אנו מכירים את התמיכה של מענקי NIH R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, קרן Oak והמעבדה Hagey לילדי רפואת רגנרטיבית.

הערה: הצהרה אתית: כל המחקר מעורב בעלי חיים בעלי חוליות בוצע בפרוטוקולים בהתאם אושרו על ידי אוניברסיטת סטנפורד המנהלית הלוח במעבדת טיפול בבעלי חיים (APLAC). 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלו 10 מיליליטר של תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות זמינה מסחרי (המכילה diatrizoate polysucrose ונתרן, מותאם לצפיפות של 1.077 גר &#39;/ מיליליטר) לבוא לRT בצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן cytometry זרימה (FACS) חיץ עם פוספט 1x סליין (PBS) ו- 2% עוברי עגל בסרום (FCS). קח aliquot 50 מ&quot;ל ולשמור aliquot זה ב RT לשימוש במהלך שלב תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לי דלי הקרח מוכן כדי לשמור על רקמה מבודדת ותאים בבמהלך הליך הבידוד. </li></ol> 2. הכן תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת בסיסית: ממ (בינוני חיוני מינימאלי), ללא פנול אדום (500 מיליליטר), גלוטמט (1x), FCS (10x), 10,000 יחידות / מיליליטר penicillin (1x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן תקשורת בסיסית עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת האינדוקציה מקרופאג מח עצם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50 מיליליטר של התקשורת הבסיסית מוכנה בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פרוסטגלנדין E2 (PGE2, ז מר 352.465 / mol) בשעה 10 -7 ריכוז סופי M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מקרופאג-מושבה מגרה פקטור (M-CSF) בשעה 10 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תסנן את הפתרון הסופי של מקרופאג מח עצם גירוי תקשורת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50 מיליליטר של התקשורת הבסיסית מוכנה בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פרוסטגלנדין E2 (PGE2, ז מר 352.465 / mol) בשעה 10 -7 ריכוז סופי M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מקרופאג-מושבה מגרה פקטור (M-CSF) בשעה 10 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף RANKL ב 10 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תסנן את הפתרון הסופי של תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים. </li></ol></li></ol> בידוד 3. מח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים C57BL עכבר אחד / 6בשיטת שאיפת פחמן דו חמצני, ואחריו נקע בצוואר הרחם. הערה: מכרסמים חייבים להיות מורדמים על ידי צוות מיומן תוך שימוש בטכניקה, ציוד וסוכנים מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה ולאבטח את העכבר על לוח לנתיחה ולרסס עם אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עצמות הירך, tibiae, humeri ועמוד השדרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל עם העכבר במצב שכיבה. עושה חתך אנכי לאורך הגפה התחתונה ולהתחיל לנתח לאורכו של עצם הירך ועצם השוק על ידי חלוקת קבצים מצורפים רקמות רכות. לבסוף, לנקוע עצמות ממפרק הברך והירך לשחרר עצמות באופן מלא מהשלד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לעשות חתך לאורכו של האיבר העליון לבודד את הזרוע. לנקוע הקרסול במפרקי כתף ומרפק ידי לנתח קובץ מצורף קופסית רקמה רכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להפוך את העכבר מעל, כך שהעכבר שכובה פרקדן. לעשות חתך בעור לאורכו של עמוד השדרה, בקו האמצע. שים לב הרך ליד חוליות עמוד שדרהרקמה בכל צד של עמוד השדרה ולַחתוֹך לאורך הקצה הגרמי של עמוד השדרה, לנתח באמצעות מסת הרקמה הרכה ליד חוליות עמוד השדרה. בעזרת מספריים, לעשות חתך אופקי על פני עמוד השדרה בבסיס הצוואר, ובסופו של עמוד השדרה, רק הפרוקסימלי להחדרת הזנב, לשחרר את עמוד השדרה מקובץ מצורף רקמות רכות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהעצמות נקצרים, לשמור אותם במאגר FACS על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר טישו כדי לנקות שרירים ורקמות רכות מהעצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העצמות ניקו למכתש ועלי עם 3 מיליליטר של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסק את העצמות בעדינות במכתש ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל מוכתם בדם ולהעביר לתוך צינור 50 מיליליטר חרוטי על ידי העברת הפתרון דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר FACS חיץ עד לשד העצמות המרוסקים ולמחוץ נוסף. שוב, להסיר את הנוזל בעזרת פיפטה ולהעביר לצינור חרוטי 50 מיליליטר דרך מסננת 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל לרסק את השפה טווית עצמותce עד שלוש פעמים במאגר FACS טרי, בעזרת מכתש ועלי, בכל פעם מוסיפה 5 מיליליטר נוסף של חיץ FACS הטרי, עד שהנוזל לא כתם אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה פתרון מח העצם ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להניב תא גלולה. </li></ol> 4. הפרדת צבע של תאי מח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וגלול ב 10 מיליליטר של חיץ FACS (שמרו על RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של תקשורת זמינה מסחרי הפרדת תא שיפוע צפיפות (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת פתרון מח עצם על תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. לעשות זאת באמצעות פיפטה חשמלית לאט. זווית קצה פיפטה כנגד המשטח הפנימי בחלקו העליון של צינור חרוטי ולהטות את צינור חרוטי לכ -30 מעלות. שימוש בהגדרת מהירות איטית בפיפטה, בעדינות לגרש את פתרון מח עצם כדי שלא להפריע לתקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. הערה: בסופו של יהיולהיות הגדרה ברורה בין שני הפתרונות (פתרון סלולארי ופתרון תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צנטריפוגות RT, צנטריפוגות תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות ופתרון תא בצנטריפוגה מאוזנת ב XG 200 במשך 15 דקות. בנוסף, להסיר את האצה ההאטה בצנטריפוגות כדי להבטיח הפרדה פאזות נאותה באמצעות שיפוע תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב את השכבה האמצעית מעונן המכילה את תאי מח עצם של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התאים האלה לתוך צינור חרוטי חדש. להוסיף 20 מיליליטר של חיץ נוסף FACS (שמר על קרח) כדי לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להניב תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה תא הסופי ב1ml של מקרופאג גירוי תקשורת, כדי לאפשר ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> ספירת 5. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl של פתרון התא ומערבביםעם 10 μl של trypan כחול. טען 10 μl של תמהיל התוצאה על hemocytometer ולהשיג את ספירת תאים לכל מיליליטר של תמיסה. </li></ol> Culturing 6. הנייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 מיליליטר של תקשורת מקרופאג גירוי לבאר כל צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 200,000 תאים היטב כל אחד. הערה: מניסיוננו, צפיפות תאי ציפוי היא אחת הדרישות החשובות ביותר עבור נאות בתרבית במבחנה של osteoclasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתסיס את הצלחת ומניחים בחממה רגילה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא לשנות את התקשורת במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 ימים בתקשורת מקרופאג גירוי, לשנות את התקשורת לתקשורת האוסטאוקלסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאן והלאה, לשנות את התקשורת מדי יום במשך 5-7 ימים, ובשלב זה, osteoclasts הגדול, multinucleated צריך להיות גלוי על צלחת התרבות. </li></ol> 7. צביעה עם Tartrate עמיד החומצה phosphatase (TRAP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5-7 ימים של במבחנה רחוב ללא מוצאמכשור, לשאוב את התקשורת מהתרבות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות בעדינות עם פעמים PBS שלוש 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 4% פתרון paraformaldehyde ולהשאיר למשך שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את כתם המלכודת (שהוא זמין באופן מסחרי) על ידי התחממות מראש ל -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה 1 בparaformaldehyde, לשאוב את paraformaldehyde ולשטוף בעדינות 3 פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של כתם מלכודת מראש חימם לבאר כל הצלחת להיות מוכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לשאוב את כתם TRAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות 3 פעמים עם מים ללא יונים מחוממים מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain היטב עם Hematoxylin של גיל (זהירות) ל1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> osteoclasts תמונה באמצעות מיקרוסקופ שדה הבהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות עם מים ללא יונים עד עוצמת צבע מספקת של הכתם מושגת, בדרך כלל, כאשר גרעינים מופיעים Bluדואר. </li></ol> 8. האוסטאוקלסטים הספיגה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצלחת תרבות קלקר 24 גם זמינה מסחרי שהיא מראש מצופה גם עם מצע עצם או ציפוי גבישי סידן זרחה אי-אורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 מיליליטר של תקשורת מקרופאג גירוי לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 200,000 תאי מח עצם מבודדים טרי שהושגו בסופו של שלב 2 זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתסיס את הצלחת לפני הצבתו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לשנות את התקשורת לתקשורת בידול האוסטאוקלסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שינויי תקשורת יומיומיים עם תקשורת בידול האוסטאוקלסטים 5-7 ימים. </li></ol> 9. כימות האוסטאוקלסטים ספיגת הפעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5-7 ימים של תרבות במבחנה בתקשורת בידול האוסטאוקלסטים על מצע mineralized, לנתח את פני השטח mineralized, כפי שיתואר להלן, על מנת להעריך את יכולתו של osteoclasts כדי ליצור resorptiעל בורות, אינדיקציה לפעילות osteoclastic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מצלחת assay הספיגה ולהוסיף 10% פתרון אקונומיקה 100 μl היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם פתרון אקונומיקה 10% במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות 3 פעמים במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את כל מים שנותרו ולהתנער ממים עודפים מהצלחת ולאפשר לאוויר יבש במשך 3-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain הצלחת עם ערכת צביעת פון Kossa זמינה מסחרי כדי לאפשר להדמיה קלה יותר של המצע-resorbed האו&quot;ם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ שדה הבהיר לקחת תמונות של חלקי נציג של פני השטח resorbed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת ניתוח תמונה, לחשב את אחוז שטח resorbed כדי לאפשר כימות של פעילות resorptive osteoclastic. </li></ol>

<ol>
	<li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption:+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit.">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue.">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li><li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells.">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li><li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes.">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast.">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bench+to+bedside:+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab.">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li><li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast.">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li><li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+OPG/RANKL/RANK+system.">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li><li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss.">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology.">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li><li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget's+Disease+of+Bone.">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li><li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function.">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li><li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD/SCID+IL-2Rgamma(null)+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies.">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells.">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand.">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function.">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li><li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism.">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li><li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease.">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li><li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+osteoclast+function.">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts.">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li><li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interleukin-6,+osteoclastogenesis,+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor.">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li><li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+among+cells+of+bone,+immune+system,+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases.">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., &amp; developmental immunology. 2013, (2013).</li><li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer.">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., &amp; oncology. 11, 134-143 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases.">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li></ol>

אף אחד מהמחברים יש גילוי או ניגוד העניינים להכריז.

יכולת לבודד בקלות ולטפח מספר גדול של osteoclasts במבחנה הייתה אחראית על סיוע לקידום הבנה של ביולוגיה עצם ומחלות תיווך האוסטאוקלסטים. זה היה זיהוי של RANKL שיובילו לכך, בעת שזוהה לאחרונה כרגולטור העיקרי של היווצרות האוסטאוקלסטים, בידול והישרדות 16-18. <p class="jove_content"...

שיפוץ עצם הוא דינמי וכרוך בצימוד של יצירת עצם עם ספיגת עצם 1. תהליך חוזקה מוסדר זו הוא אחראי לשמירה על השלד במהלך הומאוסטזיס נורמלי, ובתגובה לפציעה ומחלה. Osteoclasts הם תאים ייחודיים, multinucleated המסוגלים resorbing שתי מטריצות אורגניות ואי-אורגניות של עצם. Osteoclasts נגזרים משושלת מונוציטים / מקרופאג של מח עצם 2-5. ליקויים בתפקוד או ההיווצרות של osteoclasts יכולים לגרום למגוון רחב של פתולוגיות קליניות, כוללים מצבים שכיחים כמו אוסטאופורוזיס. היכולת ליצור osteoclasts במבחנה אפשרה להתקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה עצם 6. כתוצאה מכך, סוכנים טיפוליים חדשים צצים לטיפול במחלות הקשורות להאוסטאוקלסטים אשר אחראים על תחלואות ותמותה משמעותיות של 7 </sעד&gt;. תחזוקת homeostatic של מסת עצם וכוח דורשת פעולה מתואמת של osteoblasts יוצרי העצם וosteoclasts resorbing עצם 8,9. הומאוסטזיס העצם משתנה במספר המחלות, כוללים אוסטאופורוזיס לאחר גיל מעבר, שבו פעילות מוגברת האוסטאוקלסטים מובילה לאובדן פתוגניים של מסת עצם וצפיפות 10. עם עלייה בזמינות של דגמים עכבריים מהונדסים של מחלות בבני אדם, יש יותר הזדמנות לפענח את התפקיד של osteoclasts במחלת עצם אנושי 11-13. פרוטוקולים רבים לטכניקות culturing האוסטאוקלסטים מופיעים בספרות, בוריאציות רבות תיארו 9,12,14. Xing ועמיתיו מתארים שיטה דומה לפרוטוקול מתואר להלן, בתיאורם של מבחני osteoclastogenic מתאי מח עצם עכבריים. עם זאת כדי לשחרר את תאי מח העצם הבאים קציר עצם ארוך, Xing לשטוף et al. העצם חלול בתקשורת מלאה α ממ14. Catalfamo בוחן את ההשפעה של היפרגליקמיה על תפקוד האוסטאוקלסטים ומתאר שיטה שבה כל התאים מגויסים על ידי שטיפת מוח עצם בתרבית למשך 24 שעות, ובנקודה שאינם חסיד התאים מבוטלים 12, טכניקה המשמשת גם על ידי בויל אח &#39; . 9 פרוטוקולים שפורסמו בעבר אלה מחייבים את הנוהג של שטיפת מוח העצם, תרגול מייגע, שגם מציג את הסיכון לפגיעת מחט מקל ואובדן מח עצם יקר, כאחד חייב לחתוך את שני הקצוות של העצם. הפרוטוקול, שאנו מתארים, מיישם את השימוש במכתש ועלי כדי לבודד osteoclasts, שהוא דומה לשיטה של בידוד מקרופאג שתואר על ידי et Weischenfeldt אל. 15 הניסיון שלנו, לעומת זאת, הוא שבידוד האוסטאוקלסטים ובתרבות חוץ גופית באמצעות תוצאות טכניקות שפורסמו בעבר בתוצאות משתנים במונחים של ייצור האוסטאוקלסטים, ופעמים רבות תוצאהבחוסר יכולת לטפח osteoclasts. לכן, אנו פיתחנו פרוטוקול המאפשר לבידוד העקבי של מח עצם עכבר כדי לייצר מספר גדול של osteoclasts multinucleated במבחנה, עם תשואה של כ 70-80% מתאים בתחילה מצופים יוצר מקרופאגים ולאחר מכן osteoclasts, בנוכחות תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים.

