우리는 NIH 보조금 R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, 오크 재단과 소아 재생 의학 Hagey 연구소의 지원을 인정합니다.

참고 : 윤리 문 : 척추 동물을 포함한 모든 연구가 실험 동물 관리에 스탠포드 행정 패널 (APLAC)의 승인에 따라 프로토콜을 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 10 ㎖ 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 RT에 와서 (polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 포함 1.077 g / ㎖의 밀도로 조정) 허용. </li><li> 유동 세포 계측법 준비 (FACS)는 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 버퍼. 50 mL를을 가지고 밀도 구배 세포 분리 매체 단계에서 사용하기 위해 RT에서이 나누어지는을 유지한다. </li><li> 분리 절차를 수행하는 동안 격리 된 조직과 세포를 유지 할 준비가 얼음 양동이를 가지고있다. </li></ol> 2. 문화 매체 준비 <ol><li> 기저 미디어를 준비합니다 MEM (최소 필수 중간), 페놀 레드 (500 ㎖), 글루타민산 (1X)하지 않고, FCS를 (10 배), 10,000 단위 / ㎖ penicilliN (1X). </li><li> 0.22 μm의 필터를 기저 미디어를 필터링합니다. </li><li> 골수 대 식세포 유도 매체를 준비합니다 <ol><li> 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여. </li><li> 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / 몰)를 추가합니다. </li><li> 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다. </li><li> 미디어를 자극 골수 대 식세포의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오. </li></ol></li><li> 파골 세포 유도 매체를 준비합니다 <ol><li> 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여. </li><li> 추가 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / mol)의 </li><li> 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다. </li><li> 10 ng를 / ㎖에서 RANKL을 추가합니다. </li><li> 파골 세포 유도 매체의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 3. 골수 격리 <ol><li> 한 C57BL / 6 마​​우스를 안락사경추 탈구이어서 이산화탄소 흡입 방법을 사용. 참고 : 설치류가 적절한 기술, 장비 및 에이전트를 사용하여 훈련받은 사람이 안락사해야합니다. </li><li> 위치 해부 보드에 마우스를 확보하고 70 % 알코올을 스프레이. </li><li> 대퇴골, 경골, 상완골 (humeri)과 척추를 해부하다. <ol><li> 앙와위에서 마우스로 시작합니다. 수직으로 하체를 따라 절개를하고 연부 조직 첨부 파일을 분할하여 대퇴골과 경골의 길이를 따라 절개로 시작합니다. 마지막으로, 골격에서 완전히 뼈를 확보하기 위해 무릎과 엉덩이 관절에서 뼈가 탈구. </li><li> 상완골을 분리하는 상지의 길이를 따라 절개를 진행합니다. 연부 조직 피막 첨부 파일을 해부하여 어깨와 팔꿈치 관절에서 상완골 탈구. </li><li> 마우스는 경향이있다 그래서 마지막으로, 위에 마우스를 켭니다. 정중선에서, 척추의 길이 방향을 따라 피부를 절개를. paravertebral 소프트를 관찰paravertebral 부드러운 조직 덩어리를 해부 척추의 뼈 가장자리를 따라 척추와 째다의 각면에 조직. 가위 사용하여 목의 기지에서 척추에 걸쳐 수평 절단을하고, 연부 조직의 첨부 파일에서 척추를 자유롭게 척추, 꼬리 삽입에 바로 인접의 끝에서. </li></ol></li><li> 뼈가 수확되면, 얼음에 FACS 버퍼에 보관하십시오. </li><li> 뼈에서 근육과 연부 조직을 청소하는 조직의 용지를 사용하십시오. </li><li> FACS 버퍼의 3 ㎖와 봉과 박격포로 청소 뼈를 놓습니다. </li><li> 봉과 박격포 부드럽게 뼈를 분쇄. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 전달하여 50 ML 원뿔 튜브에 피 묻은 액체 및 전송 대기음. </li><li> 5 ml의 FACS가 짓 눌린 뼈에 버퍼와 더 호감을 추가합니다. 다시 말하지만, 피펫을 사용하여 유체를 제거하고 70 μm의 스트레이너를 통해 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 뼈 트위어 호감신선한 FACS 완충액에서 세 번, 유체가 적색 착색되지 않을 때까지, 박격포와 유, 신선한 FACS 완충액 5 mL를 추가로 첨가 할 때마다 사용하는 가전. </li><li> 세포 펠렛을 수득 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에 골수 용액을 원심 분리기. </li></ol> 골수 세포의 분리 4. 그라디언트 <ol><li> FACS 완충액 10ml에 상청에 resuspend 대기음 (RT로 유지). </li><li> 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 (RT) 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 타고. </li><li> 밀도 구배 세포 분리 매체로 골수 용액을 층을 포함한다. 