الكتاب أود أن أشكر أعضاء السابق للمختبر الأوراق المالية: مينغ مين لي، كاثرين Plichta، فيكتوريا ميراندا طومسون وسام كيو كيم لمساهماتها في تحسين العديد من هذه البروتوكولات. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من منحة المؤسسة الوطنية للعلوم IOS-0840932-0724978 وIOS لSP المالية

1. في الجسم الحي من تربية الديدان الخيطية الممرضة مع البكتيريا التي Symboitic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس 100 × 15 مم البلاستيك طبق بتري ووضع قرصين من ورق الترشيح (90 ملم) في غطاء الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالتساوي توزيع 1 مل من IJ (الأحداث المعدية) تعليق الماء (بتركيز 1،000-2،000 IJ / مل) على ورقة الترشيح. ملاحظة: نقابة الصحفيين العراقيين لا تحتاج إلى أن تكون تعقيم السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مشاركة الطور اليرقات من أكبر waxmoth غاليريا mellonella إلى الطبق. الهدف هو توفير حوالي 100-200 نقابة الصحفيين العراقيين / يرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية غطاء مع الجزء السفلي من طبق بيتري (الشكل 1) وتسمية طبق بيتري. ذكر المعلومات التالية: اسم الأنواع الخيطية (إذا كان معروفا). عزل كود / التعيين. تم تعيين فخ الإصابة التاريخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق داخل كيس من البلاستيك مختوم فضفاضة (للحفاظ على الرطوبة) وابقائه في الظلام إما في درجة حرارة الغرفة أو في حاضنة بين 20-25 ° C. تحقق من الأطباق يوميا ملاحظة: الظلام يسهل عدوى الديدان الخيطية، لأنه يحاكي ظروف العدوى الطبيعية في التربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3-5 أيام، وإزالة الجثث مع وجود علامات للعدوى الديدان الخيطية إلى فخ أبيض تعديل 7. ملاحظة: إذا كانت الجثث رائحة عفنة، وهذا قد يكون مؤشرا على أن زراعة لم تكن ناجحة و / أو كانت هناك تلوث. وضع غرفة عدوى جديدة مع دفعة جديدة من الديدان والحشرات. </li></ol> 2. في المختبر تربية الديدان الخيطية الممرضة مع البكتيريا التكافلية التي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكبد الكلى آجار الطريقة 9،19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الكبد والكلى الى قطع صغيرة (2 سم 3 أو أصغر) ومكان في الخلاط مع كلوريد الصوديوم، أجار و 300 مل من الماء ويمزج حتى يصبح اللحم اللب السائل ومعجون سميك أو هريس. ثم، ونقل الخليط إلى قارورة 1 لتر مخروطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة النهائية 200 مل من الماء في وعاء الخلاط وصب أي وسائط المتبقية فيقارورة مخروطي. الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. بعد التعقيم تسمح أجار لتهدئة لمسة قبل صب. ملاحظة: لا ينصح pipetting لمتوسطة المتوسطة لأن هذا يميل إلى أن يكون قطع من اللحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب ~ 20 مل من أجار على (5 أو 6) سم أطباق بتري مع التحريك باليد أو يحوم قارورة مخروطي بين يصب لوسائل الإعلام أكثر تجانسا. السماح للأجار ليصلب وأطباق تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها ملاحظة: استخدام ملعقة معدنية تعقيم اللهب لتفريق أي أجزاء كبيرة من اللحوم تصب في طبق بتري. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدهون آجار الطريقة 9،19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الدهون أجار المتوسطة عن طريق خلط معا مرق المغذيات، وأجار مستخلص الخميرة ويسكب المزيج في قارورة 2 لتر مخروطي. إضافة المقطر H 2 O وMgCl 2 • 6H 2 O والأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مزيج عقيمة من الذرة مزيج النفط وشراب الذرة ويحرك أو دوامة بقوة وغالبا لتفريق قطرات النفط بالتساوي. <br/&gt; ملاحظة: تعقيم زيت الذرة وشراب عن طريق وضع وحدة التخزين اللازمة في الأشعة فوق البنفسجية عبر رابط. فإن النفط لا تذوب في السائل، ولكن تأكد أنها في قطرات صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب ~ 20 مل أجار على بعد 5 (أو 6) سم أطباق بتري والسماح أجار ليصلب وأطباق تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلسلة انتصارات المطلوب البكتيريا التكافلية على طبق الدهون أجار واحتضان لوحات عند 28 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة. ملاحظة: انتشار 100-200 ميكرولتر من بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) LB ثقافة فرعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، تضيف نحو 0.4 مل من سطح تعقيمها الخيطية تعليق (البيض أو الأحداث المعدية)، واحتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة في الظلام أو في حاضنة عند 22 ± 3 درجة مئوية. ملاحظة: عدم إضافة أكثر من 0.4 مل من الديدان الخيطية تعليق لأنها يمكن أن تخلق بيئة رطبة بشكل مفرط التي هي غير مواتية لنمو النيماتودا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الثقافات يوميا. يجب الثقافات إنتاج جيل جديد من نقابة الصحفيين العراقيين في حوالي 12 يوما (الشكل 2).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبق السفلي مع أجار عندما ينظر الديدان الخيطية الزحف جانبي الطبق (الشكل 3A) إلى فخ أبيض تعديل (انظر أوروزكو وآخرون 12) لحصاد نقابة الصحفيين العراقيين (الشكل 3B). تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء تدفق الصفحي للحد من التلوث من وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع نقابة الصحفيين العراقيين من فخ أبيض تعديل على ظهور وشطف IJ تعليق لإزالة أي حطام المتوسط. متجر IJ في الماء المقطر المعقم في 10 ° C (في حاضنة درجة الحرارة الباردة أو غرفة باردة) أو استخدامها على الفور إذا لزم الأمر. ملاحظة: اعتمادا على الهدف من الدراسة، البذور لوحات مع المستعمر إما المتكافل أو aposymbiotic الديدان الخيطية. </li></ol></li></ol> 3. في المختبر تربية Aposymbiotic (خالية من المتكافل) نيماتودا الممرضة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب 10-20 G. mellonella اليرقات مع نقابة الصحفيين العراقيين من الأنواع الخيطية المطلوب (انظر القسم 1). بعد 3 أو 4 أيام (في هذا الوقت يجب أن نقابة الصحفيين العراقيين قد نضجتللبالغين الجيل الأول) جمع الجثث. ملاحظة: حان الوقت لنضج وعدد الإناث اللازمة للحصول على عدد كاف من البيض سوف تختلف حسب الأنواع. تصيب أكثر G. mellonella اليرقات إذا لزم الأمر والبدء في تشريح في وقت مبكر من 48 ساعة بعد العدوى لتقييم ما إذا كانوا في مرحلة التطوير المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل جثة على حدة في طبق بيتري مع محلول ملحي (M9 عازلة 18). تشريح الجثة عن طريق سحب الرأس مع ملقط غيض غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع لا يقل عن 20 حبلي (مع البيض داخل) إناث مع إبرة رفيعة (L-شكل يفضل) ووضعها في كوب الساعات تحتوي على 10 مل من M9 عازلة (الشكل 4A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل axenizing من خلال النظر في المكونات التالية: 6.75 مل من الماء المقطر، 1.25 مل 5 N هيدروكسيد الصوديوم، و 2.25 مل من محلول التبييض المخفف متوفرة تجاريا إلى 3٪ هيبوكلوريت. ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم هو جزء أساسي حل قفازات ونظارات واقية وغيرها من التدابيروينبغي ارتداء الملابس. ملاحظة: يعد حل axenizing جديدة في كل مرة، كما يحط التبييض في الضوء. إعداد عدة دفعات من حل axenizing وإجراء التعقيم السطحية وحصاد البيض في الساعات النظارات متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الإناث على الأقل ثلاث مرات مع العازلة M9 ملء الزجاج ووتش مع حل العازلة وامتصاص ما يصل عازلة مع ماصة. تأكد تبقى الإناث في الزجاج ساعة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور إضافة محلول axenizing والسماح للإناث بالبقاء في هذا الحل لمدة لا تتجاوز 10-15 دقيقة. مراقبة الأنسجة الخيطية بدأت تتفكك بينما تبقى البيض (التي تقاوم الحل axenizing) سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل يدويا أجساد النساء لتسريع هذه العملية، بالقص مع إبرة أو مشرط (الشكل 4B، C). إزالة البيض من قبل pipetting لهم في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، وتجنب إضافة أي أنسجة غير منحل. ملاحظة: استخدام ومأي أنابيب microcentrifuge عند الضرورة لجمع البيض ويعمل بسرعة، حيث أن صلاحية البيض سينخفض ​​على مدى فترة طويلة من التعرض للحل axenizing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الأنابيب لمدة 15 ثانية باستخدام &quot;إعداد سرعة عالية&quot; لمواصلة إزالة الأنسجة الخيطية التي تعلق على البيض. بدلا من ذلك، إذا دوامة غير متوفرة، الماصة صعودا وهبوطا الحل عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيض بيليه بواسطة الطرد المركزي في حوالي 18،000 ز لمدة 2 دقيقة. زيادة السرعة إذا لم تفعل البيض بما فيه الكفاية بيليه. إزالة حل axenizing وشطف مرتين عن طريق ملء أنبوب microcentrifuge مع الماء المقطر المعقم وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 900 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي، و resuspend البيض في 300-500 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ووضعها في العقيمة 3 سم طبق بتري أو المشاهدة زجاج معقمة. تذكر أن البيض هي الآن تعقيم السطح، وذلك باستخدام ماصات معقمة و / أو نصائح pippetter والمياه للحفاظ على نظافة البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">فحص البيض تحت مجهر تشريح (30-50X التكبير) لتأكيد أنها سليمة (الشكل 4D) ونقلها الى 5 سم لوحة مع أجار الكبد الكلى (انظر القسم 2.1) ملاحظة: عدم إضافة أكثر من 400 ميكرولتر من تعليق بيضة على لوحات لأنها سوف تجعل آغار الرطب بشكل مفرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات التسمية مع المعلومات المناسبة وتخزينها تستقيم في الظلام عند 28 درجة مئوية. يجب الفقس من البيض يكون بين عشية وضحاها واضح. ملاحظة: قد تتكثف المياه على غطاء الطبق ولكنها سوف تتبخر بعد 1 أو 2 يوما. في هذا الوقت، وضع الطبق في كيس من البلاستيك على الاحتفاظ بالرطوبة من أجار وتجنب التجفيف لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة أطباق دوري وتجاهل أي الأطباق التي تظهر علامات فطرية أو التلوث الجرثومي. مرة واحدة وتعتبر نقابة الصحفيين العراقيين المهاجرة يصل جدار طبق بيتري، وإزالة الغطاء ونقل الطبق السفلي مع أجار إلى فخ أبيض تعديل 12. النظر في ظروف معقمة عند نقل الطبق في modifieد فخ الأبيض لتجنب تلوث وسائل الإعلام تتعرض لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة رصد الفخاخ الابيض والحصاد IJ حسب الحاجة. ملاحظة: سوف تستمر الديدان الخيطية Aposymbiotic للهجرة في الماء من فخ الأبيض لعدة أيام وحتى أسابيع. </li></ol>