<table><tbody><tr><td>MEM, no glutamine, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinant mouse</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; expressed)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Osteoclasts הם תאים מאוד מיוחדים שנובעים משושלת מונוציטים / מקרופאג של מח העצם. היכולת הייחודית שלהם לנספגות שוב שני מטריצות אורגניות ואי-אורגניות של עצם משמעות הדבר היא כי הם משחקים תפקיד מפתח בויסות שיפוץ שלד. יחד, osteoblasts וosteoclasts אחראים לתהליך הצימוד הדינמי שכולל גם ספיגת עצם ויצירת עצם פועלת יחד כדי לשמור על השלד הנורמלי במהלך מחלה ובריאות. כתא resorbing-העצם העיקרי בגוף, שינויים בבידול האוסטאוקלסטים או פונקציה יכולים לגרום להשפעה עמוקה בגוף. מחלות הקשורות לתפקוד האוסטאוקלסטים שינה יכולים טווח חומרת מחלה בילוד קטלנית עקב אי ליצור חלל מוח לhematopoiesis, לנצפתה יותר בכינוי פתולוגיות כגון אוסטאופורוזיס, שבו ספיגת עצם osteoclastic מוגזמת לתשומה כדי לשבר היווצרות. אף אוזן גרון &quot;&gt; יכולת לבודד osteoclasts במספרים גבוהים במבחנה אפשרה להתקדמות משמעותית בהבנה של מחזור שיפוץ עצם וסללה את הדרך לגילוי של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות שמאבק במחלות אלו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד ולטפח osteoclasts ממח העצם של עכבר שיניב מספר גדול של osteoclasts.

<html> מטרתה של שיטה זו הייתה לבודד בקלות מספר רב של osteoclasts במבחנה, בדרך כלל בשבוע אחד. בידוד מוצלח של מספר רב של osteoclasts אושר באמצעות מכתים tartrate עמיד phosphatase החומצה (איור 1 א). osteoclasts גדול הם דמיינו כתאים סגולים גדולים עם גרעינים רבים (בדרך כלל ≥ 3 גרעינים). שימוש ?...

Watch this Scientific Journal Video about Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה.

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

24.0K Views.  Stanford University School of Medicine.  Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה. 

Video: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cancer Research

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

גירוי של מערכת איתות Notch עכבר osteoclast המבשר

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Developmental Biology

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Immunology and Infection

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

פרופיל תאימות ביולוגית על Biomaterials עבור התחדשות העצם

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Bioengineering

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

הבחנה של אוסטאוקלסטים פונקציונליים ממונוציטים של דם היקפי אנושי CD14+

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

<meta charset="utf8"></head><body>מודל פגיעה משופר במח העצם למחקרי תיקון עצם intramembranous

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage template, the process of intramembranous ossification involves the direct conversion of skeletal stem and progenitor cells (SSPCs) into bone-forming osteoblasts. There are limited surgical methods to model this process in experimental mice. Here, we have improved upon a bone marrow injury model in mice to facilitate the study of bone repair via intramembranous ossification and to assess postnatal regulators of osteogenesis. This method is highly reproducible and user-friendly, and it allows temporal assessment of new bone formation in a short period (3-7 days post-injury) using micro-computed tomography (&#181;CT) and frozen section histology. Furthermore, the contributions of SSPCs and mature osteoblasts can be readily assessed using a combination of fluorescent reporter mice and this intramembranous bone marrow injury model. In clinical contexts, intramembranous bone formation is relevant for healing critical size defects, stabilized fractures, cortical defects, trauma from tumor resections, and joint replacements.

<meta charset="utf8"></head><body>מתודולוגיה משופרת לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות אוסיפיקציה אינטרמברנית במודל פגיעה במח עצם של עכברים

The murine bone marrow injury model is a useful tool for studying postnatal osteogenesis through intramembranous ossification. This simplified surgical protocol describes the bone marrow ablation procedure for downstream assessment of new bone formation and cellular responses following injury.

מתודולוגיה משופרת לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות אוסיפיקציה אינטרמברנית במודל פגיעה במח עצם של עכברים

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST