Die Autoren möchten Vergangenheit Mitglieder der Lizenz Labor danken: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson und Sam-Kyu Kim für ihre Beiträge zur Verbesserung der viele dieser Protokolle. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Foundation Grant IOS-0840932 und 0724978 IOS-SP Auf finanziert

1. In vivo Tierhaltung von Nematoden mit ihren Symboitic Bakterien <ol><li> Invertieren 100 x 15 mm Kunststoff-Petrischale und legen zwei Scheiben aus Filterpapier (90 mm) in den Deckel der Schale. </li><li> Gleichmäßig zu verteilen 1 ml der IJ (infektiöser Jugend) Wasser-Suspension (bei einer Konzentration von 1.000-2.000 IJ / ml) auf dem Filterpapier. HINWEIS: IJ müssen nicht oberflächensterilisiert werden. </li><li> Fügen Sie 10 letzten Larvenstadium der größeren waxmoth Galleria mellon in die Schale. Das Ziel ist, etwa 100-200 IJs / Larve ist. </li><li> Decken Sie den Deckel mit dem Boden der Petrischale (Bild 1) und beschriften Sie die Petrischale. Erwähnen Sie die folgenden Informationen: Name Nematodenarten (wenn bekannt); isolieren Code / Bezeichnung; Datum Infektion Falle war gestellt. </li><li> Die Schale in einem lose verschlossenen Plastikbeutel (um Feuchtigkeit zu erhalten) und halten Sie sie in der Dunkelheit bei Raumtemperatur oder in einem Inkubator zwischen 20-25 ° C. Überprüfen Gerichte täglich HINWEIS: Darkness erleichtert Nematodeninfektion, wie es natürliche Infektionsbedingungen im Boden imitiert. </li><li> Nach 3-5 Tagen, entfernen Leichen mit Zeichen der Nematodeninfektion zu einer veränderten Weiß Falle 7. Hinweis: Wenn die Leichen riechen faulig, kann dies ein Hinweis, dass die Kultivierung nicht erfolgreich war und / oder es gab Verunreinigungen sein. Stellen Sie eine neue Infektion Kammer mit einer neuen Charge von Nematoden und Insekten. </li></ol> 2. In-vitro-Aufzucht von Nematoden mit ihrem symbiotischen Bakterien <ol><li> Leber-Nieren-Agar-Methode 9,19 <ol><li> Hacken Leber und Niere in kleine Stücke (2 cm 3 oder kleiner) und in einen Mixer mit NaCl, Agar und 300 ml Wasser und mischen, bis das Fleisch wird flüssig Zellstoff, dicke Paste oder Püree. Dann übertragen Mischung in einen 1 l-Erlenmeyerkolben. </li><li> Fügen Sie die restlichen 200 ml Wasser in den Mischer Gefäß umfüllen und alle restlichen Medien in derErlenmeyerkolben. Autoklav für 15 Minuten bei 121 ° C aufweist. Nach dem Autoklavieren Agar abkühlen lassen, um vor dem Gießen zu berühren. HINWEIS: Pipettieren von Medium wird nicht empfohlen, da dieses Medium dazu neigt, Fleischstücke zu haben. </li><li> Gießen ~ 20 ml Agar auf 5 (oder 6) cm Petrischalen während Hand Rühren oder Schütteln des Erlenmeyer-Kolben zwischen gießt für eine homogene Medien. Ermöglichen Agar bei 4 ° C erstarren und zu speichern, bis sie gebraucht Gerichte Hinweis: Verwenden Sie eine Flamme sterilisiert Metallspachtel, um jegliche große Stücke Fleisch in der Petrischale gegossen. </li></ol></li><li> Lipid-Agar-Methode 9,19 <ol><li> Vorbereitung Lipid-Agarmedium durch Vermischen Nährbrühe, Agar und Hefeextrakt und gießen mischen in einen 2 l-Erlenmeyerkolben. Destilliert add H 2 O und MgCl 2 • 6H 2 O und Autoklaven für 15 min bei 121 ° C aufweist. </li><li> Fügen sterile Mischung aus Maisöl und Maissirup Mischung und rühren oder wirbeln kräftig und oft zu Öltröpfchen