Die Fähigkeit, die Osteoklasten in vitro zu erzeugen hat signifikante Fortschritte im Verständnis von Knochen biology 6 erlaubt. Als Ergebnis werden neue therapeutische Mittel Schwellen Osteoklasten bedingten Krankheiten, die zur schweren Erkrankungen und Todesfälle verantwortlich sind, zu behandeln 7 </sup&gt;. Homöostatische Wartung der Knochenmasse und Kraft erfordert die konzertierte Aktion der knochenbildenden Osteoblasten und Knochen Osteoklasten 8,9. Knochenhomöostase ist in einer Reihe von Krankheiten, einschließlich postmenopausalen Osteoporose verändert, bei denen erhöhte Osteoklastenaktivität führt zu pathogenen Verlust von Knochenmasse und Dichte 10. Mit zunehmender Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen menschlicher Krankheiten gibt es mehr Möglichkeiten, um die Rolle der Osteoklasten in menschlichen Knochenerkrankung 11-13 entziffern. Zahlreiche Protokolle für Osteoklastenkulturverfahren werden in der Literatur, mit vielen Variationen beschriebene 9,12,14. Xing und Kollegen beschreiben ähnliche Methodik auf die nachstehend beschriebenen, in ihrer Beschreibung osteoclastogenic Assays von murinen Knochenmarkszellen Protokoll. Allerdings, um die Knochenmarkzellen nach langen Knochen Ernte freizugeben, Xing et al. Spülen Markhöhle mit α-MEM komplette Medien14. Catalfamo untersucht die Wirkung von Hyperglykämie auf die Osteoklastenfunktion und beschreibt ein Verfahren, bei denen alle Zellen von Knochenmark mobilisiert Spülung kultiviert für 24 Stunden, wobei an diesem Punkt die nicht-adhärenten Zellen werden verworfen, 12, auch eine Technik von Boyle et al . 9 Die zuvor veröffentlichten Protokollen erfordern die Durchführung der Spülung des Knochenmarks, eine mühsame Praxis, die führt auch das Risiko einer Nadelstichverletzung und den Verlust wertvoller Knochenmark, so muß man die beiden Enden des Knochens schneiden. Das Protokoll, das wir beschreiben, führt die Verwendung von Mörser und Pistill zu Osteoklasten zu isolieren, die ähnlich dem Verfahren von Weischenfeldt et al Makrophagen Isolation 15. Unsere Erfahrung ist jedoch, dass Osteoklasten Isolierung und in vitro-Kultur unter Verwendung von früher veröffentlichten Verfahren ergibt unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf die Osteoklasten-Produktion, was häufigin der Unfähigkeit, die Osteoklasten zu kultivieren. Daher haben wir ein Protokoll, das für die konsequente Trennung von Knochenmark der Maus eine große Anzahl von mehrkernigen Osteoklasten in vitro, mit einer ungefähren Ausbeute von 70-80% der Zellen anfänglich plattierten Form Makrophagen und Osteoklasten erzeugen kann anschließend in Gegenwart entwickelt, Osteoklasten Induktionsmedien.

<table><tbody><tr><td>MEM, no glutamine, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinant mouse</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; expressed)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, die von Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark abgeleitet sind. Ihrer einzigartigen Fähigkeit, sowohl die organischen und anorganischen Matrices von Knochen resorbieren, bedeutet, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Skelettumbau spielt. Gemeinsam sind Osteoblasten und Osteoklasten für die dynamische Kopplung Prozess, der sowohl die Knochenresorption und gemeinsam handeln, um den normalen Skelett während Gesundheit und Krankheit pflegen Knochenbildung beinhaltet verantwortlich. Als Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper, können Änderungen in der Osteoklastendifferenzierung oder Funktion in tiefgreifende Wirkungen im Körper führen. Krankheiten mit veränderter Osteoklasten-Funktion verbunden sind, können im Schweregrad von letalen neonatalen Erkrankung aufgrund eines Fehlers einen Markraum für Hämatopoese bilden reichen, um mehr häufigsten beobachteten Pathologien wie Osteoporose, bei denen eine übermäßige Knochenresorption durch Osteoklasten prädisponiert Formation zu brechen. ent &quot;&gt; Eine Fähigkeit, Osteoklasten in hoher Anzahl in vitro zu isolieren hat für bedeutende Fortschritte im Verständnis der Knochenumbauzyklus erlaubt und hat den Weg für die Entdeckung neuer therapeutischer Strategien, die Bekämpfung dieser Krankheiten geebnet. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu isolieren und zu kultivieren Osteoklasten aus Knochenmark der Maus, die eine große Zahl von Osteoklasten ergeben wird.

<html> Das Ziel dieses Verfahrens war die einfache Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten in vitro, typischerweise in einer Woche. Erfolgreiche Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten wurde mit Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung (1A) bestätigt. Große Osteoklasten werden als große, violette Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise ≥ 3 Kerne) visualisiert. Unter Verwendung dieses Protokolls ist es üblich, Osteoklasten mit nicht weniger als 30 Keime pro Osteokl...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

24.0K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine.  Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro. 

Serie: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Forschung

Krebsforschung

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Entwicklungsbiologie

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Immunologie und Infektion

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Biotechnik

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

Differenzierung und Charakterisierung von Osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

Abgrenzung funktioneller Osteoklasten von CD14+ Monozyten aus humanem peripherem Blut

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Verbessertes Modell für Knochenmarkverletzungsmodelle für intramembranöse Knochenreparaturstudien

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage template, the process of intramembranous ossification involves the direct conversion of skeletal stem and progenitor cells (SSPCs) into bone-forming osteoblasts. There are limited surgical methods to model this process in experimental mice. Here, we have improved upon a bone marrow injury model in mice to facilitate the study of bone repair via intramembranous ossification and to assess postnatal regulators of osteogenesis. This method is highly reproducible and user-friendly, and it allows temporal assessment of new bone formation in a short period (3-7 days post-injury) using micro-computed tomography (&#181;CT) and frozen section histology. Furthermore, the contributions of SSPCs and mature osteoblasts can be readily assessed using a combination of fluorescent reporter mice and this intramembranous bone marrow injury model. In clinical contexts, intramembranous bone formation is relevant for healing critical size defects, stabilized fractures, cortical defects, trauma from tumor resections, and joint replacements.

<meta charset="utf8"></head><body>Verbesserte Methodik zur Untersuchung der postnatalen Osteogenese durch intramembranöse Ossifikation in einem murinen Knochenmarkverletzungsmodell

The murine bone marrow injury model is a useful tool for studying postnatal osteogenesis through intramembranous ossification. This simplified surgical protocol describes the bone marrow ablation procedure for downstream assessment of new bone formation and cellular responses following injury.

Verbesserte Methodik zur Untersuchung der postnatalen Osteogenese durch intramembranöse Ossifikation in einem murinen Knochenmarkverletzungsmodell

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

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