Name: in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)
Uploaded: 2014-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
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Die Autoren möchten Vergangenheit Mitglieder der Lizenz Labor danken: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson und Sam-Kyu Kim für ihre Beiträge zur Verbesserung der viele dieser Protokolle. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Foundation Grant IOS-0840932 und 0724978 IOS-SP Auf finanziert

1. In vivo Tierhaltung von Nematoden mit ihren Symboitic Bakterien <ol><li> Invertieren 100 x 15 mm Kunststoff-Petrischale und legen zwei Scheiben aus Filterpapier (90 mm) in den Deckel der Schale. </li><li> Gleichmäßig zu verteilen 1 ml der IJ (infektiöser Jugend) Wasser-Suspension (bei einer Konzentration von 1.000-2.000 IJ / ml) auf dem Filterpapier. HINWEIS: IJ müssen nicht oberflächensterilisiert werden. </li><li> Fügen Sie 10 letzten Larvenstadium der größeren waxmoth Galleria mellon in die Schale. Das Ziel ist, etwa 100-200 IJs / Larve ist. </li><li> Decken Sie den Deckel mit dem Boden der Petrischale (Bild 1) und beschriften Sie die Petrischale. Erwähnen Sie die folgenden Informationen: Name Nematodenarten (wenn bekannt); isolieren Code / Bezeichnung; Datum Infektion Falle war gestellt. </li><li> Die Schale in einem lose verschlossenen Plastikbeutel (um Feuchtigkeit zu erhalten) und halten Sie sie in der Dunkelheit bei Raumtemperatur oder in einem Inkubator zwischen 20-25 ° C. Überprüfen Gerichte täglich HINWEIS: Darkness erleichtert Nematodeninfektion, wie es natürliche Infektionsbedingungen im Boden imitiert. </li><li> Nach 3-5 Tagen, entfernen Leichen mit Zeichen der Nematodeninfektion zu einer veränderten Weiß Falle 7. Hinweis: Wenn die Leichen riechen faulig, kann dies ein Hinweis, dass die Kultivierung nicht erfolgreich war und / oder es gab Verunreinigungen sein. Stellen Sie eine neue Infektion Kammer mit einer neuen Charge von Nematoden und Insekten. </li></ol> 2. In-vitro-Aufzucht von Nematoden mit ihrem symbiotischen Bakterien <ol><li> Leber-Nieren-Agar-Methode 9,19 <ol><li> Hacken Leber und Niere in kleine Stücke (2 cm 3 oder kleiner) und in einen Mixer mit NaCl, Agar und 300 ml Wasser und mischen, bis das Fleisch wird flüssig Zellstoff, dicke Paste oder Püree. Dann übertragen Mischung in einen 1 l-Erlenmeyerkolben. </li><li> Fügen Sie die restlichen 200 ml Wasser in den Mischer Gefäß umfüllen und alle restlichen Medien in derErlenmeyerkolben. Autoklav für 15 Minuten bei 121 ° C aufweist. Nach dem Autoklavieren Agar abkühlen lassen, um vor dem Gießen zu berühren. HINWEIS: Pipettieren von Medium wird nicht empfohlen, da dieses Medium dazu neigt, Fleischstücke zu haben. </li><li> Gießen ~ 20 ml Agar auf 5 (oder 6) cm Petrischalen während Hand Rühren oder Schütteln des Erlenmeyer-Kolben zwischen gießt für eine homogene Medien. Ermöglichen Agar bei 4 ° C erstarren und zu speichern, bis sie gebraucht Gerichte Hinweis: Verwenden Sie eine Flamme sterilisiert Metallspachtel, um jegliche große Stücke Fleisch in der Petrischale gegossen. </li></ol></li><li> Lipid-Agar-Methode 9,19 <ol><li> Vorbereitung Lipid-Agarmedium durch Vermischen Nährbrühe, Agar und Hefeextrakt und gießen mischen in einen 2 l-Erlenmeyerkolben. Destilliert add H 2 O und MgCl 2 • 6H 2 O und Autoklaven für 15 min bei 121 ° C aufweist. </li><li> Fügen sterile Mischung aus Maisöl und Maissirup Mischung und rühren oder wirbeln kräftig und oft zu Öltröpfchen gleichmäßig verteilt. <br/&gt; Hinweis: Sterilisieren Maisöl und Sirup, indem die benötigte Menge in einem UV-Crosslinker. Das Öl wird nicht in der Flüssigkeit auflösen, aber stellen Sie sicher, dass es in winzigen Tröpfchen. </li><li> Gießen ~ 20 ml Agar auf eine 5 (oder 6) cm Petrischalen und ermöglichen Agar bei 4 ° C erstarren und zu speichern, bis sie gebraucht Gerichte. </li><li> Streak die gewünschte symbiotischen Bakterien auf den Lipid-Agar-Platte und Inkubation Platten bei 28 ° C für 24-48 Stunden. HINWEIS: Spread 100-200 ul über Nacht (12-16 h), LB Subkultur. </li><li> Der Tag nach, fügen Sie ca. 0,4 ml Oberfläche sterilisiert Nematodensuspension (Eier oder infektiöser Jugend) und Inkubation Platten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit oder in einem Brutschrank bei 22 ± 3 ° C. HINWEIS: Nicht mehr als 0,4 ml Suspension Nematoden nicht hinzufügen, da sie eine übermäßig feuchten Umgebung, die ungünstig für Nematoden Wachstum zu schaffen. </li><li> Überwachen Kulturen täglich. Kulturen sollte eine neue Generation von IJs in etwa 12 Tage (Abbildung 2) zu produzieren.