Мы признаем поддержку грантов НИЗ R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, Фонда Дуб и Hagey лаборатории детской регенеративной медицины.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этические заявление: Все исследования с участием позвоночных животных проводили в протоколах соответствии утвержденным Административным панели Стэнфордского на лабораторных животных (APLAC). 1. Подготовка <ol><li> Разрешить 10 мл коммерчески доступного разделения градиент плотности клеток средах (который содержит polysucrose и натрия диатризоат, доводили до плотности 1,077 г / мл), чтобы прийти к комнатной температуре в 50 мл коническую пробирку. </li><li> Подготовьте проточной цитометрии (FACS) буфер с 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Берут 50 мл аликвоты и поддерживать эту аликвоту при КТ в течение использования во время разделения клеток медиа-ступенчатым градиентом плотности. </li><li> Есть ведро льда, готового поддерживать изолированную ткань и клетки в ходе процедуры изоляции. </li></ol> 2. Подготовка питательных сред <ol><li> Подготовьте базальную носитель: MEM (минимальной поддерживающей среде), без фенолового красного (500 мл), глутамат (1x), FCS (10x), 10000 ед / мл penicilliн (1x). </li><li> Фильтр базальной среды с 0,22 мкм фильтр. </li><li> Подготовка кости индукции макрофагов мозга СМИ: <ol><li> Возьмем 50 мл базальных средах, полученного на стадии 2.1. </li><li> Добавить простагландина Е2 (ПГЕ2, н 352,465 г / моль) при 10 -7 М конечной концентрации. </li><li> Добавить макрофагов колониестимулирующий фактор (M-CSF) в 10 нг / мл. </li><li> Не фильтровать окончательное решение макрофагов костного мозга стимулирующее СМИ. </li></ol></li><li> Подготовка остеокластов индукции СМИ: <ol><li> Возьмем 50 мл базальных средах, полученного на стадии 2.1. </li><li> Добавить простагландина Е2 (ПГЕ2, н 352,465 г / моль) при 10 -7 М конечной концентрации </li><li> Добавить макрофагов колониестимулирующий фактор (M-CSF) в 10 нг / мл. </li><li> Добавить RANKL в концентрации 10 нг / мл. </li><li> Не фильтровать окончательное решение индукции остеокластов СМИ. </li></ol></li></ol> 3. костного мозга Изоляция <ol><li> Усыпить один C57BL / 6 мышьс помощью метода ингаляции углерода диоксид, а затем смещением шейных позвонков. ПРИМЕЧАНИЕ: Грызуны должны быть умерщвлены обученным персоналом с использованием соответствующего техника, оборудование и средства. </li><li> Положение и обеспечить мышью на рассечение борту и спрей с 70% спиртом. </li><li> Рассеките из бедренных костей, голени, плечевые кости и позвоночник. <ol><li> Начните с мышью в положении лежа на спине. Сделать надрез вертикально вдоль нижней конечности и начинают путем рассечения вдоль длины бедра и голени путем деления вложения мягких тканей. Наконец, вывихнуть кости от колена и тазобедренного сустава, чтобы освободить кости полностью из скелета. </li><li> Продолжить, чтобы сделать разрез по длине верхней конечности, чтобы изолировать плечевую кость. Вывихнуть плечевой кости в плече и локтевых суставов рассечением мягких привязанность ткани капсульный. </li><li> Наконец, поверните курсор, так что мышь лежит склонны. Делают разрез кожи по всей длине позвоночника, по средней линии. Соблюдайте паравертебральная мягкаяткани на каждой стороне позвоночника и надрезать вдоль костной краю позвоночника, рассечения через паравертебрального массы мягких тканей. С использованием ножниц, сделать горизонтальный разрез через позвоночника у основания