私たちは、NIHの助成金R01 DE021683、DE019434 R01、U01 HL099776、オーク財団と小児再生医療のためのHagey研究所の支援を認める。

注：倫理声明：脊椎動物に関わるすべての研究は実験動物管理（APLAC）にスタンフォード紛争処理パネルにより承認に従ってプロトコルで実施した。 1.準備<ol><li> （1.077グラム/ mlの密度に調整したポリスクロースおよびジアトリゾ酸ナトリウムを含んでいる）市販の密度勾配細胞分離培地10mlを50mlコニカルチューブにRTに来ることを可能にする。 </li><li>フローサイトメトリー（FACS）は、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、2％ウシ胎児血清（FCS）を用いて緩衝液を準備。の50mlアリコートを取り、密度勾配細胞分離培地工程の間に使用するために、RTで、このアリコートを維持する。 </li><li>単離手順の間に単離された組織や細胞を維持する準備ができた氷のバケツを持っている。 </li></ol> 2.文化メディアを準備します<ol><li>基礎培地を準備します。MEM（最小必須培地）、フェノールレッド（500ミリリットル）、グルタミン酸（1×）、FCS（10倍）、10,000単位/ mlのpenicilliなしn個（1×）。 </li><li> 0.22μmのフィルターで基本培地をフィルタリングします。 </li><li>骨髄マクロファージ誘導培地を準備します。 <ol><li> ステップ2.1で調製した基礎培地の50ミリリットルを取る。 </li><li> 10 -7 Mの最終濃度で、プロスタグランジンE2（PGE2、ミスター352.465グラム/モル）を追加します。 </li><li>を10ng / mlでマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を追加します。 </li><li>メディアを刺激骨髄マクロファージの最終的な解決をフィルタリングしないでください。 </li></ol></li><li>破骨細胞誘導培地を準備します。 <ol><li> ステップ2.1で調製した基礎培地の50ミリリットルを取る。 </li><li>追加10 -7 Mの最終濃度で、プロスタグランジンE2（PGE2氏352.465グラム/モル） </li><li>を10ng / mlでマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を追加します。 </li><li>を10ng / mlでRANKLを追加します。 </li><li>破骨細胞誘導培地の最終的な解決をフィルタリングしないでください。 </li></ol></li></ol> 3.骨髄の単離<ol><li> 1 C57BL / 6マウスを安楽死させる頸椎脱臼に続く二酸化炭素吸入法を用いて。 注：げっ歯類は、適切な技術、機器や薬剤を使用訓練を受けた者が安楽死させなければなりません。 </li><li>位置及び解剖ボード上でマウスを固定し、70％アルコールで噴霧する。 </li><li>大腿骨、脛骨、上腕骨と背骨を解剖する。 <ol><li>仰臥位でマウスで始まる。縦に下肢に沿って切開を行い、軟部組織の添付ファイルを分割することによって大腿骨と脛骨の長さに沿って切開することから始めます。最後に、スケルトンから完全に自由な骨に膝と股関節から骨を脱臼。 </li><li>上腕骨を分離するために上肢の長さに沿って切開を作るために進んでください。軟組織の莢添付ファイルを解剖することによって、肩と肘の関節での上腕骨を脱臼。 </li><li>マウスが発生しやすい位置するように最後に、マウスを裏返します。正中線で、背骨の長さに沿って皮膚切開を行います。傍脊椎ソフトを観察脊椎の骨縁に沿って脊椎および切開の各側の組織、傍脊椎軟組織塊を通って解剖する。はさみを使って、首の付け根に背骨全体に水平カットを行い、背骨の終わりに、テール挿入のすぐ近位、軟組織の添付ファイルから背骨を解放する。 </li></ol></li><li>骨が収穫された後、氷上でFACS緩衝液中にそれらを保つ。 </li><li>筋肉と骨から軟部組織をきれいにティッシュペーパーを使用してください。 </li><li> FACS緩衝液3mLで乳棒と乳鉢にきれいに骨を置きます。 </li><li>乳棒と乳鉢で静かに骨をつぶす。 </li><li>吸引除去血まみれ流体オフと70μmのセルストレーナーに溶液を通すことにより、50ミリリットルコニカルチューブに移す。 </li><li> 5ミリリットルのFACSを粉砕骨にバッファに追加し、さらにつぶす。再び、ピペットを用いて流体を除去し、70μmのストレーナーを50ミリリットルコニカルチューブに移す。 </li><li>一般的に骨のTWIをつぶす新鮮なFACS緩衝液中で3回、流体が赤に染色しなくなるまで、乳鉢と乳棒、新鮮なFACS緩衝液をさらに5ミリリットル追加するたびに使用するCE。 </li><li>細胞ペレットを得るために、4℃で5分間、200×gでの骨髄液を集める。 </li></ol>骨髄細胞の4勾配分離<ol><li> FACS緩衝液10ml中に再懸濁上清を吸引（RTで維持される）。 </li><li>市販の密度勾配細胞分離培地（RT）10 mlを含む50mlコニカルチューブを取る。 </li><li>密度勾配細胞分離媒体に骨髄液レイヤ。ゆっくり電動ピペットを用いてこれを行います。角度ピペット円錐管の上部付近内面に先端部とは約30°にコニカルチューブを傾け。ピペット上の低速設定を用いて、密度勾配細胞分離媒体を妨害しないように静かに骨髄液を排出する。 注：最終的にはそこに意志二つの溶液（細胞溶液および密度勾配細胞分離培地溶液）との間の明確な定義である。 </li><li> RT遠心機を用いて、15​​分間、200×gでバランスのとれた遠心分離器で密度勾配細胞分離培地および細胞溶液を遠心する。また、密度勾配細胞分離媒体勾配を用いて、適切な相分離を確実にするために遠心分離機に加減速を除去。 </li><li>遠心分離後、関心の骨髄細胞を含む濁った中間層をオフに吸引除去する。 </li><li>新しいコニカルチューブにこれらの細胞を移す。細胞を洗浄するために、（氷上で保持）追加のFACS緩衝液20ミリリットルを追加します。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで遠心分離して細胞ペレットを得た。 </li><li>血球計数器を用いて細胞計数を可能にするためにメディアを刺激するマクロファージを1mlの最終細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol> 5.細胞の計数<ol><li>細胞液10μlを取り、混ぜるパンブルー10μlのと。負荷られたミックス10μlの血球計算板の上に、溶液の1ml当たり細胞数を得る。 </li></ol> 6.細胞培養<ol><li> 24ウェルプレートの各ウェルにマクロファージ刺激培地2mlを置く。 </li><li>各ウェルに200,000細胞を追加します。 注：我々の経験では、細胞プレーティング密度は破骨細胞の体外培養において十分なために最も重要な要件の一つである。 </li><li>静かに37℃での定期的なインキュベーター内でプレートと場所を攪拌する。 </li><li> 3日間のメディアを変更しないでください。 </li><li>マクロファージ刺激媒質中で3日後、破骨細胞のメディアにメディアを変更します。 </li><li>以下、大、多核破骨細胞は、培養プレート上で表示されている必要があり、その時点で、5-7日間、毎日メディアを変更。 </li></ol> 7.染色と酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP） <ol><li> インビトロ CULの5-7日後トゥーレは、培養ウェルから培地を吸引除去する。 </li><li> 1×PBSで3回優しく井戸を洗ってください。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド溶液を添加することによって細胞を固定し、4℃で1時間放置する。 </li><li>この間、37℃に予備温暖化（市販されている）、TRAP染色を準備します。 </li><li>ホルムアルデヒド中で1時間後、パラホルムアルデヒドをオフに吸引し、1×PBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>染色されるプレートの各ウェルに予め温めTRAP染色の1ミリリットルを追加します。 </li><li>遮光し1時間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 </li><li> 1時間後、TRAP染色をオフに吸引除去する。 </li><li>予め温めておいた脱イオン水でウェルを3回洗浄する。 </li><li> 1-2分間ギルのヘマトキシリン​​（注意）とよく対比。 </li><li>明視野顕微鏡を用いた画像破骨細胞。 </li><li>核はブルーレイを出るときに汚れの十分な色強度は、一般的に、達成されるまで脱イオン水でウェルを洗ってください電子メール。 </li></ol> 8.破骨細胞再吸収アッセイ<ol><li>骨基質または無機結晶リン酸カルシウムコーティングのいずれかでプレコートされている市販の24ウェルのポリスチレン培養皿を使用する。 </li><li>各ウェルにマクロファージ刺激メディアの2ミリリットルを置きます。 </li><li>各ウェルに、ステップ2の終了時に得られた20万新たに単離した骨髄細胞を加える。 </li><li>穏やかに3日間37℃のインキュベーター内に配置する前にプレートを攪拌する。 </li><li> 3日目に、破骨細胞分化メディアにメディアを変更。 </li><li> 5〜7日間破骨細胞分化培地毎日メディアの変更を行います。 </li></ol>破骨細胞再吸収活動9.定量<ol><li>以下に説明するように鉱化基板上に破骨細胞分化培地中でインビトロ培養の5~7日後、resorpti形成する破骨細胞の能力を評価するために、石灰化した表面を分析ピット上、破骨細胞活性の指標。 </li><li>吸収アッセイプレートから培地を吸引し、各ウェルに10％の漂白剤溶液100μlを加える。 </li><li> RTで15分間、10％の漂白剤溶液で細胞をインキュベートする。 </li><li>蒸留水でウェルを3回洗浄する。 </li><li>残りの水を吸引し、プレートから余分な水分を振り払うと、3-5時間、空気乾燥させ。 </li><li>非再吸収基板のより容易な可視化を可能にするために、市販のフォン·コッサ染色キットでプレート対比。 </li><li>再吸収面の代表部分の画像を取るために明視野顕微鏡を使用してください。 </li><li>画像解析ソフトウェアを使用して、破骨細胞の吸収活性の定量化を可能にするために再吸収表面の割合を計算する。 </li></ol>

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	<li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption:+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit.">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue.">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li><li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells.">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li><li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes.">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast.">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bench+to+bedside:+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab.">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li><li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast.">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li><li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+OPG/RANKL/RANK+system.">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li><li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss.">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology.">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li><li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget's+Disease+of+Bone.">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li><li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function.">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li><li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD/SCID+IL-2Rgamma(null)+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies.">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells.">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand.">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function.">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li><li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism.">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li><li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease.">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li><li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+osteoclast+function.">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts.">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li><li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interleukin-6,+osteoclastogenesis,+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor.">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li><li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+among+cells+of+bone,+immune+system,+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases.">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., &amp; developmental immunology. 2013, (2013).</li><li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer.">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., &amp; oncology. 11, 134-143 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases.">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li></ol>

著者のどれも宣言する開示や利害の対立を持っていません。

簡単にin vitroで破骨細胞の多数を隔離し、育成する能力は、骨の生物学および破骨細胞媒介性疾患の理解を進めるために支援を担当してきました。それが最近、破骨細胞の形成、分化および生存16-18の主要な調節因子として同定されたときには、これにつながるRANKLの同定だった。 それは、骨髄からの破骨細胞のin vitro栽培は播種密度に大きく依存し?...

骨リモデリングは動的であり、骨吸収の1骨形成のカップリングを含む。この緊密に調節されたプロセスは、通常の恒常性の間に、そして怪我や病気に応じて骨格を維持する責任がある。 破骨細胞は、骨の有機および無機マトリックスの両方を再吸収することができるユニークな多核細胞である。破骨細胞は、骨髄2-5の単球/マクロファージ系統に由来するものである。破骨細胞の機能または形成の異常は、骨粗しょう症のような一般的な条件を含む臨床病理、さまざまな可能性があります。 in vitroで破骨細胞を生成する能力は、骨の生物学6の我々の理解における大きな進歩を可能にした。その結果、新たな治療薬は、かなりの罹患率および死亡率の原因である破骨細胞関連疾患を治療するために出現している7 </s&gt;まで。骨量および強度の恒常性維持は、骨形成骨芽細胞と骨吸収破骨細胞8,9の協調行動が必要です。骨ホメオスタシス、骨質量および密度10の病原性の喪失をもたらす破骨細胞活性を増加させた閉経後骨粗鬆症を含む多くの疾患、変更される。ヒト疾患のトランスジェニックマウスモデルの利用の増加に伴い、人間の骨疾患11-13における破骨細胞の役割を解読するためのより多くの機会がある。 多くのバリエーションが9,12,14を記載して破骨細胞培養技術のための多数のプロトコルが、文献に現れる。興らは、マウスの骨髄細胞からの破骨細胞形成アッセイの彼らの説明では、以下に記載されるプロトコルに類似した方法論を説明します。しかし、長骨の収穫次骨髄細胞を解放するために、興ら α-MEM完全培地で骨髄腔をフラッシュ14。Catalfamoは破骨細胞機能における高血糖の影響を調べ、骨髄フラッシングによって動員され、すべての細胞は、非接着細胞を12に廃棄され、その時点で24時間、また、ボイルらによって使用される技術のために培養される方法が記載されている9これらの以前に公表されたプロトコルは、1つの骨の両端を切断しなければならないように、また、貴重な骨髄の針刺し損傷および損失の危険を誘発退屈練習を、骨髄をフラッシュするの練習を必要とする。我々が説明するプロトコルは、Weischenfeldt らによって記載マクロファージの単離方法と同様である破骨細胞を単離するための乳鉢と乳棒の使用を実装しています。15 我々の経験では、しかし、多くの場合、その結果、破骨細胞の産生の点で可変転帰における以前に公表された技法の結果を使用して、その破骨細胞の単離およびインビトロ培養物中に存在する破骨細胞を育てることができないことで。したがって、我々は、最初の存在下で、マクロファージ、続いて破骨細胞を形成するメッキされた細胞の70〜80％のおおよその収率で、in vitroで多核破骨細胞の多数を生成するために、マウス骨髄の一貫した分離を可能にするプロトコルを考案した破骨細胞誘導培地。

<table><tbody><tr><td>MEM, no glutamine, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinant mouse</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; expressed)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html>破骨細胞は骨髄の単球/マクロファージ系統から誘導された高度に特殊化した細胞である。骨の有機および無機マトリックスの両方を再吸収する独自の能力は、それらが骨リモデリングの調節において重要な役割を果たしていることを意味する。一緒に、骨芽細胞および破骨細胞は骨吸収と健康と病気の間、正常な骨格を維持するために一緒に働く骨形成の両方を伴う動的結合プロセスに関与している。 体内の主要な骨吸収細胞としては、破骨細胞の分化または機能の変化は、体内で顕著な効果をもたらすことができる。改変された破骨細胞の機能に関連する疾患は、より一般的に過剰な破骨細胞骨吸収が形成を破砕するために罹りやすくする骨粗鬆症などの病態を観察することにより、造血のための骨髄空間を形成する失敗に致死性新生児疾患の重症度の範囲とすることができる。 ENT &quot;&gt; in vitroで高い数字で破骨細胞を単離する能力は、骨リモデリングサイクルを理解する上で大きな進歩を可能にしたこれらの疾患と闘う新たな治療戦略の発見のための道を開いてきた。 ここでは、隔離し、破骨細​​胞の多数が得られるマウス骨髄からの破骨細胞を育成するためのプロトコルを記述します。

<html>この方法の目的は、容易に、典型的には1週間で、in vitroで破骨細胞の多数を単離することであった。破骨細胞の多数の正常な分離は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色（ 図1A）を用いて確認した。大破骨細胞は、複数の核（通常は≥3核）を持つ大規模な紫色の細胞として可視化される。このプロトコルを使用して、破骨細胞あたり最大30核（ 図1B）で...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

破骨細胞は、体内の主要な骨吸収細胞である。大量に破骨細胞を単離する能力は、破骨細胞の生物学の理解における大きな進歩をもたらした。このプロトコルでは、培養し、インビトロで破骨細胞活性を定量化する、単離するための方法を記載する。

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

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24.0K ビュー.  Stanford University School of Medicine. 破骨細胞は、体内の主要な骨吸収細胞である。大量に破骨細胞を単離する能力は、破骨細胞の生物学の理解における大きな進歩をもたらした。このプロトコルでは、培養し、インビトロで破骨細胞活性を定量化する、単離するための方法を記載する。 

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Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

がん研究

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

発生生物学

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL による破骨細胞文化アッセイのマウス骨髄破骨細胞形成における mTORC1 の役割を調査するには

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

免疫・感染学

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

生物工学

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

機能性破骨細胞のヒト末梢血CD14+ 単球との鑑別

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

ラット骨髄からの破骨細胞前駆体の分離・精製・分化

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>骨膜内骨修復研究のための改良された骨髄損傷モデル

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage template, the process of intramembranous ossification involves the direct conversion of skeletal stem and progenitor cells (SSPCs) into bone-forming osteoblasts. There are limited surgical methods to model this process in experimental mice. Here, we have improved upon a bone marrow injury model in mice to facilitate the study of bone repair via intramembranous ossification and to assess postnatal regulators of osteogenesis. This method is highly reproducible and user-friendly, and it allows temporal assessment of new bone formation in a short period (3-7 days post-injury) using micro-computed tomography (&#181;CT) and frozen section histology. Furthermore, the contributions of SSPCs and mature osteoblasts can be readily assessed using a combination of fluorescent reporter mice and this intramembranous bone marrow injury model. In clinical contexts, intramembranous bone formation is relevant for healing critical size defects, stabilized fractures, cortical defects, trauma from tumor resections, and joint replacements.

<meta charset="utf8"></head><body>マウス骨髄損傷モデルにおける膜内骨化による出生後骨形成の研究方法の改善

The murine bone marrow injury model is a useful tool for studying postnatal osteogenesis through intramembranous ossification. This simplified surgical protocol describes the bone marrow ablation procedure for downstream assessment of new bone formation and cellular responses following injury.

マウス骨髄損傷モデルにおける膜内骨化による出生後骨形成の研究方法の改善

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

要約

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