</li><li> Übertragen Bodenschale mit Agar, wenn Nematoden gesehen kriechen die Seiten der Schale (3A) auf eine modifizierte Weiß-Falle (siehe Orozco et al. 12) IJs (3B) zu ernten. Führen Sie diesen Schritt unter einer Steril, um eine Kontamination der Medien zu reduzieren. </li><li> Sammeln IJs aus dem modifizierten Weiß Falle beim Austritt und spülen IJ Suspension auf jedes Medium Schmutz zu entfernen. Shop IJ in sterilisiertem destilliertem Wasser bei 10 ° C (in einer kalten Temperatur-Inkubator oder Kühlraum) oder sofort verwenden, wenn nötig. HINWEIS: Je nach Ziel der Studie, Saatgut die Platten entweder mit Symbionten-kolonisierten oder aposymbiotic Nematoden. </li></ol></li></ol> 3. In vitro Aufzucht von Aposymbiotic (Symbiont-frei) Nematoden <ol><li> Infizieren 10-20 G. mellon Larven mit IJs der gewünschten Nematodenarten (siehe Abschnitt 1). Nach 3 oder 4 Tage (zu dieser Zeit IJs sollte gereiftzu Generation Erwachsenen zuerst) sammeln Leichen. HINWEIS: Restlaufzeit und die Anzahl der Frauen benötigt, um eine ausreichende Anzahl von Eiern zu erhalten wird nach Arten variieren. Mehr infizieren G. mellon Larven wenn nötig und starten Dissektionen so früh wie die 48 Stunden nach der Infektion zu beurteilen, ob sie in der richtigen Entwicklungsstadium sind. </li><li> Platzieren Sie jede kadaver individuell in einer Petrischale mit Kochsalzlösung (M9 Puffer 18). Sezieren einen kadaver, indem sein Kopf mit einer feinen Spitze Pinzette. </li><li> Sammeln Sie mindestens 20 trächtige (mit Eiern innen) Frauen mit einer feinen Nadel (L-Form bevorzugt) und legen Sie sie in einem Uhrglas mit 10 ml M9-Puffer (4A). </li><li> Bereiten Sie eine Lösung axenizing unter Berücksichtigung der folgenden Bestandteile: 6,75 ml destilliertem Wasser, 1,25 ml 5 N NaOH und 2,25 ml im Handel erhältlich Bleichlösung zu 3% Hypochlorit verdünnt. HINWEIS: NaOH ist eine Basislösung-Handschuhe, Schutzbrille und andere geeignete SchutzKleidung sollte getragen werden. HINWEIS: Bereiten Sie frischen axenizing Lösung jedes Mal, als Bleich abbaut im Licht. Bereiten Sie mehrere Chargen axenizing Lösung und führen Sie die Oberflächensterilisation und die Ernte von Eiern in mehreren Uhrengläser. </li><li> Spülen Weibchen mindestens dreimal mit M9-Puffer füllt Uhrglas mit Pufferlösung und Ansaugen Puffer mit einer Pipette. Stellen Sie sicher, dass die Frauen in der Uhrenglas bleiben. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. </li><li> Sofort fügen Sie die axenizing Lösung und lassen die Weibchen in dieser Lösung nicht mehr als 10-15 Minuten bleiben. Beachten Sie die Nematoden-Gewebe beginnt zu zerfallen, während die Eier (die gegen den axenizing Lösung sind) intakt bleiben. </li><li> Manuell stören weibliche Körper, um den Prozess zu beschleunigen, indem sie mit einer Nadel oder einem Skalpell (4B, C). Eier entfernen durch Pipettieren sie in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die Vermeidung Zugabe von ungelösten Gewebe. HINWEIS: Die Verwendung als malle Reaktionsgefäße wie nötig, um Eier zu sammeln und arbeiten schnell, da die Lebensfähigkeit der Eier werden über einen längeren Zeitraum der Exposition gegen axenizing Lösung zu verringern. </li><li> Wirbelrohre für 15 Sekunden mit dem &quot;High-Speed-Einstellung&quot;, um weiter zu entfernen Nematoden Gewebe zu den Eiern befestigt. Alternativ, wenn ein Wirbel nicht verfügbar ist, pipettieren oben und unten die Lösung mehrmals. </li><li> Pellet Eier durch Zentrifugation bei ca. 18.000 g für 2 min. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit, wenn Eier nicht ausreichend Pellets. Entfernen axenizing und spülen zweimal durch Füllen des Mikrorohrs mit sterilem destilliertem Wasser und Zentrifuge ein weiteres Mal bei 900 × g für 1 min. </li><li> Nach dem letzten Wasch resuspendieren Eier in 300-500 ul sterilem destilliertem Wasser und legen Sie sie in einer sterilen Petrischale 3 cm oder sterilisiert Uhrglas. Denken Sie daran, dass Eier sind jetzt oberflächensterilisiert, so verwenden sterilen Pipetten und / oder pippetter Tipps und Wasser auf die Sauberkeit der Eier zu erhalten. </li><li>Untersuchen Eier unter einem Binokular (30-50X Vergrößerung) zu bestätigen, dass sie intakt (4D) sind und sie auf einem 5 cm Teller mit Leber-Nieren-Agar (siehe Abschnitt 2.1) HINWEIS: Nicht mehr als 400 ul der Eisuspension hinzufügen nicht auf den Platten, wie es der Agar übermäßig nass zu machen. </li><li> Kennzeichenschilder mit entsprechenden Informationen und speichern sie aufrecht im Dunkeln bei 28 ° C. Schlüpfen der Eier sollte offensichtlich über Nacht sein. HINWEIS: Das Wasser kann auf den Deckel der Schüssel zu verdichten, aber es wird nach 1 bis 2 Tagen verdampfen. Zu dieser Zeit, so wird die Schale in einem Plastikbeutel, um Feuchtigkeit von der Agar-halten und zu vermeiden, dessen Trocknung. </li><li> Beachten Gerichte regelmäßig und werfen Sie alle Gerichte, die Anzeichen von Pilz-oder bakterielle Verunreinigung zu zeigen. Sobald IJs gesehen Migration an der Wand der Petrischale, den Deckel entfernen und den Boden zu übertragen Schale mit Agar zu einem modifizierten Weiß Falle 12. Betrachten sterilen Bedingungen bei der Übertragung die Schale in die ModifieD weiß abzufangen, um eine Kontamination der freigelegten Medien zu vermeiden. </li><li> Weiterhin die Überwachung der Weiß-Fallen und Ernte IJ, wie gebraucht. HINWEIS: Aposymbiotic Nematoden wird auch weiterhin in das Wasser der Weißen Falle für viele Tage und sogar Wochen zu migrieren. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit einem geeigneten Wirt ist ein Schlüsselfaktor für die erfolgreiche Aufzucht von in vivo EPN. In der Regel können beide steinernematids und heterorhabditids vervielfältigen und zu ihren Lebenszyklus in Larven der Großen Wachsmotte, Galleria mellon (Lepidoptera: Pyralidae) erfolgreich abgeschlossen. Jedoch können auch andere Insektenarten aus verschiedenen Familien und / oder Bestellungen berücksichtigt werden. Einige der derzeit beschriebenen Nematodenarten sind bekannt, um die Spezifität f?...