천천히 전기 피펫을 사용하여이 작업을 수행합니다. 각 피펫 원뿔 튜브의 상단에있는 내부 표면에 대한 팁과 약 30 °의 원뿔형 튜브를 기울이십시오. 밀도 구배 세포 분리 매체를 방해하지 않도록 피펫에 느린 속도 설정을 사용하여 부드럽게 골수 용액 추방. 참고 : 궁극적으로있을 것이다두 솔루션 (휴대폰 솔루션 및 밀도 구배 세포 분리 미디어 솔루션) 사이의 명확한 정의합니다. </li><li> RT 원심 분리기를 사용하여, 15 분 동안 200 XG에서 평형 원심 밀도 구배 세포 분리 매체 및 세포 용액을 원심 분리기. 또한, 밀도 구배 세포 분리 미디어 구배를 사용하여 적절한 상분리되도록 원심 분리기에 가속 및 감속을 제거한다. </li><li> 원심 분리 후, 관심있는 골수 세포를 포함 흐린 중간층을 대기음. </li><li> 새로운 원뿔 튜브에이 세포를 전송합니다. 세포를 씻어 (얼음에 보관) 추가 FACS 버퍼의 20 ML을 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 세포 펠렛을 얻었다. </li><li> 혈구 세포를 사용하여 계산을 허용하기 위해 미디어를 자극 식세포의 1 ㎖의 최종 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 5. 셀 카운팅 <ol><li> 세포 용액 10 μl를 타고 혼합트리 판 블루 10 μL와. 로드 결과 믹스의 10 μL 혈구 상 및 솔루션 1 ㎖ 당 세포 수를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 6. 세포 배양 <ol><li> 24 웰 플레이트의 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 20 만 셀을 추가합니다. 참고 : 우리의 경험에 의하면, 세포 도금 밀도는 파골 세포의 체외 배양에 적절한의 가장 중요한 요구 사항 중 하나입니다. </li><li> 조심스럽게 37 ° C에서 일반 인큐베이터에서 플레이트와 장소를 선동. </li><li> 3 일 동안 미디어를 변경하지 마십시오. </li><li> 대 식세포 자극 미디어 3 일 후, 파골 세포의 미디어에 미디어를 변경합니다. </li><li> 이하, 지점, 큰, 다핵 파골 세포가 배양 용기에 표시해야하는 5~7일, 매일 미디어를 변경합니다. </li></ol> 7. 염색 주석 산염 내성 산성 인산 가수 분해 효소 (TRAP) <ol><li> 체외 막 다른 5-7 일 후스트럭처는 물론 문화 미디어를 대기음. </li><li> 1X PBS로 3 회 부드럽게 우물을 씻으십시오. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 첨가하여 세포를 고정시키고 39 ° C에서 1 시간 방치. </li><li> 이 시간 동안, 37 ° C로 사전 온난화로 (시판) TRAP 염색을 준비합니다. </li><li> 파라 포름 알데히드에서 1 시간 후, 파라 포름 알데히드를 대기음 및 1X PBS로 부드럽게하는 과정을 3 회 반복한다. </li><li> 플레이트의 각 웰에 미리 예열 TRAP 염색의 1 ML을 추가하는 것은 스테인드합니다. </li><li> 차광 1 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li><li> 1 시간 후, TRAP 염색을 대기음. </li><li> 예열 탈 이온수로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 1-2 분 길의 헤 마톡 실린 (주)와 잘 Counterstain과. </li><li> 명 시야 현미경을 사용하여 이미지 파골. </li><li> 얼룩의 적절한 색상 강도까지 탈 이온수로 우물을 씻어 핵 블루 나타나는 일반적으로 할 때, 달성전자. </li></ol> 8. 파골 세포의 흡수 분석 <ol><li> 뼈 기판 또는 무기 성 칼슘 포스페이트 코팅 중 미리 코팅 인 시판의 24 웰 폴리스티렌 배양 접시를 사용한다. </li><li> 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 2 단계의 단부에서 얻어진 200,000 갓 절연 골수 세포를 추가한다. </li><li> 부드럽게 3 일 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 전에 플레이트를 교반. </li><li> 3 일에서 파골 세포의 분화 미디어에 미디어를 변경합니다. </li><li> 5-7일에 대한 파골 세포의 분화 미디어와 매일 미디어 변경을 수행합니다. </li></ol> 파골 세포의 흡수 활동 9. 정량화 <ol><li> 후술하는 바와 같이 광물 기판 파골 세포 분화 배지에서 체외 배양 5-7 일 후, resorpti 형성 파골 세포의 능력을 평가하기 위해, 광물 표면을 분석구덩이, 파골 세포의 활동의 지표에. </li><li> 재 흡수 분석 플레이트에서 대기음 미디어와 각 웰에 10 % 표백제 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 15 분 동안 10 % 표백제 용액으로 세포를 인큐베이션. </li><li> 증류수로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 남아있는 물을 대기음 판에서 여분의 물을 흔들어 3-5 시간 동안 자연 건조 할 수 있습니다. </li><li> 시중에서 판매하는 폰 코사 염색 키트와 함께 접시 Counterstain과 해제 흡수 된 기판을 쉽게 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 흡수 된 표면의 대표 부품의 이미지를 취할 밝은 필드 현미경을 사용합니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 파골 세포의 재 흡수 활성의 정량화를 허용하도록 흡수 된 표면의 백분율을 계산한다. </li></ol>