gleichmäßig verteilt. <br/&gt; Hinweis: Sterilisieren Maisöl und Sirup, indem die benötigte Menge in einem UV-Crosslinker. Das Öl wird nicht in der Flüssigkeit auflösen, aber stellen Sie sicher, dass es in winzigen Tröpfchen. </li><li> Gießen ~ 20 ml Agar auf eine 5 (oder 6) cm Petrischalen und ermöglichen Agar bei 4 ° C erstarren und zu speichern, bis sie gebraucht Gerichte. </li><li> Streak die gewünschte symbiotischen Bakterien auf den Lipid-Agar-Platte und Inkubation Platten bei 28 ° C für 24-48 Stunden. HINWEIS: Spread 100-200 ul über Nacht (12-16 h), LB Subkultur. </li><li> Der Tag nach, fügen Sie ca. 0,4 ml Oberfläche sterilisiert Nematodensuspension (Eier oder infektiöser Jugend) und Inkubation Platten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit oder in einem Brutschrank bei 22 ± 3 ° C. HINWEIS: Nicht mehr als 0,4 ml Suspension Nematoden nicht hinzufügen, da sie eine übermäßig feuchten Umgebung, die ungünstig für Nematoden Wachstum zu schaffen. </li><li> Überwachen Kulturen täglich. Kulturen sollte eine neue Generation von IJs in etwa 12 Tage (Abbildung 2) zu produzieren.</li><li> Übertragen Bodenschale mit Agar, wenn Nematoden gesehen kriechen die Seiten der Schale (3A) auf eine modifizierte Weiß-Falle (siehe Orozco et al. 12) IJs (3B) zu ernten. Führen Sie diesen Schritt unter einer Steril, um eine Kontamination der Medien zu reduzieren. </li><li> Sammeln IJs aus dem modifizierten Weiß Falle beim Austritt und spülen IJ Suspension auf jedes Medium Schmutz zu entfernen. Shop IJ in sterilisiertem destilliertem Wasser bei 10 ° C (in einer kalten Temperatur-Inkubator oder Kühlraum) oder sofort verwenden, wenn nötig. HINWEIS: Je nach Ziel der Studie, Saatgut die Platten entweder mit Symbionten-kolonisierten oder aposymbiotic Nematoden. </li></ol></li></ol> 3. In vitro Aufzucht von Aposymbiotic (Symbiont-frei) Nematoden <ol><li> Infizieren 10-20 G. mellon Larven mit IJs der gewünschten Nematodenarten (siehe Abschnitt 1). Nach 3 oder 4 Tage (zu dieser Zeit IJs sollte gereiftzu Generation Erwachsenen zuerst) sammeln Leichen. HINWEIS: Restlaufzeit und die Anzahl der Frauen benötigt, um eine ausreichende Anzahl von Eiern zu erhalten wird nach Arten variieren. Mehr infizieren G. mellon Larven wenn nötig und starten Dissektionen so früh wie die 48 Stunden nach der Infektion zu beurteilen, ob sie in der richtigen Entwicklungsstadium sind. </li><li> Platzieren Sie jede kadaver individuell in einer Petrischale mit Kochsalzlösung (M9 Puffer 18). Sezieren einen kadaver, indem sein Kopf mit einer feinen Spitze Pinzette. </li><li> Sammeln Sie mindestens 20 trächtige (mit Eiern innen) Frauen mit einer feinen Nadel (L-Form bevorzugt) und legen Sie sie in einem Uhrglas mit 10 ml M9-Puffer (4A). </li><li> Bereiten Sie eine Lösung axenizing unter Berücksichtigung der folgenden Bestandteile: 6,75 ml destilliertem Wasser, 1,25 ml 5 N NaOH und 2,25 ml im Handel erhältlich Bleichlösung zu 3% Hypochlorit verdünnt. HINWEIS: NaOH ist eine Basislösung-Handschuhe, Schutzbrille und andere geeignete SchutzKleidung sollte getragen werden. HINWEIS: Bereiten Sie frischen axenizing Lösung jedes Mal, als Bleich abbaut im Licht. Bereiten Sie mehrere Chargen axenizing Lösung und führen Sie die Oberflächensterilisation und die Ernte von Eiern in mehreren Uhrengläser. </li><li> Spülen Weibchen mindestens dreimal mit M9-Puffer füllt Uhrglas mit Pufferlösung und Ansaugen Puffer mit einer Pipette. Stellen Sie sicher, dass die Frauen in der Uhrenglas bleiben. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. </li><li> Sofort fügen Sie die axenizing Lösung und lassen die Weibchen in dieser Lösung nicht mehr als 10-15 Minuten bleiben. Beachten Sie die Nematoden-Gewebe beginnt zu zerfallen, während die Eier (die gegen den axenizing Lösung sind) intakt bleiben. </li><li> Manuell stören weibliche Körper, um den Prozess zu beschleunigen, indem sie mit einer Nadel oder einem Skalpell (4B, C). Eier entfernen durch Pipettieren sie in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die Vermeidung Zugabe von ungelösten Gewebe. HINWEIS: Die Verwendung als malle Reaktionsgefäße wie nötig, um Eier zu sammeln und arbeiten schnell, da die Lebensfähigkeit der Eier werden über einen längeren Zeitraum der Exposition gegen axenizing Lösung zu verringern. </li><li> Wirbelrohre für 15 Sekunden mit dem &quot;High-Speed-Einstellung&quot;, um weiter zu entfernen Nematoden Gewebe zu den Eiern befestigt. Alternativ, wenn ein Wirbel nicht verfügbar ist, pipettieren oben und unten die Lösung mehrmals. </li><li> Pellet Eier durch Zentrifugation bei ca. 18.000 g für 2 min. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit, wenn Eier nicht ausreichend Pellets. Entfernen axenizing und spülen zweimal durch Füllen des Mikrorohrs mit sterilem destilliertem Wasser und Zentrifuge ein weiteres Mal bei 900 × g für 1 min. </li><li> Nach dem letzten Wasch resuspendieren Eier in 300-500 ul sterilem destilliertem Wasser und legen Sie sie in einer sterilen Petrischale 3 cm oder sterilisiert Uhrglas. Denken Sie daran, dass Eier sind jetzt oberflächensterilisiert, so verwenden sterilen Pipetten und / oder pippetter Tipps und Wasser auf die Sauberkeit der Eier zu erhalten. </li><li>Untersuchen Eier unter einem Binokular (30-50X Vergrößerung) zu bestätigen, dass sie intakt (4D) sind und sie auf einem 5 cm Teller mit Leber-Nieren-Agar (siehe Abschnitt 2.1) HINWEIS: Nicht mehr als 400 ul der Eisuspension hinzufügen nicht auf den Platten, wie es der Agar übermäßig nass zu machen. </li><li> Kennzeichenschilder mit entsprechenden Informationen und speichern sie aufrecht im Dunkeln bei 28 ° C. Schlüpfen der Eier sollte offensichtlich über Nacht sein. HINWEIS: Das Wasser kann auf den Deckel der Schüssel zu verdichten, aber es wird nach 1 bis 2 Tagen verdampfen. Zu dieser Zeit, so wird die Schale in einem Plastikbeutel, um Feuchtigkeit von der Agar-halten und zu vermeiden, dessen Trocknung. </li><li> Beachten Gerichte regelmäßig und werfen Sie alle Gerichte, die Anzeichen von Pilz-oder bakterielle Verunreinigung zu zeigen. Sobald IJs gesehen Migration an der Wand der Petrischale, den Deckel entfernen und den Boden zu übertragen Schale mit Agar zu einem modifizierten Weiß Falle 12. Betrachten sterilen Bedingungen bei der Übertragung die Schale in die ModifieD weiß abzufangen, um eine Kontamination der freigelegten Medien zu vermeiden. </li><li> Weiterhin die Überwachung der Weiß-Fallen und Ernte IJ, wie gebraucht. HINWEIS: Aposymbiotic Nematoden wird auch weiterhin in das Wasser der Weißen Falle für viele Tage und sogar Wochen zu migrieren. </li></ol>

<ol>
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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae,+Heterorhabditidae).">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+(Steinernematidae:+Nematoda).">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li><li>Poinar, G. O., Thomas, G. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit einem geeigneten Wirt ist ein Schlüsselfaktor für die erfolgreiche Aufzucht von in vivo EPN. In der Regel können beide steinernematids und heterorhabditids vervielfältigen und zu ihren Lebenszyklus in Larven der Großen Wachsmotte, Galleria mellon (Lepidoptera: Pyralidae) erfolgreich abgeschlossen. Jedoch können auch andere Insektenarten aus verschiedenen Familien und / oder Bestellungen berücksichtigt werden. Einige der derzeit beschriebenen Nematodenarten sind bekannt, um die Spezifität f?...

Nematoden (EPN) Steinernema und Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) und ihre bakteriellen Symbionten, Xenorhabdus und Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) gelten als eine emergente Modell von Landtier-Mikroben symbiotischen Beziehungen 2-4,6,10,19. Xenorhabdus und Photorhabdus spp. sind als Symbionten im Darm des einzigen frei lebenden Bühne der Nematoden, die auch als infektiöse juvenile (IJ) oder 3. Stufe infektiös Jugend 8,10,13 bekannt hegte. Das Bakterium-Nematoden Paar pathogen ist für eine breite Palette von Insekten und erfolgreich in der biologischen Bekämpfung und des integrierten Pflanzen-Management-Programme weltweit 6,8 umgesetzt worden. Wir zeigen hier eine Auswahl von in vivo und in-vitro-Techniken, die häufig für die Aufzucht von EPN unter Laborbedingungen ausgeübt werden. Ichn-vivo-Verfahren betrachten eine Insektenwirts für die Aufzucht der Nematoden. In der Regel werden unreife Stadien der verschiedenen Insektenordnungen (dh Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) Als geeignete Wirte. In-vivo-Verfahren sind in der Regel für die Wartung der Nematodenkulturen im Labor betrachtet. Dieses Verfahren kann nicht geeignet sein, wenn man die Massenproduktion der Nematoden. Zu diesem Zweck fordern mehr Zeit und zusätzliche Kosten für die Insektenzucht beziehen, können große Mengen von Insekten Hosts erforderlich. Nematoden können auch in vitro an verschiedenen Medien kultiviert werden. Je nach dem Ziel der Studie, in vitro Verfahren können oder betrachten die Einarbeitung der symbiotischen Bakterien in den Medien. In diesem Vortrag beschreiben wir zwei häufig verwendete Methoden für die Verbreitung des EPN. Die Bestandteile der Medien eine Quelle von Nährstoffen für die symbiotischen Bakterium einnd ein Sterin Quelle für die Nematoden. In-vitro-Methoden bieten den Vorteil, die Aufzucht von EPN ohne Insektenwirts. Ursprünglich viele der entwickelten in vitro-Medien wurden für die Multiplikation verwendet werden, wenn geeignete EPN Insektenwirte sind nicht verfügbar. Doch in den vergangenen Jahren, in vitro Aufzuchtmethoden sind allgemein in der Forschung mit dem Ziel, die Beziehung zwischen mutualistic EPN und ihre symbiontischen Bakterien 17,19 verstehen beschäftigt. Die in dieser Präsentation detailliert Techniken entsprechen denen von verschiedenen Autoren beschriebenen und von den Lizenz Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA) verfeinert. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem Körper der Techniken, die in der Massenproduktion dieser Organismen für Schädlingsbekämpfungszwecke verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1827">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:485px;">Material&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Company</td>
			<td style="width:488px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:485px;">For in vivo Infections</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:488px;">25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:485px;">Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose</td>
			<td style="width:260px;">Whatman/VWR</td>
			<td style="width:488px;">28450-081</td>
			<td style="width:595px;">Grade 1 filter paper recommended</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:485px;">Insect hosts</td>
			<td style="width:260px;">Timberline</td>
			<td style="width:488px;">http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td>
			<td style="width:595px;">Galleria mellonella are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:485px;">For Liver-Kidney Agar (for 500 ml)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:485px;">60 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Beef Liver, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:485px;">Beef Kidney, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration )</td>
			<td style="width:260px;">Acros/VWR</td>
			<td>200002-434</td>
			<td style="width:595px;">any research grade NaCl can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">500 ml distilled H20&#160;</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">For Lipid Agar (for 1 L)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Nutrient Broth, 8 g</td>
			<td style="width:260px;">BD/VWR</td>
			<td>90002-660</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Yeast Extract, 5g</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM1.03753.0500</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Magnesium Chloride Hexahydrate,&#160; 10 ml (0.2g/ml)</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM-MX0045-1</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">Corn Oil, 4 ml</td>
			<td style="width:260px;">Any brand</td>
			<td style="width:488px;">Locally source; supermarket</td>
			<td style="width:595px;">Any brand of corn oil can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:485px;">Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity</td>
			<td style="width:260px;">Karo</td>
			<td style="width:488px;">Locally sourced; supermarket</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar, 15 g</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Distilled H20,890 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

Nematoden (EPN) (Steinernematidae und Heterorhabditidae) haben eine Partnerschaft mit mutualistic Gram-negative Gamma-Proteobakterien in der Familie der Enterobacteriaceae. Xenorhabdus Bakterien mit steinernematids Nematoden assoziiert, während Photorhabdus sind Symbionten heterorhabditids. Zusammen Nematoden und Bakterien bilden eine hohe insektizide Komplex, der eine breite Palette von Insektenarten in einer intimen und besonderen Partnerschaft tötet. Hier zeigen wir, in vivo und in vitro Techniken, die üblicherweise bei der Aufzucht dieser Nematoden unter Laborbedingungen eingesetzt. Darüber hinaus sind diese Techniken stellen wichtige Schritte für die erfolgreiche Etablierung von EPN Kulturen und bilden auch die Grundlage für andere Studien, die sich diese Organismen für die Forschung zu nutzen. Die Produktion von aposymbiotic (Symbiont-frei) Nematoden ist oft entscheidend für eine gründliche und vielseitige Herangehensweise an das Studium der Symbiose. DiesProtokoll erfordert nicht die Zugabe von Antibiotika und können in kürzester Zeit mit Standard-Laborausrüstung durchgeführt werden. Nematoden, die in dieser Weise hergestellt werden, sind relativ stabil, obwohl ihr Überleben in Speicher kann je nach den verwendeten Arten variieren. Die in dieser Präsentation detailliert Techniken entsprechen denen von verschiedenen Autoren beschrieben und P. Auf der Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA) verfeinert. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem Körper der Techniken, die in der Massenproduktion dieser Organismen für Schädlingsbekämpfungszwecke verwendet werden.

Die In-vivo-Methode verwendet Aufzucht lebenden Insekten als Wirte für die Nematoden-Wachstum und Fortpflanzung. Infektionskammern sind ein effizientes Verfahren zum Aussetzen von Insekten IJs. Dies ist die einzige Phase im Lebenszyklus des Nematoden, die die bakteriellen Symbionten von einem Host zu einem anderen Insektenvektoren. Abbildung 1 zeigt für eine Infektion Kammer sowie der benötigt wird, um diese Kammer bauen die Materialien eingerichtet. In-vitro-Methoden ermöglichen d...

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In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Das Ziel dieser Präsentation ist es, in vivo und in-vitro-Techniken für die Aufzucht von insektenpathogenen Nematoden zu demonstrieren. In-vivo-Verfahren betrachten die Aufzucht dieser Nematoden mit einer Insektenwirts, während die in-vitro-Methoden zu nutzen reichen Agar-Medien.

In-vivo-und In-vitro-Aufzucht von Nematoden (Steinernematidae und Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.4K Aufrufe.  University of Arizona.  Das Ziel dieser Präsentation ist es, in vivo und in-vitro-Techniken für die Aufzucht von insektenpathogenen Nematoden zu demonstrieren. In-vivo-Verfahren betrachten die Aufzucht dieser Nematoden mit einer Insektenwirts, während die in-vitro-Methoden zu nutzen reichen Agar-Medien. 

Serie: In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Forschung

Biotechnik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is catheter-directed thrombolytics (CDT). To mitigate caustic side effects and the long treatment time associated with CDT, adjuvant and alternative approaches are under development. One such approach is histotripsy, a focused ultrasound therapy to ablate tissue via bubble cloud nucleation. Pre-clinical studies have demonstrated strong synergy between histotripsy and thrombolytics for clot degradation. This report outlines a benchtop method to assess the efficacy of histotripsy-aided thrombolytic therapy, or lysotripsy.
Clots manufactured from fresh human venous blood were introduced into a flow channel whose dimensions and acousto-mechanical properties mimic an iliofemoral vein. The channel was perfused with plasma and the lytic&#160;recombinant tissue-type plasminogen activator. Bubble clouds were generated in the clot with a focused ultrasound source designed for the treatment of femoral venous clots. Motorized positioners were used to translate the source focus along the clot length. At each insonation location, acoustic emissions from the bubble cloud were passively recorded, and beamformed to generate passive cavitation images. Metrics to gauge treatment efficacy included clot mass loss (overall treatment efficacy), and the concentrations of D-dimer (fibrinolysis) and hemoglobin (hemolysis) in the perfusate. There are limitations to this in vitro design, including lack of means to assess in vivo side effects or dynamic changes in flow rate as the clot lyses. Overall, the setup provides an effective method to assess the efficacy of histotripsy-based strategies to treat DVT.

Histotripsy-aided lytic delivery or lysotripsy is under development for the treatment of deep vein thrombosis. An in vitro procedure is presented here to assess the efficacy of this combination therapy. Key protocols for the clot model, image guidance, and assessment of treatment efficacy are discussed.