Nematoden (EPN) Steinernema und Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) und ihre bakteriellen Symbionten, Xenorhabdus und Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) gelten als eine emergente Modell von Landtier-Mikroben symbiotischen Beziehungen 2-4,6,10,19. Xenorhabdus und Photorhabdus spp. sind als Symbionten im Darm des einzigen frei lebenden Bühne der Nematoden, die auch als infektiöse juvenile (IJ) oder 3. Stufe infektiös Jugend 8,10,13 bekannt hegte. Das Bakterium-Nematoden Paar pathogen ist für eine breite Palette von Insekten und erfolgreich in der biologischen Bekämpfung und des integrierten Pflanzen-Management-Programme weltweit 6,8 umgesetzt worden. Wir zeigen hier eine Auswahl von in vivo und in-vitro-Techniken, die häufig für die Aufzucht von EPN unter Laborbedingungen ausgeübt werden. Ichn-vivo-Verfahren betrachten eine Insektenwirts für die Aufzucht der Nematoden. In der Regel werden unreife Stadien der verschiedenen Insektenordnungen (dh Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) Als geeignete Wirte. In-vivo-Verfahren sind in der Regel für die Wartung der Nematodenkulturen im Labor betrachtet. Dieses Verfahren kann nicht geeignet sein, wenn man die Massenproduktion der Nematoden. Zu diesem Zweck fordern mehr Zeit und zusätzliche Kosten für die Insektenzucht beziehen, können große Mengen von Insekten Hosts erforderlich. Nematoden können auch in vitro an verschiedenen Medien kultiviert werden. Je nach dem Ziel der Studie, in vitro Verfahren können oder betrachten die Einarbeitung der symbiotischen Bakterien in den Medien. In diesem Vortrag beschreiben wir zwei häufig verwendete Methoden für die Verbreitung des EPN. Die Bestandteile der Medien eine Quelle von Nährstoffen für die symbiotischen Bakterium einnd ein Sterin Quelle für die Nematoden. In-vitro-Methoden bieten den Vorteil, die Aufzucht von EPN ohne Insektenwirts. Ursprünglich viele der entwickelten in vitro-Medien wurden für die Multiplikation verwendet werden, wenn geeignete EPN Insektenwirte sind nicht verfügbar. Doch in den vergangenen Jahren, in vitro Aufzuchtmethoden sind allgemein in der Forschung mit dem Ziel, die Beziehung zwischen mutualistic EPN und ihre symbiontischen Bakterien 17,19 verstehen beschäftigt. Die in dieser Präsentation detailliert Techniken entsprechen denen von verschiedenen Autoren beschriebenen und von den Lizenz Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA) verfeinert. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem Körper der Techniken, die in der Massenproduktion dieser Organismen für Schädlingsbekämpfungszwecke verwendet werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">For &lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; Infections</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>Grade 1 filter paper recommended</td></tr><tr><td>Insect hosts</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>&lt;em&gt;Galleria mellonella&lt;/em&gt; are recommended</td></tr><tr><td colspan="4">For Liver-kidney Agar (for 500 ml)</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Beef liver, 50 g</td><td>Locally sourced; butcher or supermarket</td><td></td><td>Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td></tr><tr><td>Beef kidney, 50 g</td><td>Locally sourced; butcher or supermarket</td><td></td><td>Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td></tr><tr><td>Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>any research grade NaCl can be used</td></tr><tr><td>Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>any media grade agar can be used</td></tr><tr><td>500 ml distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">For Lipid Agar (for 1 L)</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient broth, 8 g</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract, 5 g</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>Corn oil, 4 ml</td><td>Any brand</td><td>Locally source; supermarket</td><td>Any brand of corn oil can be used</td></tr><tr><td>Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and swirl for homogeneity</td><td>Karo</td><td>Locally sourced; supermarket</td><td></td></tr><tr><td>Agar, 15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>any media grade agar can be used</td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

Nematoden (EPN) (Steinernematidae und Heterorhabditidae) haben eine Partnerschaft mit mutualistic Gram-negative Gamma-Proteobakterien in der Familie der Enterobacteriaceae. Xenorhabdus Bakterien mit steinernematids Nematoden assoziiert, während Photorhabdus sind Symbionten heterorhabditids. Zusammen Nematoden und Bakterien bilden eine hohe insektizide Komplex, der eine breite Palette von Insektenarten in einer intimen und besonderen Partnerschaft tötet. Hier zeigen wir, in vivo und in vitro Techniken, die üblicherweise bei der Aufzucht dieser Nematoden unter Laborbedingungen eingesetzt. Darüber hinaus sind diese Techniken stellen wichtige Schritte für die erfolgreiche Etablierung von EPN Kulturen und bilden auch die Grundlage für andere Studien, die sich diese Organismen für die Forschung zu nutzen. Die Produktion von aposymbiotic (Symbiont-frei) Nematoden ist oft entscheidend für eine gründliche und vielseitige Herangehensweise an das Studium der Symbiose. DiesProtokoll erfordert nicht die Zugabe von Antibiotika und können in kürzester Zeit mit Standard-Laborausrüstung durchgeführt werden. Nematoden, die in dieser Weise hergestellt werden, sind relativ stabil, obwohl ihr Überleben in Speicher kann je nach den verwendeten Arten variieren. Die in dieser Präsentation detailliert Techniken entsprechen denen von verschiedenen Autoren beschrieben und P. Auf der Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA) verfeinert. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem Körper der Techniken, die in der Massenproduktion dieser Organismen für Schädlingsbekämpfungszwecke verwendet werden.