шеи, и в конце позвоночника, всего проксимальнее вставки хвоста, освобождая позвоночник от прикрепления мягких тканей. </li></ol></li><li> После того, как кости собирают, держать их в FACS буфера на льду. </li><li> Используйте тонкую бумагу, чтобы очистить мышцы и мягкие ткани от костей. </li><li> Поместите очищенные кости в ступке с помощью пестика с 3 мл FACS буфера. </li><li> Измельчите косточки мягко в ступке с помощью пестика. </li><li> Отберите у окровавленной жидкости и передачи в 50 мл коническую трубку с помощью пропускания раствора через ячейки фильтра 70 мкм. </li><li> Добавить 5 мл FACS буфера для измельченного кости и сокрушить дальше. Опять же, удалить жидкость с помощью пипетки и передать в 50 мл коническую пробирку через 70 мкм сито. </li><li> Обычно раздавить TWI костиCE-три раза в свежем буфере FACS, используя ступку и пестик, каждый раз, добавив еще 5 мл свежего буфера FACS, пока жидкость не не окрашивает в красный цвет. </li><li> Центрифуга решение костного мозга при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С с получением осадок клеток. </li></ol> 4. Градиент Разделение клеток костного мозга <ol><li> Аспирата супернатант и ресуспендируют в 10 мл FACS буфера (выдерживают при комнатной температуре). </li><li> Возьмем 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл коммерчески доступного разделения градиент плотности клеток средах (RT). </li><li> Слой раствора костного мозга на разделительной ячейки СМИ градиента плотности. Делайте это медленно с помощью электрического пипетки. Угол наконечник пипетки к внутренней поверхности в верхней части конической трубе и наклона конической трубе до приблизительно 30 °. Использование медленный скоростной режим на пипетки, аккуратно изгнать решение костного мозга, чтобы не нарушить разделения клеток СМИ градиента плотности. ПРИМЕЧАНИЕ: В конечном итоге там будетбыть четкое определение между двумя решениями (сотовых решений и плотность разделения градиент клеток решений СМИ). </li><li> С помощью центрифуги RT, центрифугировать носитель разделения клеток в градиенте плотности и раствор клеток в сбалансированном центрифуге при 200 х г в течение 15 мин. Кроме того, удалить ускорение и замедление на центрифуге, чтобы обеспечить адекватное разделение фаз с помощью разделения клеток медиа градиент в градиенте плотности. </li><li> После центрифугирования аспирации от мутного средний слой, который содержит клетки костного мозга, представляющих интерес. </li><li> Передача этих клеток в новую коническую трубку. Добавить 20 мл дополнительного буфера FACS (держали на льду), чтобы промыть клетки. </li><li> Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С с получением осадок клеток. </li><li> Ресуспендируют осадок клеток окончательное в 1 мл макрофагов стимулирующего средства массовой информации, чтобы позволить для подсчета клеток с помощью гемоцитометра. </li></ol> 5. Сотовый Подсчет <ol><li> Принимать по 10 мкл раствора и смешать клеткис 10 мкл трипанового синего. Нагрузка 10 мкл полученной смеси на гемоцитометре и получить число клеток на мл раствора. </li></ol> 6. культивирования клеток <ol><li> Поместите 2 мл макрофагов стимулирования среды в каждую лунку 24-луночного планшета. </li><li> Добавить 200000 клеток в каждую лунку. ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, плотность клеток-покрытие является одним из наиболее важных требований, предъявляемых к адекватным в пробирке культивирования остеокластов. </li><li> Аккуратно агитировать тарелку и поставить в регулярной инкубаторе при температуре 37 ° С. </li><li> Не изменяйте СМИ в течение 3 дней. </li><li> После 3-х дней в макрофагов стимулирования СМИ, изменения носителя остеокластов СМИ. </li><li> Далее измените носитель в день в течение 5-7 дней, после чего, большие, многоядерные остеокласты должны быть видны на планшет для культивирования. </li></ol> 7. Окрашивание тартрат Устойчив кислота фосфатазы (TRAP) <ol><li> Через 5-7 дней в пробирке кульры, аспирация СМИ от культуры хорошо. </li><li> Вымойте скважин осторожно 1X PBS три раза. </li><li> Зафиксировать клетки путем добавления 4% -ного раствора параформальдегида и оставить на 1 ч при 4 ° С. </li><li> В течение этого времени, подготовить ловушки пятно (который коммерчески доступен) путем предварительного нагрева до 37 ° С. </li><li> После 1 часа в параформальдегиде, аспирация от количества формальдегида и мыть осторожно 3 раза 1x PBS. </li><li> Добавить 1 мл подогретого TRAP пятно в каждую лунку пластины для окрашенных. </li><li> Место пластины в термостате при температуре 37 ° С в течение 1 часа, экранированной от света. </li><li> После 1 часа, аспирация от ловушки пятно. </li><li> Вымойте лунки 3 раза с подогретым деионизированной воды. </li><li> Контрастное колодца гематоксилином Гилла (ВНИМАНИЕ) в течение 1-2 мин. </li><li> Остеокластов изображение, используя яркий микроскопии. </li><li> Промыть лунки с деионизированной водой до тех пор, адекватной интенсивности цвета пятно достигается, как правило, когда ядра появляются BLUе. </li></ol> 8. остеокластов Резорбция Пробирной <ol><li> Используйте имеющийся в продаже 24-а полистирол культуры блюдо, которое предварительно наносят либо костной основы или неорганического кристаллического фосфата кальция покрытием. </li><li> Поместите 2 мл макрофагов стимулирования сред в каждую лунку. </li><li> Добавить 200000 свежеизолированных клетки костного мозга, полученные в конце стадии 2, в каждую лунку. </li><li> Аккуратно перемешивать пластину перед помещением его в термостате при 37 ° С в течение 3-х дней. </li><li> На 3-й день, изменения носителя остеокластов дифференцировки. </li><li> Выполните ежедневные изменения медиа с остеокластов дифференцировки в течение 5-7 дней. </li></ol> 9. Количественная оценка остеокластов резорбции деятельности <ol><li> Через 5-7 дней культуры в остеокластов дифференцировки на минерализованной подложки в пробирке, анализировать минерализованной поверхности, как описано ниже, для оценки способности остеокластов с образованием resorptiна ямах, индикатор активности остеокластов. </li><li> Аспирируйте СМИ от резорбции планшета для анализа и добавить 100 мкл 10% раствора хлорной извести в каждую лунку. </li><li> Инкубируйте клетки с 10% -ным раствором хлорной извести в течение 15 мин при комнатной температуре. </li><li> Промыть лунки 3 раза дистиллированной водой. </li><li> Аспирируйте от оставшуюся воду и стряхните воду с плиты и дайте высохнуть на воздухе в течение 3-5 часов. </li><li> Контрастное пластины с коммерчески доступной Von Kossa окрашивания комплекта для обеспечения более легкого визуализации оон-рассасывается подложки. </li><li> Используйте яркий микроскопии для получения изображений представительных частей резорбированной поверхности. </li><li> Использование программного обеспечения для анализа изображений, вычислить процент резорбированной поверхности, чтобы позволить для количественного определения активности остеокластов резорбтивного. </li></ol>

<ol>
	<li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption:+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit.">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue.">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li><li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells.">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li><li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes.">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast.">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bench+to+bedside:+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab.">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li><li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast.">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li><li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+OPG/RANKL/RANK+system.">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li><li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss.">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology.">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li><li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget's+Disease+of+Bone.">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li><li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function.">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li><li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD/SCID+IL-2Rgamma(null)+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies.">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells.">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand.">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function.">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li><li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism.">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li><li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease.">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li><li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+osteoclast+function.">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts.">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li><li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interleukin-6,+osteoclastogenesis,+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor.">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li><li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+among+cells+of+bone,+immune+system,+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases.">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., &amp; developmental immunology. 2013, (2013).</li><li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer.">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., &amp; oncology. 11, 134-143 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases.">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li></ol>

Ни один из авторов не имеет раскрытие или конфликт интересов объявлять.

Возможность легко изолировать и вырастить большое количество остеокластов в пробирке был ответственен за помощь для углубления понимания биологии кости и остеокластов-опосредованных заболеваний. Это было определение RANKL, что приведет к этому, когда он был недавно идентифициров?...

Костного ремоделирования является динамичным и включает муфту формирования костей с костной резорбции 1. Это жестко регулируется процесс отвечает за поддержание скелет в нормальном гомеостаза, и в ответ на повреждение и болезни. Остеокласты уникальны, многоядерные клетки, которые способны к резорбции как органические, так и неорганические матрицы кости. Остеокласты выводятся из моноцитов / макрофагов костного мозга 2-5. Отклонения в функции или образованием остеокластов может привести в различных клинических патологий, в том числе общих заболеваний, как остеопороз. Способность генерировать остеокластов в пробирке позволило значительному прогрессу в нашем понимании кости биологии 6. В результате, новые терапевтические агенты для лечения возникающих остеокластов, связанные с заболеваниями, которые ответственны за значительных заболеваний и смертности 7 </sдо&gt;. Гомеостатическое поддержание костной массы и силы требует согласованных действий формирования костной остеобластов и костей резорбции остеокластов 8,9. Гомеостаза кости изменяется в ряде заболеваний, в том числе постклимактерического остеопороза, в которой увеличена активность остеокластов приводит к патогенным потери костной массы и плотности 10. С увеличением доступности трансгенных мышиных моделях заболеваний человека, есть еще возможность расшифровать роль остеокластов в человеческой болезни костей 11-13. Многочисленные протоколы методов остеокластов культивирования появляются в литературе, с много вариантов описано 9,12,14. Син и его коллеги описывают аналогичную методику с протоколом, описанным ниже, в их описании osteoclastogenic анализов из мышиных клеток костного мозга. Тем не менее, чтобы освободить клетки костного мозга следующие урожая длинных костей, Син и др. Промывать полость костного мозга с α-MEM полной среде14. Catalfamo исследован эффект гипергликемии на функцию остеокластов и описывает способ, в котором все клетки мобилизовали путем промывки костного мозга культивировали в течение 24 ч, после чего неадгезивные клетки отбрасывали 12, техника также используется Бойл и др . 9 Эти ранее опубликованные протоколы требуют практику промывки костный мозг, утомительной практики, которая также вводит риск травмы иглой и потере ценного костного мозга, как надо отрезать оба конца кости. Протокол, который мы описываем, реализует использование в ступке с пестиком, чтобы изолировать остеокласты, который подобен способу, описанному макрофагов изоляции по Weischenfeldt и др. 15 Наш опыт, однако, является то, что изоляция остеокластов и в культуре пробирке, используя ранее опубликованные методы результаты в переменных результатов с точки зрения производства остеокластов, что часто приводитв неспособности развивать остеокластов. Таким образом, мы разработали протокол, который позволяет для последовательного выделения из костного мозга мыши, чтобы получить большое количество многоядерных остеокластов в пробирке, с приблизительной выходом 70-80% клеток, первоначально плакированных формирования макрофаги и впоследствии остеокласты, в присутствии индукционные остеокластов СМИ.

<table><tbody><tr><td>MEM, no glutamine, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinant mouse</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; expressed)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Остеокласты высоко специализированные клетки, которые являются производными от моноцитов / макрофагов костного мозга. Их уникальная способность поглощать как органические, так и неорганические матрицы кости означает, что они играют ключевую роль в регуляции скелетных ремоделирования. Вместе остеобласты и остеокласты отвечают за динамического процесса связи в который вовлечены и резорбции кости и образование костной ткани, действующее вместе для поддержания нормального скелета во время здоровья и болезни. В качестве основного клетки костной резорбции в организме, изменение остеокластов дифференциации или функции может привести к глубоким эффектов в организме. Заболевания, связанные с измененной функции остеокластов может изменяться в тяжести от смертельной заболевания у новорожденных из-за отказа сформировать пространство мозга для кроветворения, чтобы чаще наблюдается патологий, таких как остеопороз, в котором чрезмерное остеокластов резорбции кости предрасполагает к разрушению образования. ЛОР &quot;&gt; Возможность изолировать остеокластов в больших количествах в лабораторных позволило добиться значительных успехов в понимании цикла костного ремоделирования и проложил путь для открытия новых терапевтических стратегий, борьбе с этими заболеваниями. Здесь мы опишем протокол для изоляции и культивировать остеокластов из костного мозга мыши, который будет давать большое число остеокластов.

<html> Цель этого метода было легко изолировать большое число остеокластов в пробирке, как правило, в течение одной недели. Успешное выделение большого количества остеокластов была подтверждена с помощью тартрат устойчивостью кислую фосфатазу окрашивание (фиг.1А). Большие о...

Watch this Scientific Journal Video about Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Остеокласты основной клеток костного резорбции в организме. Возможность изолировать остеокластов в больших количествах привело к значительному прогрессу в понимании остеокластов биологии. В этом протоколе, мы опишем метод для изоляции, культивирования и количественного активность остеокластов в пробирке.

Остеокластов Вывод из костного мозга мыши

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

24.0K Views.  Stanford University School of Medicine.  Остеокласты основной клеток костного резорбции в организме. Возможность изолировать остеокластов в больших количествах привело к значительному прогрессу в понимании остеокластов биологии. В этом протоколе, мы опишем метод для изоляции, культивирования и к...

Video: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cancer Research

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Стимуляция Signaling Notch у мышей предшественников остеокластов

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Developmental Biology

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

На основе RANKL остеокластов культуры Assay из мыши костного расследовать роль mTORC1 в формировании остеокластов

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Immunology and Infection

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Биологическая совместимость профиль на биоматериалов для костной регенерации

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Bioengineering

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

Дифференцировка и характеристика остеокластов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

Дифференциация функциональных остеокластов из CD14+ моноцитов периферической крови человека

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Изоляция, очищение, и дифференциация Остеокласт прекурсоров из костного мозга крысы

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

<meta charset="utf8"></head><body>Улучшенная модель повреждения костного мозга для исследований внутримембранозного восстановления кости

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage template, the process of intramembranous ossification involves the direct conversion of skeletal stem and progenitor cells (SSPCs) into bone-forming osteoblasts. There are limited surgical methods to model this process in experimental mice. Here, we have improved upon a bone marrow injury model in mice to facilitate the study of bone repair via intramembranous ossification and to assess postnatal regulators of osteogenesis. This method is highly reproducible and user-friendly, and it allows temporal assessment of new bone formation in a short period (3-7 days post-injury) using micro-computed tomography (&#181;CT) and frozen section histology. Furthermore, the contributions of SSPCs and mature osteoblasts can be readily assessed using a combination of fluorescent reporter mice and this intramembranous bone marrow injury model. In clinical contexts, intramembranous bone formation is relevant for healing critical size defects, stabilized fractures, cortical defects, trauma from tumor resections, and joint replacements.

<meta charset="utf8"></head><body>Усовершенствованная методология изучения постнатального остеогенеза через интрамембранозное окостенение в модели повреждения костного мозга мышей

The murine bone marrow injury model is a useful tool for studying postnatal osteogenesis through intramembranous ossification. This simplified surgical protocol describes the bone marrow ablation procedure for downstream assessment of new bone formation and cellular responses following injury.

Усовершенствованная методология изучения постнатального остеогенеза через интрамембранозное окостенение в модели повреждения костного мозга мышей

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...

Остеокластов Вывод из костного мозга мыши

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST