Yazarlar Stock laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson ve Sam-Kyu Kim bu protokollerin birçok iyileştirme katkıları için. Bu çalışma SP Stoku Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-0840932 ve IOS-0724978 tarafından kısmen finanse edildi

Onların Symboitic Bakteriler Entomopatojenik Nematodlar 1. in vivo Yetiştiriciliği <ol><li> 100 x 15 mm&#39;lik bir plastik Petri kabı ters çevirin ve çanak kapakta filtre kağıdı (90 mm) iki diskler yerleştirin. </li><li> Eşit olarak, filtre kağıdı üzerinde (1.000-2.000 IJ / ml &#39;lik bir konsantrasyonda), IJ (infektif çocuklar) su süspansiyonundan 1 ml dağıtın. Not: IJs yüzeyi sterilize edilmiş olması gerekmez. </li><li> Çanak daha waxmoth Galleria mellonella 10 son dönem larvaları ekleyin. Hedefi, yaklaşık 100-200 IJs / larva sağlamaktır. </li><li> Petri kabı (Şekil 1) alt kısmı ile kapağı kapalı Petri etiketleyin. Aşağıdaki bilgileri Mansiyon: nematod türlerinin adı (biliniyorsa); kodu / atama izole; tarih enfeksiyon tuzak kuruldu. </li><li> Bir gevşek şekilde kapalı plastik bir torba içine tabağına yerleştirin (nem muhafaza etmek için) ve ya oda sıcaklığında ya da 20-25 ° C arasında bir kuluçka makinesi içinde karanlıkta tutun. Günlük yemekler edin NOT: topraktaki doğal enfeksiyon koşullarını taklit Darkness, nematod enfeksiyonu kolaylaştırır. </li><li> 3-5 gün sonra, modifiye Beyaz tuzak 7 nematod enfeksiyon belirtileri ile kadavra çıkarın. NOT: kadavra çürük kokusu varsa, bu kültür başarılı değildi ve / veya kirlenme olduğunu bir göstergesi olabilir. Nematod ve böcekler yeni bir parti ile yeni bir enfeksiyon odasını ayarlayın. </li></ol> Onların Simbiyotik Bakteriler Entomopatojenik Nematodlar 2. in vitro Yetiştiriciliği <ol><li> Karaciğer-böbrek Agar Yöntemi 9,19 <ol><li> Küçük parçalar (2 cm3 veya küçük) olarak karaciğer ve böbrek doğranır ve NaCl, ağar bir karıştırıcı içine koyun ve 300 ml su ve sıvı et hamuru, kalın bir macun veya püre haline gelene kadar karıştırılır. Daha sonra, 1 litrelik bir Erlenmeyer şişesine karışımı aktarın. </li><li> Blender kabına suyun nihai 200 ml ilave edilir ve herhangi bir geri kalan ortam süzünBir Erlenmeyer şişesi. 121 ° C&#39;de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. Izin Otoklavlamadan sonra ağar dökülmeden önce dokunmak soğumaya. NOT: Bu orta et parçalarını sahip olma eğilimi gösterir, çünkü orta Pipetleme tavsiye edilmez. </li><li> Elle ya da karıştırma ile Erleni dönen daha homojen bir ortam dökülür, 5 (veya 6) cm Petri kapları üzerine agarı ~ 20 ml dökün. Kadar gerekli ağar 4 ° C&#39;de katılaşır ve mağaza yemekleri izin ver NOT: Etin Petri kabı içine dökülmüş herhangi bir büyük parçalarını kırmak için bir alev sterilize metal bir spatula kullanın. </li></ol></li><li> Lipit 9,19 ağar yöntemi <ol><li> Besleyici et suyu, agar ve maya özütü karıştırılarak bir yağ agar ortamı hazırlamak ve 2 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içine karıştırmak dökün. 121 ° C&#39;de 15 dakika boyunca H2O ve MgCl2 • 6H 2 O ve otoklav damıtılmış ekleyin. </li><li> Mısır yağı ve mısır şurubu karışımı steril karışımı eklenir ve eşit bir şekilde dağıtmak için yağ damlacıklarını, genellikle ya kuvvetli bir şekilde karıştırıldı ve girdap. <br/&gt; Not: UV çapraz bağlayıcı olarak gerekli hacmi koyarak mısır yağı ve şurubu sterilize edin. Yağ sıvı içine çözülür, ama bu küçük damlacıklar olduğundan emin olun olmayacaktır. </li><li> 5 (veya 6) cm Petri kapları üzerine ~ 20 mi agar dökün ve ihtiyaç duyulacak zamana kadar ağar, 4 ° C&#39;de katılaşmaya ve mağaza yemekler için izin verir. </li><li> Şerit lipid agar plakası üzerinde simbiyotik bakteriler, istenen ve 24-48 saat boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: gecede (12-16 saat) LB altkültür 100-200 ul yayıldı. </li><li> Bir gün sonra, yaklaşık olarak 0.4 mi yüzeyi sterilize nematod süspansiyonuna (yumurta ya da infektif juvenil) ekleyin ve karanlıkta ve 22 ± 3 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde, oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: nematod büyüme olumsuz bir aşırı ıslak ortam oluşturmak gibi nematod süspansiyonun fazla 0,4 ml katmayın. </li><li> Günlük kültürleri izleyin. Kültürler yaklaşık 12 gün (Şekil 2) Ijs yeni nesil üretmek gerekir.</li><li> Nematodlar, modifiye edilmiş beyaz yakalamak için çanak (Şekil 3A) yanlarını tarama görüldüğünde agar ile alt çanak aktarın IJs (Şekil 3B) toplanması için (Orozco ve arkadaşları. 12). Ortamın kirlenmesini azaltmak için bir laminar akış başlığı altındaki bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Ortaya çıkması üzerine modifiye Beyaz tuzak Ijs toplayın ve herhangi bir ortamda enkaz kaldırmak için IJ süspansiyon durulayın. Deposu (soğuk ısı enkübatör ya da soğuk bir odada), 10 ° C&#39;de steril damıtılmış su içinde, IJ ya da gerektiğinde, hemen kullanın. NOT: Araştırmanın amacına bağlı olarak, ya symbiont-kolonize veya aposymbiotic nematodlarla plakaları tohum. </li></ol></li></ol> 3. in vitro Aposymbiotic arasında Yetiştirme (Symbiont-serbest) Entomopatojenik Nematodlar <ol><li> 10-20 G. bulaştırmak İstediğiniz nematod türlerinin Ijs ile mellonella larvaları (bakınız bölüm 1). 3 veya 4 gün sonra (bu zamanda IJs olgunlaştı gerekirdiBirinci nesil yetişkinlere) kadavra toplar. NOT: vade ve türe göre değişir yumurta yeterli sayıda elde etmek için gerekli kadın sayısına zamanı. Daha fazla G. bulaştırmak Mellonella gerekirse larva ve erken onlar doğru gelişim aşamasında olup olmadığını değerlendirmek için 48 saat sonrası enfeksiyon gibi diseksiyonu başlar. </li><li> Tuzlu su çözeltisi (M9 tampon 18) ile bir Petri kabı içinde tek tek her bir kadavradan yerleştirin. Bir ince uçlu forseps ile başını çekerek bir kadavra ayır. </li><li> (Tercihen L-şekil) ince bir iğne ile kadın (iç yumurta) en az 20 Hastaların gravida toplayın ve M9 tampon (Şekil 4A) 10 ml içeren bir saat camı koyun. </li><li> Aşağıdaki maddeleri göz önüne alınarak, bir çözelti hazırlayın axenizing: damıtılmış su 6.75 ml, 1.25 mi, 5 N NaOH ve 2.25 ml ticari olarak temin edilebilen ağartma çözeltisi,% 3 hipoklorit seyreltilmiştir. NOT: NaOH çözüm eldiven, gözlük, temel ve koruyucu uygun diğer birkıyafetleri giyilmelidir. Not: ağartma ışık ayrıştığından taze axenizing çözüme her hazırlayın. Axenizing çözümün birkaç toplu hazırlayın ve birden izle gözlük yumurta yüzey sterilizasyonu ve istihsalinde. </li><li> M9 tampon tampon çözelti ile izlemek cam dolduran ve bir pipet ile tampon yalakalık kadınlarda en az üç kez durulayın. Kadın saat camı kalır emin olun. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Hemen axenizing bir çözeltisi eklenmekte ve dişi 10-15 dakika fazla bu çözelti içinde kalmasını sağlar. (Axenizing çözeltisine dayanıklı olan) yumurta sağlam kalırken parçalanmaya başlıyor nematod dokuları gözlemleyin. </li><li> Manuel bir iğne veya bisturi (Şekil 4B, C) ​​ile keserek, süreci hızlandırmak için kadın bedenlerini bozabilir. , Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine pipetle çözülmemiş her türlü doku ekleyerek kaçınarak yumurta çıkarın. NOT: m olarak kullanHerhangi bir mikrosantrifüj tüpleri gerekli yumurta toplamak için ve yumurtaların yaşama kabiliyetini axenizing çözeltisine maruz uzun bir süre boyunca azalacak şekilde, hızlı bir şekilde çalışır. </li><li> &quot;Yüksek hız ayarını&quot; kullanılarak 15 sn vorteks tüpler daha yumurta bağlı nematod dokuları kaldırmak için. Bir girdap kullanılamaz Alternatif olarak, eğer pipetlemeyin yukarı ve çözüm birkaç kez aşağı. </li><li> Yaklaşık 18.000 g 2 dakika boyunca santrifüj ile pelet yumurta. Yumurta yeterince pelet yapmazsan hızını artırın. Axenizing çözeltisini çıkarın ve 1 dakika boyunca 900 x g hızında steril damıtılmış su ve santrifüj ile bir kez daha mikrosantrifüj tüpü doldurmak suretiyle iki kez yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, steril damıtılmış su içinde 300-500 ul yumurta tekrar süspansiyon ve steril 3 cm Petri için veya steril saat camı yerleştirin. Yumurta şimdi yüzey sterilize olduğunu unutmayın, bu yüzden yumurta temizliğini korumak için steril pipetler ve / veya pippetter ipuçları ve su kullanın. </li><li>Onlar (Şekil 4D) sağlam olduğunu doğrulamak için bir mikroskop (30-50X büyütme) altında yumurta incelemek ve karaciğer-böbrek agar ile 5 cm plaka aktarabilirsiniz (bakınız bölüm 2.1) NOT: Agar aşırı ıslak yapacak gibi plakalar üzerinde yumurta süspansiyon fazla 400 ul ekleyin etmeyin. </li><li> Ilgili bilgileri etiket plakaları ve 28 ° C&#39;de karanlıkta dik saklayın. Yumurta Kuluçka belirgin bir gece boyunca olmalıdır. NOT: Su çanak kapağı üzerine yoğunlaşabilir ancak 1 ya da 2 gün sonra buharlaşır. Şu anda, agarı nem tutma ve kurumayı önlemek için bir plastik torba içinde koyunuz. </li><li> Periyodik yemekleri gözlemleyin ve mantar veya bakteriyel kontaminasyon belirtisi gösteren herhangi yemekleri atın. IJs Petri kabı duvar göç görülmektedir sonra, kapağı çıkarın ve modifiye Beyaz tuzak 12 ağar ile alt çanak aktarın. Modifie içine çanak aktarırken steril koşullarını dikkated Beyaz tuzak maruz medyanın kirlenmesini önlemek için. </li><li> Gerektiği gibi Beyaz Tuzakları ve hasat IJ izlemeye devam. NOT: Aposymbiotic nematod birçok gün ve hatta hafta Beyaz tuzak suya göç devam edecektir. </li></ol>

<ol>
	<li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.,+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes,+Neoaplectana+and+Heterorhabditis.">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li><li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis.">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li><li>Boemare, N., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology,+taxonomy+and+systematics+of+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> Entomopathogenic Nematology. , (2002).</li><li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genera+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> The Prokaryotes. , 473-488 (2002).</li><li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+(Diptera)+and+Galleria+mellonella+(Lepidoptera).">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li><li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).</li><li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes.">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li><li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li><li>Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+insect+nematology.">Techniques in insect nematology.</a> Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).</li><li>Koppenh&#246;fer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Symbionts+of+Steinernema+and+Heterorhabditis.">Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis.</a> Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).</li><li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp.">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li><li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae,+Heterorhabditidae).">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+(Steinernematidae:+Nematoda).">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li><li>Poinar, G. O., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+(Achromobacteriaceae:+Eubacteriales)+associated+with+a+nematode.">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li><li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pag&#232;s, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Breh&#233;li, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila,+its+nematode+vector,+and+insect+hosts.">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li><li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pag&#232;s, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+(Steinernema)+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+(Xenorhabdus).">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li><li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host,+Steinernema+carpocapsae.">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li><li>Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+parasites,+pathogens+and+associated+of+insects+and+invertebrates+of+economic+importance.">Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Uygun bir ana bilgisayar kullanarak EPN in vivo yetiştirilmesinde başarılı bir anahtar faktördür. Genellikle, hem steinernematids ve heterorhabditids üretebileceği ve başarıyla büyük bal mumu güvesi Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) larvaları onların yaşam döngüsünü tamamlamak. Ancak, farklı aileleri ve / veya siparişlerin diğer böcek türleri olarak kabul edilebilir. Güncel olarak nematod türlerinin bir kaç özel bir böcek ev sahibi hücresi için özgüllüğe sahip olduğu bilinmektedir. Örneğin S. ve S. kushidai scarabaei lepidopretan larvanın çok virülan değildir ve bu laboratuarda başarılı bir şekilde yetiştirilmesi için bok böceği larvaları (Scarabaeitler) halinde koleopteran larva gerekir. Başka bir türü, S. scapterisci, örneğin cırcır veya danaburunları gibi orthopteran böcekleri tercih. Uygun bir konakçı mevcut değildir ya da deneysel koşullar gerektirdiğinde, in vitro yöntemler EP yetiştirmesi için kullanılabilecektir zamanN. Bu yöntemler nematod ve bakteriyel simbiont için besin zengin bir kaynak sunan ortamları kullanın. Bu sunumda ya da simbiyotik bakteri olmadan başarılı büyüme ve EPN üreme için kullanılabilir agar (karaciğer-böbrek ve lipid) iki tür nitelendirdi. Kullanıcılar, karaciğer-böbrek ağar zengin medya ve bu nedenle kolaylıkla kontamine olduğundan farkında olmalıdır. Steril teknik prosedürünün her aşamasında axenized yumurta ve İnoküle plakaları hem ele tavsiye edilir. Bir bakteri ya da mantar ile kirlenmiş olan Tabaklar hemen atılmalıdır. Aposymbiotic Steinernema Ijs yetiştirme zaman onlar Ksenorhabdus bakteri liman olabilir gibi, bakım, düzgün dişi nematod dokuları parçalamak için alınmalıdır. Ayrıca, IJ gerçekten simbiyotik bakterilerin serbest olduğunu doğrulamak üzere, bir el moto LB içerisinde taze hasat IJs örneğinin taşlama tavsiye(Heungens ve ark. 2002) başı olarak 7 havan r-odaklı ve NBTA medyanın 1 üzerine süspansiyon plaka. Bakteri kolonileri (gece boyu inkübasyondan sonra) bulunursa, bunun zayıf bir axenization tekniğin bir gösterge ya da kirlenme sonucu olarak mevcut olacaktır. Aposymbiotic Steinernema nematod yetiştirme ayrıca usul ve deneyler geniş bir dizi kabul edilebilir bir tekniktir. Okuyucular birden fazla jenerasyon boyunca simbiont olmadan yetiştirme Steinernema nematodlarının etkisi nesil kere nematod fitness ve sağkalım üzerinde etkisi olabilir farkında olmalıdır. Birkaç çalışmaları doğal sistemlerde 5,11,15-17 kendi eşleştirme gerekliliğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu tür çalışmalar, sınırlı sayıda yapılmış ve daha fazla araştırılması gereklidir.

Entomopatojenik nematodlar (EPN) Steinernema ve Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterohabditidae) ve bakteriyel simbiont, Ksenorhabdus ve Fotorhabdus spp (Enterobacteriaceae) karasal hayvan-mikrop simbiyotik ilişkiler 2-4,6,10,19. Ksenorhabdus ve Fotorhabdus spp acil bir model olarak kabul edilir. Ayrıca, enfeksiyon juvenil (IJ) veya 3. aşamasında genç 8,10,13 infektif olarak bilinen nematodların sadece serbest yaşayan aşamasının bağırsakta simbiont olarak harbored. Bakteri-nematod çifti böceklerin geniş bir yelpazede için patojen olduğunu ve başarılı biyolojik kontrol ve entegre zararlı yönetimi programlarında, dünya çapında 6,8 uygulamaya konmuştur. Bu yazıda in vivo ve sık sık laboratuar koşullarında EPN beslenmesinde icra in vitro teknikleri bir seçim göstermektedir. Iin vivo koşullarda yöntem nematodların yetiştirmesi için bir böcek ev sahibi tasarlamaktadırlar. Genellikle, çeşitli böcek emir (yani Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, vb.) Olgunlaşmamış aşamaları uygun ana olarak kabul edilir. Yöntemler genellikle laboratuvarda nematod kültürlerin bakım için kabul edilir in vivo. Nematodların seri üretim söz konusu olduğunda, bu yöntem uygun olmayabilir. Haşere büyük miktarlarda daha fazla zaman ve böcek yetiştirme ile ilgili ek bir maliyet gerektiren bu amaç için gerekli olabilir. Entomopatojenik nematodlar da çeşitli medya üzerinde in vitro kültür edilebilir. Çalışmanın amacına bağlı olarak; in vitro yöntemler medyada simbiyotik bakterilerin katılmasını düşünebilirsiniz ya. Bu sunumda, EPN yayılması için iki yaygın kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. Medyanın maddeler simbiyotik bakteri a için besin kaynağı sağlamaknd nematod için bir sterol kaynağı. in vitro yöntemler bir böcek konak olmadan Advantage EPN bir yetiştirme sunuyoruz. Uygun böcek ana mevcut olmadığında Başlangıçta, gelişmiş in vitro ortam maddesinin bir çok EPN çoğalması için kullanılmıştır. Ancak, son yıllarda, in vitro yetiştirme yöntemleri yaygın olarak EPN ve simbiyotik bakteriler 17,19 arasındaki Mutualistik ilişkiyi anlamak amacıyla araştırma istihdam haline gelmiştir. Bu sunumda ayrıntılı teknikler Stock Laboratuvarı, Arizona (Tucson, AZ, ABD) Üniversitesi tarafından çeşitli yazarlar tarafından açıklanan ve rafine karşılık gelir. Bu teknikler, haşere yönetimi için, bu organizmaların seri üretiminde kullanılan tekniklerin gövdesinden ayrıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1827">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:485px;">Material&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Company</td>
			<td style="width:488px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:485px;">For in vivo Infections</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:488px;">25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:485px;">Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose</td>
			<td style="width:260px;">Whatman/VWR</td>
			<td style="width:488px;">28450-081</td>
			<td style="width:595px;">Grade 1 filter paper recommended</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:485px;">Insect hosts</td>
			<td style="width:260px;">Timberline</td>
			<td style="width:488px;">http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td>
			<td style="width:595px;">Galleria mellonella are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:485px;">For Liver-Kidney Agar (for 500 ml)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:485px;">60 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Beef Liver, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:485px;">Beef Kidney, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration )</td>
			<td style="width:260px;">Acros/VWR</td>
			<td>200002-434</td>
			<td style="width:595px;">any research grade NaCl can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">500 ml distilled H20&#160;</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">For Lipid Agar (for 1 L)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Nutrient Broth, 8 g</td>
			<td style="width:260px;">BD/VWR</td>
			<td>90002-660</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Yeast Extract, 5g</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM1.03753.0500</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Magnesium Chloride Hexahydrate,&#160; 10 ml (0.2g/ml)</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM-MX0045-1</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">Corn Oil, 4 ml</td>
			<td style="width:260px;">Any brand</td>
			<td style="width:488px;">Locally source; supermarket</td>
			<td style="width:595px;">Any brand of corn oil can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:485px;">Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity</td>
			<td style="width:260px;">Karo</td>
			<td style="width:488px;">Locally sourced; supermarket</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar, 15 g</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Distilled H20,890 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

Photorhabdus heterorhabditids arasında simbiont ise entomopatojenik nematod (EPN) (Steinernematidae ve Heterorhabditidae) Enterobacteriaceae. Ksenorhabdus bakteri steinernematids nematodlar ile ilişkili aile, Gram-negatif Gamma Proteobacteria bir Mutualistik ortaklık var. Birlikte nematodlar ve bakteriler, bir yakın ve belirli ortak olarak böcek türlerinin geniş bir yelpazede öldüren da güçlü bir insektisid kompleksi oluşturur. Bu yazıda, in vivo ve yaygın laboratuar koşullarında bu nematodlarının yetiştirilmesinde kullanılan in vitro teknikler göstermektedir. Dahası, bu teknikler EPN&#39;dir kültürlerin başarılı kurulması için önemli adımlar temsil ve ayrıca araştırma bu organizmaları kullanan diğer biyoanalizlerin için temelini oluşturur. Aposymbiotic (symbiont-serbest) nematod üretim genellikle ortak yaşam çalışmaya derinlemesine bir ve çok yönlü bir yaklaşım için önemlidir. BuProtokol antibiyotik eklenmesini gerektirmez ve standart laboratuar ekipmanı ile kısa bir miktarda yapılabilir. Muhafaza açısından hayatta kalma kullanılan türlere bağlı olarak değişebilir, ancak bu şekilde üretilen Nematodlar nispeten sağlamdır. Bu sunumda ayrıntılı teknikler P. Hazır Laboratuvarı, Arizona Üniversitesi (Tucson, AZ, ABD) çeşitli yazarlar tarafından açıklanan ve rafine karşılık gelir. Bu teknikler, haşere yönetimi için, bu organizmaların seri üretiminde kullanılan tekniklerin gövdesinden ayrıdır.

In vivo yetiştirme yöntemi nematod büyüme ve üreme için ev sahibi olarak canlı böcekleri kullanır. Enfeksiyon odaları böcekler Ijs sergilemek için etkili bir yöntemdir. Bu, başka bir böcek ev sahibi hücresi, bakteriyel vektörleri symbionts nematodlara yaşam döngüsünün tek bir aşamadır. 1 bir enfeksiyon bölmesi hem de bu bölme oluşturmak için gereken malzemeler için ayarlanmış göstermektedir. In vitro yetiştirme yöntemleri sağlar EPN Bir böcek ev sahibi olmadan büyümesi, aynı zamanda aposymbiotic (ortak yaşar içermeyen) nematodların yetiştirmesi için uygulanmaktadır. Şekil 2 değişik iplik kurdu etaplı bir lipid agar plakasını göstermektedir. Lipit agar plakaları, aynı zamanda, biyolojik türler kavramına dayanmaktadır nematod kimliğini doğrulamak için gerekli olan çapraz melezleme testleri düşünülebilir. Karaciğer, böbrek ağar yöntemi başlangıçta Poinar ve Thomas (1966) 14 tarafından tarif edilmiştir. Bu yöntem, nematodlar ve olgun çoğalır sağlarBir böcek ev sahibi olmadan E ve simbiyotik bakterilerin olmadan arka nematodlara için kullanılabilir (yani, iplik kurdu aposymbiotic üretmek için). Bu yöntemin bir dezavantajı, istenmeyen bakteri veya mantar büyümesini. Şekil 3A IJS plaka tarafında tarama ile karaciğer-böbrek agar gösterir imkan tanıması zengin doğası kirlenmeye eğilimli olmasıdır. Bu aşamada Petri kabı alt kısım, modifiye edilmiş beyaz tuzak aktarılabilir. Şekil 3B IJs döl toplama için modifiye edilmiş bir beyaz kapanında Steinernema nematod ile bir karaciğer-böbrek plakasını gösterir. Şekil 4A&#39;ya gebe olan bir izleme camı gösterilmektedir önce kendi axenization için Steinernema kadın. Şekil 4B bir diseksiyon iğne ile kadın bozulması görüntüler. Şekil 4C axenizing çözeltide kadın bozulduğu gösterir. Şekil 4D nematod Steinernem bozulmamış bir yumurta gösterirBir carpocapsae. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52096/52096fig1highres.jpg" width="500" /> EPN in vivo yetiştirmesi için bir enfeksiyon odasının Şekil 1. Set up. Üst satır, 5 cm Petri ve filtre kağıdı gösterir. Alt satır 10 cm Petri ve filtre kağıdı görüntüler. Böcek larvalarının Bildirimi sayısı her enfeksiyon bölmeye eklenir. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52096/52096fig2highres.jpg" width="500" /> EPN in vitro yetiştirmesi için Şekil 2. Lipit ağar yöntemi. Görüntü yetişkin Nematodlar ortamda gelişen bir çanak bir close-up (20X büyütme) göstermektedir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52096 / 52096fig3highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 3. Karaciğer-böbrek agar. Solda Image nematod başarılı büyüme ile bir tabak gösterir. Yemeğin tarafında tarama nematod dikkat edin. Resim B IJ nematodlarının hasat için değiştirilmiş Beyaz tuzak yerleştirilen bir karaciğer-böbrek agar plaka gösterir. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52096/52096fig4highres.jpg" width="500" /> Axenizing içinde gebe kadınlarda Şekil 4. İzle camı çözeltisi. Image axenizing çözeltisi içinde gebe kadın gösterir. Resim B Diseksiyon iğne ile kadın taşlama gösterir. Resim C görüntüler kadın bozulur. Görüntü D nematod Steinernema carpocapsae bozulmamış bir yumurta gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae at JoVE.com

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Bu sunumun amacı in vivo ve entomopatojen nematodların yetiştirmesi için in vitro teknikleri göstermektir., In vitro yöntemler zengin ağar medya kullanmak ise in vivo yöntemler, bir böceğin bu nematodların yetiştirme düşünün.

In vivo ve in vitro Entomopatojenik Nematodlar Yetiştiriciliğinin olarak (Steinernematidae ve Heterohabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.4K Görüntüleme.  University of Arizona.  Bu sunumun amacı in vivo ve entomopatojen nematodların yetiştirmesi için in vitro teknikleri göstermektir., In vitro yöntemler zengin ağar medya kullanmak ise in vivo yöntemler, bir böceğin bu nematodların yetiştirme düşünün. 

Video: In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Biyomühendislik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Katı, sabit ve lekeli, genel olarak, milimetre ölçekli örnekler için bölüm ücretsiz 3D Histoloji mikro bilgisayarlı tomografi tarafından katıştırma

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...