Die In-vivo-Methode verwendet Aufzucht lebenden Insekten als Wirte für die Nematoden-Wachstum und Fortpflanzung. Infektionskammern sind ein effizientes Verfahren zum Aussetzen von Insekten IJs. Dies ist die einzige Phase im Lebenszyklus des Nematoden, die die bakteriellen Symbionten von einem Host zu einem anderen Insektenvektoren. Abbildung 1 zeigt für eine Infektion Kammer sowie der benötigt wird, um diese Kammer bauen die Materialien eingerichtet. In-vitro-Methoden ermöglichen d...

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In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Das Ziel dieser Präsentation ist es, in vivo und in-vitro-Techniken für die Aufzucht von insektenpathogenen Nematoden zu demonstrieren. In-vivo-Verfahren betrachten die Aufzucht dieser Nematoden mit einer Insektenwirts, während die in-vitro-Methoden zu nutzen reichen Agar-Medien.

In-vivo-und In-vitro-Aufzucht von Nematoden (Steinernematidae und Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

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In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.5K Aufrufe.  University of Arizona.  Das Ziel dieser Präsentation ist es, in vivo und in-vitro-Techniken für die Aufzucht von insektenpathogenen Nematoden zu demonstrieren. In-vivo-Verfahren betrachten die Aufzucht dieser Nematoden mit einer Insektenwirts, während die in-vitro-Methoden zu nutzen reichen Agar-Medien. 

Serie: In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

Bodenproben und Isolierung von Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Forschung

Umwelt

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genetik

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

High-und Low Throughput-Screens mit Wurzelknoten-Nematoden Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Immunologie und Infektion

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

Schnelle Isolierung wilder Nematoden durch Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Biologie

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung der Kiefernfadenwurminfektion bei Pinus pinaster

Infection of In Vivo and In Vitro Pines with the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus and Isolation of Induced Volatiles

The pinewood nematode (PWN) is a phytoparasite that causes pine wilt disease (PWD) in conifer species. This plant parasitic nematode has heavily contributed to pine deforestation in Asian countries, e.g., Japan, China, and Korea. Over the last two decades, in Europe, Portugal and Spain have been greatly affected. Research on the mechanisms of PWN infection and/or PWD progression in susceptible host species relies on the controlled infection of pine seedlings under greenhouse conditions. This technique is laborious and mobilizes substantial economic and human resources. Additionally, it can be prone to variability that results from the genetic diversity associated with some pine species but also from the interference of external factors. As an alternative, in vitro co-cultures of pine with PWNs offer a more advantageous system for studying biochemical changes since they a) allow controlling single environmental or nutritional variables, b) occupy less space, c) require less time to obtain, and d) are&#160;free from contamination or from host genetic variation. The following protocol details the standard in vivo PWN infection of Pinus pinaster, the maritime pine, and the establishment of the novel in vitro co-cultures of pine shoots with the PWN as an improved methodology to study this phytoparasite influence on pine volatiles. PWN-induced volatiles are extracted from in vivo and in vitro infected pines by hydrodistillation and distillation-extraction, and the emitted volatiles are captured by solid phase microextraction (SPME), using fiber or packed column techniques.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: In vitro Co-Kultursystem aus Kiefernsprossen und Kiefernwaldnematoden zur Untersuchung der flüchtigen Reaktion des Wirts

The protocol describes the in vivo and in vitro pinewood nematode infection of Pinus pinaster and their volatilome analysis through Gas Chromatography (GC) and GC coupled to Mass Spectrometry (GC-MS).

Infektion von In vivo und In Vitro Kiefern mit dem Kiefernfadenwurm Bursaphelenchus xylophilus und Isolierung von induzierten flüchtigen Bestandteilen