Queremos agradecer el apoyo de subvenciones del NIH R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, la Fundación Oak y el Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa.

NOTA: Declaración de Ética: Toda la investigación con animales vertebrados se realizó en los protocolos de Accordance aprobados por el grupo administrativo de expertos de Stanford en Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC). 1. Preparación <ol><li> Permitir 10 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad disponible comercialmente (que contiene polysucrose y diatrizoato de sodio, ajustadas a una densidad de 1,077 g / ml) para llegar a RT en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Preparar citometría de flujo (FACS) de tampón de fosfato 1x con solución salina tamponada (PBS) y suero de ternera fetal al 2% (FCS). Tomar una parte alícuota de 50 ml y mantener esta alícuota a temperatura ambiente para su uso durante el paso de los medios de separación de células en gradiente de densidad. </li><li> Tener un cubo de hielo listo para mantener el tejido y las células aisladas durante el procedimiento de aislamiento. </li></ol> 2. Prepare Medios de Cultivo <ol><li> Preparar medio basal: MEM (medio esencial mínimo), sin rojo de fenol (500 ml), glutamato (1x), FCS (10x), 10.000 unidades / ml penicillin (1x). </li><li> Filtra medio basal con un filtro de 0,22 micras. </li><li> Preparar los medios de comunicación de la médula ósea de los macrófagos de inducción: <ol><li> Tomar 50 ml de los medios basales preparado en la etapa 2.1. </li><li> Añadir prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352.465 g / mol) a 10 -7 M concentración final. </li><li> Añadir macrófagos factor estimulante de colonias (M-CSF) a 10 ng / ml. </li><li> No filtrar la solución final de los macrófagos de médula ósea estimulando los medios de comunicación. </li></ol></li><li> Preparar los medios de inducción de los osteoclastos: <ol><li> Tomar 50 ml de los medios basales preparado en la etapa 2.1. </li><li> Añadir prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352.465 g / mol) a 10 -7 M concentración final </li><li> Añadir macrófagos factor estimulante de colonias (M-CSF) a 10 ng / ml. </li><li> Añadir RANKL a 10 ng / ml. </li><li> No filtrar la solución final de los medios de inducción de los osteoclastos. </li></ol></li></ol> 3. Aislamiento de Médula Ósea <ol><li> La eutanasia a un ratón C57BL / 6usando el método de inhalación de dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical. NOTA: Los roedores deben ser sacrificados por personal capacitado utilizando una técnica, equipos y agentes apropiados. </li><li> Coloque y asegure el ratón sobre una tabla de disección y rociar con alcohol al 70%. </li><li> Diseccionar el fémur, la tibia, el húmero y la columna vertebral. <ol><li> Comience con el ratón en la posición supina. Hacer una incisión vertical a lo largo de la extremidad inferior y comenzar mediante la disección a lo largo de la longitud del fémur y la tibia dividiendo los archivos adjuntos de tejidos blandos. Por último, dislocar huesos de la articulación de la rodilla y de la cadera para liberar a los huesos del esqueleto completo. </li><li> Proceder a realizar una incisión a lo largo de la longitud de la extremidad superior para aislar el húmero. Dislocar el húmero en las articulaciones del hombro y del codo mediante la disección suave inserción capsular tejido. </li><li> Por último, gire el ratón sobre, por lo que el ratón está en decúbito prono. Hacer una incisión en la piel a lo largo de la longitud de la columna vertebral, en la línea media. Observe el suave paravertebraltejido en cada lado de la columna vertebral y de incisión a lo largo del borde óseo de la columna vertebral, la disección a través de la masa de tejido blando paravertebral. Usando unas tijeras, hacer un corte horizontal a través de la columna vertebral en la base del cuello, y al final de la columna vertebral, justo proximal a la inserción de la cola, liberando la columna vertebral de la fijación del tejido blando. </li></ol></li><li> Una vez que los huesos se cosechan, mantenerlos en tampón FACS en el hielo. </li><li> Utilice un pañuelo de papel para limpiar el músculo y los tejidos blandos de los huesos. </li><li> Coloque los huesos limpios en un mortero con 3 ml de tampón FACS. </li><li> Aplastar los huesos suavemente en el mortero. </li><li> Aspirar el líquido manchado de sangre y la transferencia en un tubo cónico de 50 ml pasando la solución a través de un filtro de células de 70 micras. </li><li> Añadir 5 ml de tampón FACS al hueso triturado y aplastar aún más. Una vez más, extraer el líquido con una pipeta y transferir al tubo cónico de 50 ml a través de un filtro de 70 micras. </li><li> Normalmente aplastar el twi huesosce a tres veces en tampón FACS fresco, utilizando un mortero y mano de mortero, añadiendo cada vez otros 5 ml de tampón de FACS fresca, hasta que el líquido no mancha roja. </li><li> Centrifugar la solución de médula ósea a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para producir un sedimento celular. </li></ol> 4. Separación de degradado de células de médula ósea <ol><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de tampón de FACS (mantenida a temperatura ambiente). </li><li> Tome el tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad disponible comercialmente (RT). </li><li> Capa de la solución de la médula ósea en los medios de separación de células en gradiente de densidad. Haga esto lentamente utilizando una pipeta eléctrica. Ángulo de la punta de la pipeta contra la superficie interior cerca de la parte superior del tubo cónico y inclinar el tubo cónico a aproximadamente 30 °. El uso de un