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저자 중에 선언하는 공개 또는 이해 상충이 없습니다.

쉽게 체외에서 파골 세포의 큰 숫자를 분리하고 배양 할 수있는 능력은 뼈 생물학 및 파골 세포 - 매개 질환의 이해를 전진하는 데 도움에 대한 책임이있다. 이는 최근 파골 세포 분화, 분화 및 생존 16-18의 주요 조절로 확인되었다 때,이 이어질 RANKL의 식별이었다. 그것은 골수에서 파골 세포의 체외 배양은 파종 밀도에 크게 의존하는 우리의 경험이었다....

뼈의 리모델링은 동적이며 골 흡수 1 골 형성의 커플 링을 수반한다. 이 엄격하게 규제 과정은 정상적인 항상성 동안 골격을 유지할 책임이 있으며, 부상 및 질병에 대응. 파골 세포는 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수 할 수있는 고유 한 다핵 세포이다. 파골 세포는 골수 2-5의 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생됩니다. 파골 세포의 기능 또는 형성에 이상이 골다공증과 같은 일반적인 조건을 포함 임상 병리의 다양한 발생할 수 있습니다. 체외에서 파골 세포를 생성하는 기능은 뼈 생물학 (6)에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 결과적으로, 새로운 치료제 7 상당한 이환율 및 사망률을 담당 파골 세포 관련 질환을 치료하기 위해 대두되고 </s&gt;까지. 뼈 질량과 강도의 항상성 유지는 뼈 형성 조골 세포와 뼈 재 흡수 파골 세포 8,9의 공동 행동이 필요합니다. 골 항상성이되는 파골 세포 활성은 골 질량 및 밀도 10 병원성 손실에 이르게 증가, 폐경 후 골다공증을 포함한 질병의 숫자로 변경된다. 인간 질병의 형질 전환 생쥐 모델의 유용성을 증가함에 따라, 인간의 골 질환 11-13에서 파골 세포의 역할을 해독 할 기회가 더있다. 많은 변화가 9,12,14 설명과 파골 세포 배양 기술에 대한 다수의 프로토콜은 문학에 나타납니다. 싱 연구팀은 쥐의 골수 세포에서 osteoclastogenic 분석의 자신의 설명에, 아래에 설명 된 프로토콜과 유사한 방법을 설명합니다. 그러나 긴 뼈 수확 다음의 골수 세포를 분리, 싱 등. α-MEM 전체 미디어와 골수 캐비티를 플러시14. Catalfamo은 파골 세포 기능에 고혈당증의 효과를 검사하고있는 모든 세포가 골수 플러싱 동원하는 방법이되는 비 - 부착 세포는 12 폐기된다 가리, 24 시간 동안 배양 설명도 보일 등에 의해 사용되는 기술 . (9)이 사전에 발행 프로토콜은 하나의 뼈의 양 단부를 절단해야으로서도, 바늘 스틱 부상 귀중한 골수의 손실 위험을 도입 골수, 지루한 연습, 플러싱의 연습을 필요로한다. 우리가 설명 프로토콜은 Weischenfeldt 등에 의해 기술 된 대 식세포의 분리 방법과 유사한 파골 세포를 분리하기 박격포와 유의 사용을 구현한다. 15 우리의 경험은, 그러나, 종종 그 결과, 파골 세포 생산의 관점에서 가변 결과 이전에 출판 된 기법을 사용하여 그 결과 파골 분리 및 체외 배양이며무능력에서 파골 세포를 배양합니다. 따라서, 우리의 존재, 초기 식세포이어서 파골 세포 형성 도금 셀 70-80 %로 약 수율로 시험관 내에서 다핵 파골 세포의 다수 생산하는 마우스 골수의 일관된 분리를 허용하는 프로토콜을 고안 파골 세포 유도 매체.