<ol>
	<li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.,+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes,+Neoaplectana+and+Heterorhabditis.">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li><li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis.">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li><li>Boemare, N., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology,+taxonomy+and+systematics+of+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> Entomopathogenic Nematology. , (2002).</li><li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genera+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> The Prokaryotes. , 473-488 (2002).</li><li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+(Diptera)+and+Galleria+mellonella+(Lepidoptera).">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li><li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).</li><li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes.">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li><li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li><li>Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+insect+nematology.">Techniques in insect nematology.</a> Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).</li><li>Koppenh&#246;fer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Symbionts+of+Steinernema+and+Heterorhabditis.">Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis.</a> Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).</li><li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp.">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li><li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae,+Heterorhabditidae).">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+(Steinernematidae:+Nematoda).">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li><li>Poinar, G. O., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+(Achromobacteriaceae:+Eubacteriales)+associated+with+a+nematode.">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li><li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pag&#232;s, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Breh&#233;li, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila,+its+nematode+vector,+and+insect+hosts.">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li><li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pag&#232;s, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+(Steinernema)+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+(Xenorhabdus).">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li><li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host,+Steinernema+carpocapsae.">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li><li>Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+parasites,+pathogens+and+associated+of+insects+and+invertebrates+of+economic+importance.">Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).</li></ol>

أعلنت أي تضارب في المصالح.

باستخدام مجموعة مناسبة هو عامل رئيسي للنجاح في تربية الجسم الحي من EPN. عادة، يمكن أن كلا steinernematids وheterorhabditids إنتاج وبنجاح إكمال دورة حياتها في يرقات فراشة الشمع الكبيرة، غاليريا mellonella (قشريات الجناح: Pyralidae). ومع ذلك، يمكن اعتبار أنواع الحشرات الأخرى من ال...

النيماتودا الممرضة للحشرات (EPN) Steinernema وHeterorhabditis النيابة. وتعتبر (Steinernematidae، Heterorhabditidae) والمتكافلة تلك البكتيريا، Xenorhabdus وPhotorhabdus النيابة (المعوية) نموذج الأرضي الناشئة من الحيوانات ميكروب العلاقات التكافلية 2-4،6،10،19. Xenorhabdus وPhotorhabdus النيابة. وآوى والمتكافلة في الأمعاء للمرحلة الحرة الحية الوحيدة من الديدان الخيطية، والمعروف أيضا باسم الأحداث عدوى (IJ) أو المرحلة الثالثة 3 المعدية الأحداث 8،10،13. الزوج بكتيريا-النيماتودا الممرضة هو لمجموعة واسعة من الحشرات وتمت بنجاح تم تنفيذها في المكافحة البيولوجية وبرامج الإدارة المتكاملة للآفات في جميع أنحاء العالم 6،8. هنا نعرض مجموعة مختارة من المجراة في تقنيات المختبر التي كثيرا ما تمارس لتربية EPN تحت ظروف المختبر. Iن الأساليب فيفو تفكر مضيف الحشرات للتربية من الديدان الخيطية. عادة، تعتبر مراحل غير ناضجة من مختلف أوامر الحشرات (أي قشريات الجناح، مغمدات الأجنحة، ذوات الجناحين، الخ.) تستضيف مناسب. في الجسم الحي عادة ما تعتبر وسائل لصيانة الثقافات الخيطية في المختبر. هذه الطريقة قد لا تكون مناسبة عند النظر في الإنتاج الضخم من الديدان الخيطية. قد تكون هناك حاجة كميات كبيرة من المضيفين الحشرات لهذا الغرض تطالب بالمزيد من الوقت والتكاليف الإضافية المتعلقة تربية الحشرات. ويمكن أيضا النيماتودا الممرضة للحشرات يتم تربيتها في المختبر على عدة وسائل الاعلام. اعتمادا على الهدف من الدراسة؛ في أساليب المختبر أو قد ينظر في إدراج البكتيريا التكافلية في وسائل الإعلام. في هذا العرض، ونحن تصف طريقتين تستخدم عادة لنشر EPN. المكونات وسائل الإعلام توفر مصدرا من المواد المغذية للبكتيريا التكافلية لالثانية مصدر للستيرول الديدان الخيطية. في المختبر أساليب توفر ميزة تربية EPN دون مضيف الحشرات. في الأصل، تم استخدام العديد من وسائل الإعلام المتقدمة في المختبر لتكاثر الحشرات EPN عندما يستضيف مناسبة غير متوفرة. ومع ذلك، على مدى السنوات الماضية، وأصبحت في المختبر أساليب تربية المستخدمة على نطاق واسع في الأبحاث التي تهدف إلى فهم العلاقة بين المنفعة المتبادلة EPN والبكتيريا التكافلية 17،19. التقنيات بالتفصيل في هذا العرض تتوافق مع تلك التي وصفها العديد من الكتاب وصقلها من قبل مختبر المالية، جامعة أريزونا (توكسون، أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية). هذه التقنيات تختلف من الجسم من التقنيات التي تستخدم في الإنتاج الضخم من هذه الكائنات لأغراض إدارة الآفات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1827">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:485px;">Material&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Company</td>
			<td style="width:488px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:485px;">For in vivo Infections</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:488px;">25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:485px;">Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose</td>
			<td style="width:260px;">Whatman/VWR</td>
			<td style="width:488px;">28450-081</td>
			<td style="width:595px;">Grade 1 filter paper recommended</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:485px;">Insect hosts</td>
			<td style="width:260px;">Timberline</td>
			<td style="width:488px;">http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td>
			<td style="width:595px;">Galleria mellonella are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:485px;">For Liver-Kidney Agar (for 500 ml)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:485px;">60 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Beef Liver, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:485px;">Beef Kidney, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration )</td>
			<td style="width:260px;">Acros/VWR</td>
			<td>200002-434</td>
			<td style="width:595px;">any research grade NaCl can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">500 ml distilled H20&#160;</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">For Lipid Agar (for 1 L)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Nutrient Broth, 8 g</td>
			<td style="width:260px;">BD/VWR</td>
			<td>90002-660</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Yeast Extract, 5g</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM1.03753.0500</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Magnesium Chloride Hexahydrate,&#160; 10 ml (0.2g/ml)</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM-MX0045-1</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">Corn Oil, 4 ml</td>
			<td style="width:260px;">Any brand</td>
			<td style="width:488px;">Locally source; supermarket</td>
			<td style="width:595px;">Any brand of corn oil can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:485px;">Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity</td>
			<td style="width:260px;">Karo</td>
			<td style="width:488px;">Locally sourced; supermarket</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar, 15 g</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Distilled H20,890 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

النيماتودا الممرضة للحشرات (EPN) (Steinernematidae وHeterorhabditidae) لديها شراكة المنفعة المتبادلة مع سلبية الغرام غاما Proteobacteria في الأسرة ترتبط البكتيريا المعوية. Xenorhabdus مع steinernematids النيماتودا بينما Photorhabdus هي المتكافلة من heterorhabditids. معا الديدان والبكتيريا تشكل مجمع الحشرات قوي أن يقتل مجموعة واسعة من أنواع الحشرات في شراكة حميمة ومحددة. هنا، علينا أن نظهر في الجسم الحي وتقنيات المختبر التي يشيع استخدامها في تربية هذه الديدان الخيطية تحت ظروف المختبر. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات تمثل الخطوات الأساسية لإنشاء الناجح الثقافات EPN وتشكل أيضا الأساس لاختبارات بيولوجية الأخرى التي تستخدم هذه الكائنات للبحث. إنتاج aposymbiotic الديدان الخيطية (خالية من المتكافل) هو أمر حاسم لمتعمق ونهج متعدد الأوجه لدراسة التعايش في كثير من الأحيان. هذالا يتطلب بروتوكول إضافة المضادات الحيوية ويمكن تحقيقه في فترة قصيرة من الوقت مع المعدات المختبرية القياسية. الديدان الخيطية تنتج في هذه الطريقة غير قوية نسبيا، على الرغم من البقاء على قيد الحياة في التخزين قد تختلف تبعا للأنواع المستخدمة. التقنيات بالتفصيل في هذا العرض تتوافق مع تلك التي وصفها العديد من الكتاب وصقلها من قبل مختبر P. المالية، وجامعة أريزونا (توكسون، أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية). هذه التقنيات تختلف من الجسم من التقنيات التي تستخدم في الإنتاج الضخم من هذه الكائنات لأغراض إدارة الآفات.

يستخدم في الجسم الحي طريقة تربية الحشرات الحية بصفتها الدولة المضيفة للنمو وتكاثر الديدان الخيطية. غرف العدوى هي وسيلة فعالة لتعريض الحشرات نقابة الصحفيين العراقيين. هذه هي المرحلة الوحيدة في دورة حياة الديدان الخيطية &quot;التي ناقلات للالمتكافلة البكتيرية من ?...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae at JoVE.com

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

الهدف من هذا العرض هو إظهار المجراة في تقنيات المختبر للتربية النيماتودا الممرضة للحشرات. في الجسم الحي أساليب تعتبر تربية هذه الديدان الخيطية مع مضيف الحشرات، في حين أن وسائل الإعلام تستخدم في المختبر أجار الغنية.

في الجسم الحي في المختبر وتربية الديدان الخيطية الممرضة (Steinernematidae وHeterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.4K Views.  University of Arizona.  الهدف من هذا العرض هو إظهار المجراة في تقنيات المختبر للتربية النيماتودا الممرضة للحشرات. في الجسم الحي أساليب تعتبر تربية هذه الديدان الخيطية مع مضيف الحشرات، في حين أن وسائل الإعلام تستخدم في المختبر أجار الغنية. 

Video: In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

جامدة التضمين من الثابتة والملون، إجمالاً، مقياس الملليمتر العينات 3D خالية من قسم علم الأنسجة بالتصوير المقطعي الصغيرة المحسوبة

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is catheter-directed thrombolytics (CDT). To mitigate caustic side effects and the long treatment time associated with CDT, adjuvant and alternative approaches are under development. One such approach is histotripsy, a focused ultrasound therapy to ablate tissue via bubble cloud nucleation. Pre-clinical studies have demonstrated strong synergy between histotripsy and thrombolytics for clot degradation. This report outlines a benchtop method to assess the efficacy of histotripsy-aided thrombolytic therapy, or lysotripsy.
Clots manufactured from fresh human venous blood were introduced into a flow channel whose dimensions and acousto-mechanical properties mimic an iliofemoral vein. The channel was perfused with plasma and the lytic&#160;recombinant tissue-type plasminogen activator. Bubble clouds were generated in the clot with a focused ultrasound source designed for the treatment of femoral venous clots. Motorized positioners were used to translate the source focus along the clot length. At each insonation location, acoustic emissions from the bubble cloud were passively recorded, and beamformed to generate passive cavitation images. Metrics to gauge treatment efficacy included clot mass loss (overall treatment efficacy), and the concentrations of D-dimer (fibrinolysis) and hemoglobin (hemolysis) in the perfusate. There are limitations to this in vitro design, including lack of means to assess in vivo side effects or dynamic changes in flow rate as the clot lyses. Overall, the setup provides an effective method to assess the efficacy of histotripsy-based strategies to treat DVT.

Histotripsy-aided lytic delivery or lysotripsy is under development for the treatment of deep vein thrombosis. An in vitro procedure is presented here to assess the efficacy of this combination therapy. Key protocols for the clot model, image guidance, and assessment of treatment efficacy are discussed.