ajuste de velocidad lenta en la pipeta, expulsar suavemente la solución de la médula ósea a fin de no perturbar el medio de separación de células en gradiente de densidad. NOTA: En última instancia habráser una definición clara entre las dos soluciones (solución celular y medios de solución de separación de células en gradiente de densidad). </li><li> El uso de una centrífuga RT, centrifugar los medios de separación de células de gradiente de densidad y solución de células en una centrífuga equilibrada a 200 xg durante 15 min. Además, eliminar la aceleración y desaceleración en la centrífuga para garantizar la separación de fases adecuada utilizando el gradiente de densidad de gradiente de medios de separación de células. </li><li> Después de la centrifugación, aspirar fuera de la capa media nublado que contiene las células de médula ósea de interés. </li><li> Transferir estas células en un nuevo tubo cónico. Añadir 20 ml de tampón de FACS adicional (mantener en hielo) para lavar las células. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para producir un sedimento celular. </li><li> Resuspender el sedimento celular final en 1 ml de macrófagos estimulante de los medios de comunicación para permitir el recuento de células usando un hemocitómetro. </li></ol> 5. Conteo Celular <ol><li> Tomar 10 l de la solución de células y mezclarcon 10 l de azul de tripano. Cargar 10 l de la mezcla resultante en un hemocitómetro y obtener el recuento de células por ml de solución. </li></ol> El cultivo 6. celular <ol><li> Coloque 2 ml de medio de macrófagos estimulante en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Añadir 200.000 células a cada pocillo. NOTA: En nuestra experiencia, la densidad celular de galvanoplastia es uno de los requisitos más importantes para la adecuada en el cultivo in vitro de los osteoclastos. </li><li> Agitar suavemente la placa y el lugar en una incubadora normal a 37 ° C. </li><li> No cambie los medios de comunicación durante 3 días. </li><li> Después de 3 días en los medios de comunicación de macrófagos estimulante, cambiar los medios de comunicación para medios de comunicación de los osteoclastos. </li><li> De aquí en adelante, cambiar los medios de comunicación al día durante 5-7 días, y en ese momento, grandes osteoclastos multinucleadas, debe ser visible en la placa de cultivo. </li></ol> 7. La tinción con tartrato resistente a la fosfatasa ácida (TRAP) <ol><li> Después de 5-7 días de in vitro cultura, aspirar los medios de comunicación desde la cultura también. </li><li> Lave los pozos suavemente con 1x PBS tres veces. </li><li> Fijar las células mediante la adición de solución de paraformaldehído al 4% y se deja durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Durante este tiempo, preparar la mancha TRAP (que está disponible comercialmente) por el pre-calentamiento a 37 ° C. </li><li> Después de 1 hora en paraformaldehído, aspirar fuera de paraformaldehído y lavar suavemente 3 veces con PBS 1x. </li><li> Añadir 1 ml de tinción TRAP pre-calentado en cada pocillo de la placa para ser teñido. </li><li> Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 1 hora, protegida de la luz. </li><li> Después de 1 hora, aspirar fuera de la mancha TRAP. </li><li> Lavar los pocillos 3 veces con agua desionizada precalentada. </li><li> Contratinción el bien con hematoxilina de Gill (PRECAUCIÓN) durante 1-2 minutos. </li><li> Osteoclastos imagen usando microscopía de campo brillante. </li><li> Lavar los pocillos con agua desionizada hasta una intensidad de color adecuada de la mancha se logra, típicamente cuando los núcleos aparecen blue. </li></ol> 8. La resorción de osteoclastos ensayo <ol><li> Utilice una placa de cultivo comercialmente disponible de poliestireno de 24 pocillos que se pre-recubrieron con sustrato óseo o un recubrimiento de fosfato de calcio cristalino inorgánico. </li><li> Coloque 2 ml de medio de macrófagos estimulante en cada pocillo. </li><li> Añadir 200.000 células de médula ósea recién aisladas obtenidos al final de la etapa 2 a cada pocillo. </li><li> Agitar suavemente la placa antes de colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 3 días. </li><li> El día 3, cambiar los medios de comunicación para medios de comunicación diferenciación de los osteoclastos. </li><li> Realizar cambios de medios de comunicación diaria con los medios de comunicación diferenciación de los osteoclastos durante 5-7 días. </li></ol> 9. Cuantificación de osteoclastos Reabsorción Actividad <ol><li> Después de 5-7 días de cultivo in vitro en medios de diferenciación de los osteoclastos sobre un sustrato mineralizado, analizar la superficie mineralizada, como se describe a continuación, para evaluar la capacidad de los osteoclastos para formar resorptien pozos, un indicador de la actividad osteoclástica. </li><li> Aspirar los medios de comunicación a partir de la placa de ensayo de resorción y añadir 100 l de solución de lejía al 10% a cada pocillo. </li><li> Se incuban las células con la solución de lejía al 10% durante 15 min a TA. </li><li> Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada. </li><li> Aspirar fuera de cualquier resto de agua y sacuda el exceso de agua de la placa y dejar secar al aire durante 3-5 horas. </li><li> Contratinción la placa con un kit de tinción de Von Kossa disponible comercialmente para permitir la fácil visualización del sustrato un-reabsorbido. </li><li> Utilice la microscopía de campo claro para tomar imágenes de partes representativas de la superficie reabsorbido. </li><li> El uso de software de análisis de imagen, calcular el porcentaje de la superficie reabsorbido para permitir la cuantificación de la actividad de resorción osteoclástica. </li></ol>

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Ninguno de los autores tiene divulgación o conflicto de intereses que declarar.

Una capacidad de aislar fácilmente y cultivar un gran número de osteoclastos in vitro ha sido responsable de ayudar a avanzar en la comprensión de la biología del hueso y los osteoclastos mediada por enfermedades. Era la identificación de RANKL que conducen a esto, cuando se identificó recientemente como el principal regulador de la formación de osteoclastos, la diferenciación y la supervivencia 16-18. Ha sido nuestra experiencia que el cultivo in vitro de</em...

El remodelado óseo es dinámico e implica el acoplamiento de la formación de hueso con la resorción ósea 1. Este proceso estrechamente regulado es responsable de mantener el esqueleto durante la homeostasis normal, y en respuesta a la lesión y la enfermedad. Los osteoclastos son células multinucleadas únicos, que son capaces de resorción tanto las matrices orgánicas e inorgánicas de hueso. Los osteoclastos se derivan del linaje de monocitos / macrófagos de la médula ósea 2-5. Las anormalidades en la función o la formación de osteoclastos puede resultar en una variedad de patologías clínicas, incluyendo las condiciones comunes como la osteoporosis. La capacidad de generar los osteoclastos in vitro ha permitido importantes avances en nuestra comprensión de la biología del hueso 6. Como resultado, los nuevos agentes terapéuticos están surgiendo para tratar enfermedades relacionadas con osteoclastos que son responsables de morbilidades y mortalidades significativas 7 </sarriba&gt;. Mantenimiento homeostático de la masa ósea y la fuerza requiere la acción concertada de los osteoblastos forman el hueso y los osteoclastos de resorción ósea 8,9. La homeostasis ósea está alterado en un número de enfermedades, incluyendo la osteoporosis post-menopáusica, en el que aumentó la actividad de los osteoclastos conduce a la pérdida patógena de masa y densidad ósea 10. Con el aumento de la disponibilidad de modelos murinos transgénicos de enfermedades humanas, hay más oportunidades para descifrar la función de los osteoclastos en la enfermedad ósea humana 11-13. Numerosos protocolos para técnicas de cultivo de osteoclastos aparecen en la literatura, con muchas variaciones describen 9,12,14. Xing y sus colegas describen metodología similar con el protocolo descrito a continuación, en su descripción de los ensayos de osteoclastogenic a partir de células de médula ósea murina. Sin embargo, para liberar las células de la médula ósea después de la cosecha de los huesos largos, Xing et al. Enjuagar la cavidad ósea con α-MEM medio completo14. Catalfamo examina el efecto de la hiperglucemia sobre la función de los osteoclastos y describe un método en el que todas las células movilizadas por lavado de la médula ósea se cultivan durante 24 h, momento en el cual las células no adherentes se descartan 12, una técnica también utilizada por Boyle et al . 9 Estos protocolos publicados anteriormente requieren la práctica de lavado de la médula ósea, una práctica tediosa, que también introduce el riesgo de una lesión por pinchazo de aguja y la pérdida de valiosa médula ósea, como se debe cortar en ambos extremos del hueso. El protocolo, que se describen, implementa el uso de un mortero y mano de mortero para aislar los osteoclastos, que es similar al método de aislamiento de macrófagos descrito por Weischenfeldt et al. 15 Nuestra experiencia, sin embargo, es que el aislamiento de los osteoclastos y cultivo in vitro usando técnicas de resultados previamente publicados en los resultados variables en términos de producción de los osteoclastos, resultando a menudoen una incapacidad para cultivar los osteoclastos. Por lo tanto, hemos ideado un protocolo que permite el aislamiento consistente de médula ósea de ratón para producir un gran número de osteoclastos multinucleados in vitro, con un rendimiento aproximado del 70-80% de células sembradas inicialmente la formación de macrófagos y osteoclastos, posteriormente, en presencia de medios de inducción de los osteoclastos.