<table><tbody><tr><td>MEM, no glutamine, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinant mouse</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; expressed)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> 파골 세포는 골수 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생 된 고도로 전문화 된 세포이다. 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수하는 이들의 독특한 능력은 골 리모델링을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것을 의미한다. 함께, 조골 세포 및 파골 세포는 골 흡수 및 건강과 질병 중에 정상 골격을 유지하기 위해 함께 작용하는 골 형성을 모두 포함 동적 커플 링 프로세스에 대한 책임이있다. 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포로, 파골 세포의 분화 또는 기능의 변화는 몸에 심각한 영향을 초래할 수 있습니다. 변경된 파골 세포의 기능과 관련된 질환은 더 일반적으로 과도한 파골 세포의 골 흡수가 형성 골절에 걸리기 쉽게하는 골다공증 등의 병변을 관찰하기 때문에 조혈위한 골수 공간을 형성하기 위해 실패에 치명적인 신생아 질병 심각도에 다양합니다. ENT &quot;&gt; 체외에서 높은 숫자 파골 세포를 분리하는 능력은 뼈의 리모델링주기의 이해에 상당한 발전을 허용하고이 질병에 대처 새로운 치료 전략의 발견을위한 도로를 포장하고있다. 여기, 우리는 분리와 파골 세포의 큰 숫자를 얻을 것입니다 마우스 골수에서 파골 세포를 배양 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

<html> 이 방법의 목적은 쉽게 일주 전형적, 시험관 내에서 파골 세포의 다수를 분리 하였다. 파골 세포의 다수의 성공적인 분리가 타르트 레이트 저항성 산성 포스파타제 염색 (도 1A)를 사용하여 확인 하였다. 큰 파골 세포는 여러 개의 핵 (일반적으로 ≥ 3 핵)와 큰 보라색의 세포로 시각입니다. 이 프로토콜을 이용하여, 파골 세포 당 30 개의 핵 (도 1b)와 파골 세포를 ...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

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24.0K 조회수.  Stanford University School of Medicine.  파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다. 

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Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

연구

암 연구학

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

발생학

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

면역학 및 감염병학

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

생체공학

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

기능성 파골세포와 인간 말초 혈액 CD14+ 단핵구의 분화

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>골수내 뼈 수리 연구를 위한 개선된 골수 손상 모델

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage template, the process of intramembranous ossification involves the direct conversion of skeletal stem and progenitor cells (SSPCs) into bone-forming osteoblasts. There are limited surgical methods to model this process in experimental mice. Here, we have improved upon a bone marrow injury model in mice to facilitate the study of bone repair via intramembranous ossification and to assess postnatal regulators of osteogenesis. This method is highly reproducible and user-friendly, and it allows temporal assessment of new bone formation in a short period (3-7 days post-injury) using micro-computed tomography (&#181;CT) and frozen section histology. Furthermore, the contributions of SSPCs and mature osteoblasts can be readily assessed using a combination of fluorescent reporter mice and this intramembranous bone marrow injury model. In clinical contexts, intramembranous bone formation is relevant for healing critical size defects, stabilized fractures, cortical defects, trauma from tumor resections, and joint replacements.

<meta charset="utf8"></head><body>쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

The murine bone marrow injury model is a useful tool for studying postnatal osteogenesis through intramembranous ossification. This simplified surgical protocol describes the bone marrow ablation procedure for downstream assessment of new bone formation and cellular responses following injury.

쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

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