<table><tbody><tr><td>MEM, no glutamine, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinant mouse</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; expressed)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Los osteoclastos son células altamente especializadas que se derivan del linaje de monocitos / macrófagos de la médula ósea. Su capacidad única para reabsorber tanto las matrices orgánicas e inorgánicas de hueso significa que juegan un papel clave en la regulación de la remodelación esquelética. Juntos, los osteoblastos y los osteoclastos son responsables para el proceso de acoplamiento dinámico que implica tanto la resorción ósea y la formación ósea actuando juntos para mantener el esqueleto normal durante la salud y la enfermedad. Como la célula de resorción ósea principal en el cuerpo, los cambios en la diferenciación o la función de los osteoclastos pueden resultar en efectos profundos en el cuerpo. Enfermedades asociadas con la función de los osteoclastos alterada pueden variar en severidad de la enfermedad neonatal letal debido a un fallo para formar un espacio para la hematopoyesis de la médula, a patologías tales como la osteoporosis, en la que la resorción ósea osteoclástica excesiva predispone a la fractura de la formación observado más comúnmente. ent &quot;&gt; Una capacidad de aislar los osteoclastos en grandes cantidades in vitro ha permitido avances significativos en la comprensión del ciclo de remodelación ósea y ha allanado el camino para el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas que combaten estas enfermedades. A continuación, describimos un protocolo para aislar y cultivar los osteoclastos de médula ósea de ratón que producirá un gran número de osteoclastos.

<html> El objetivo de este método fue aislar fácilmente un gran número de osteoclastos in vitro, normalmente en una semana. Éxito en el aislamiento de un gran número de osteoclastos se confirmó mediante la tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (Figura 1A). Las grandes osteoclastos se visualizan como células grandes de color púrpura con múltiples núcleos (normalmente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, es común para aislar los osteoclastos con hasta 30 núcleos por lo...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Los osteoclastos son las células de resorción ósea principal en el cuerpo. La capacidad para aislar los osteoclastos en grandes cantidades ha resultado en avances significativos en el entendimiento de la biología de los osteoclastos. En este protocolo, se describe un método para el aislamiento, cultivo y la cuantificación de la actividad de los osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

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24.0K vistas.  Stanford University School of Medicine.  Los osteoclastos son las células de resorción ósea principal en el cuerpo. La capacidad para aislar los osteoclastos en grandes cantidades ha resultado en avances significativos en el entendimiento de la biología de los osteoclastos. En este protocolo, se describe un método para el aislamiento, cultivo y la cuantificación de la actividad de los osteoclastos in vitro. 

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Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Biología del Desarrollo

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Una base de RANKL osteoclasto cultura ensayo de médula ósea de ratón para investigar el papel de mTORC1 en la formación de osteoclastos

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Inmunología e Infección

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Bioingeniería

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

Diferenciación y caracterización de osteoclastos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

Diferenciación de osteoclastos funcionales de monocitos CD14+ de sangre periférica humana

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Biología

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo mejorado de lesión de la médula ósea para estudios de reparación ósea intramembranosa

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage template, the process of intramembranous ossification involves the direct conversion of skeletal stem and progenitor cells (SSPCs) into bone-forming osteoblasts. There are limited surgical methods to model this process in experimental mice. Here, we have improved upon a bone marrow injury model in mice to facilitate the study of bone repair via intramembranous ossification and to assess postnatal regulators of osteogenesis. This method is highly reproducible and user-friendly, and it allows temporal assessment of new bone formation in a short period (3-7 days post-injury) using micro-computed tomography (&#181;CT) and frozen section histology. Furthermore, the contributions of SSPCs and mature osteoblasts can be readily assessed using a combination of fluorescent reporter mice and this intramembranous bone marrow injury model. In clinical contexts, intramembranous bone formation is relevant for healing critical size defects, stabilized fractures, cortical defects, trauma from tumor resections, and joint replacements.

<meta charset="utf8"></head><body>Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

The murine bone marrow injury model is a useful tool for studying postnatal osteogenesis through intramembranous ossification. This simplified surgical protocol describes the bone marrow ablation procedure for downstream assessment of new bone formation and cellular responses following injury.

Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

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