저자는 주식 랩의 과거 회원을 감사드립니다 : 명나라 민 리, 캐서린 Plichta, 빅토리아 미란다 - 톰슨과 샘 규 김이 프로토콜의 많은 개선에 대한 그들의 공헌. 이 작품은 SP 주식에 대한 국립 과학 재단 보조금 IOS-0840932 및 IOS-0724978에 의해 부분적으로 투자되었다

자신의 Symboitic 박테리아와 곤충 병원성 선충의 1 생체 양육 <ol><li> 100 × 15mm 플라스틱 페트리 접시 전환과 접시의 뚜껑에 종이 필터 (90mm)의 두 디스크를 넣습니다. </li><li> 균등 여과지에 (1,000-2,000 IJ / ㎖의 농도에서) IJ (감염성 유하) 현탁액 1 ㎖를 분산. 참고 : IJS 표면 살균 할 필요가 없습니다. </li><li> 접시에 큰 waxmoth의 갤러리아 mellonella의 10 마지막 령 유충을 추가합니다. 목표는 약 100-200 IJS / 유충을 제공하는 것이다. </li><li> 페트리 접시 (그림 1)의 바닥과 뚜껑을 덮고 페트리 접시 레이블을 지정합니다. 다음의 내용을 언급 : 선충 종 명 (알려진 경우); 코드 / 지정을 분리; 날짜 감염 트랩이 설치되었다. </li><li> 느슨하게 밀봉 된 비닐 백에 접시를 놓고 (수분을 보존하기 위해) 및 하나 실온 또는 20 ~ 25 ° C 사이의 배양기에서 어둠에 보관. 매일 요리를 확인 참고 :이 토양에 자연 감염 상태를 모방으로 어둠이 선충의 감염을 용이하게한다. </li><li> 3~5일 후, ​​수정 된 화이트 트랩 7 선충 감염의 징후와 함께 시체를 제거합니다. 참고 : 시체가 부패하는 냄새가있는 경우,이 배양에 성공하지 않은 및 / 또는 오염이 있다는 것을 표시 할 수있다. 선충과 곤충의 새로운 배치와 새로운 감염 챔버를 설정합니다. </li></ol> 자신의 공생 박테리아와 곤충 병원성 선충의 2 체외 양육 <ol><li> 간 - 신장 한천 방법 9,19 <ol><li> 작은 조각 (2cm 세 이하)로 간과 신장을 잘라 및 염화나트륨, 한천과 함께 믹서에 넣고 물 300 ㎖의 고기가 액체 펄프, 두꺼운 붙여 넣기 또는 퓨레가 될 때까지 혼합. 그런 다음, 1 L 삼각 플라스크에 혼합물을 전송합니다. </li><li> 블렌더 용기에 물을 최종 200 mL를 넣고에 남은 용지를 가만히 따르다삼각 플라스크. 121 ℃에서 15 분간 고압 증기 멸균한다. 수 고압 증기 멸균 후 한천 쏟아져 전에 터치 식입니다. 참고 :이 매체는 고기 덩어리를 가지고 경향이 있기 때문에 매체의 피펫은 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 손 교반 또는 사이의 삼각 플라스크 소용돌이가 더 균일 한 미디어 쏟아지는 동안 5 (또는 6) cm 페트리 접시에 한천 ~ 20 ㎖에 붓고. 필요할 때까지 한천은 4 ° C에서 고화 및 저장 요리를 할 수 있도록 허용 참고 : 고기는 페트리 접시에 부어있는 큰 덩어리를 깨고 불꽃 살균 금속 주걱을 사용합니다. </li></ol></li><li> 지질 한천 방법 9,19 <ol><li> 영양 배지, 한천 및 효모 추출물을 함께 혼합하여 지질 한천 배지를 준비하고 2 L 삼각 플라스크에 섞어 붓는다. 121 ° C에서 15 분 동안 H 2 O 및 MgCl2를 • 6H 2 O와 오토 클레이브를 증류 추가. </li><li> 옥수수 기름, 옥수수 시럽 믹스의 무균 혼합을 추가하고 균일하게 기름 방울을 분산하는 것이 저어 또는 격렬하게 소용돌이합니다. <br/&gt; 참고 : UV 가교제에 필요한 볼륨을 배치하여 옥수수 기름과 시럽을 소독. 오일은 액체에 용해하지만 작은 물방울에 있는지 확인하지 않습니다. </li><li> 5 (또는 6) cm 페트리 접시에 ~ 20 ㎖의 한천을 붓고 필요할 때까지 한천은 4 ° C에서 고화 및 저장 요리를 할 수 있습니다. </li><li> 킬은 지질 한천 플레이트에 공생하는 박테리아를 원하는 및 24 ~ 48 시간 동안 28 ° C에서 번호판을 품어. 참고 : 하룻밤 (12-16 시간) LB의 하위 문화의 100 ~ 200 μl를 확산. </li><li> 일 후, 약 0.4 ml의 표면 살균 선충 현탁액 (계란 또는 감염성 청소년)의 추가와 어둠 속에서 또는 22 ± 3 ° C의 배양기에서 실온에서 번호판을 품어. 참고 :이 선충의 성장에 불리한 지나치게 습윤 환경을 만들 수 선충 현탁액의 이상 0.4 ML을 추가하지 마십시오. </li><li> 매일 문화를 모니터링합니다. 문화는 약 십이일 (그림 2)에 IJS의 새로운 세대를 생성해야한다.</li><li> 선충이 수정 된 화이트 트랩 접시 (그림 3A)의 측면을 크롤링 볼 때 한천로 아래 접시를 전송 IJS (그림 3B)를 수확 (로스코 외. 12 참조). 매체의 오염을 감소시키기 위해 층류 후드 하에서이 단계를 수행한다. </li><li> 등장에 수정 된 화이트 트랩에서 IJS를 수집하고 모든 매체 파편을 제거하기 위해 IJ 현탁액을 헹군다. 저장소 (차가운 온도 인큐베이터 또는 차가운 방에) 10 ° C에서 멸균 증류수 IJ 또는 필요한 경우 즉시 사용합니다. 참고 :이 연구의 목적에 따라 하나 공생 - 식민지 또는 aposymbiotic 선충으로 판을 시드. </li></ol></li></ol> 3 시험관 Aposymbiotic의 양육 (공생 무료) 곤충 병원성 선충 <ol><li> 10 ~ 20에게 G.를 감염 원하는 선충 종의 IJS와 mellonella 유충 (섹션 1 참조). 3 ~ 4 일 후 (이 때 IJS은 성숙한다1 세대 성인) 시체를 수집합니다. 참고 : 성숙과 종에 따라 다릅니다 계란의 적절한 수를 얻기 위해 필요한 여성의 수와 시간. 더 G.를 감염 mellonella 필요한 경우 애벌레 빠르면가 오른쪽 발달 단계에 있는지 여부를 평가하기 위해 48 시간 게시물 감염 등의 해부를 시작합니다. </li><li> 생리 식염수 (M9 버퍼 18)와 페트리 접시에 각각 개별적으로 시체를 놓습니다. 좋은 팁 집게로 머리를 잡아 당겨 시신을 해부하다. </li><li> (바람직하게는 L 자형) 미세 바늘로 여성 (내부 계란) 적어도 20은 임신을 수집하고 M9 버퍼 (그림 4A) 10 ㎖를 포함하는 시계 유리에 배치합니다. </li><li> 하기 성분을 고려하여 axenizing 용액을 준비 : 증류수 6.75 ㎖, 1.25 ㎖의 5 N NaOH를, 및 2.25 ml의 시판 표백제 용액을 3 % 차아 염소산로 희석. 참고 : 수산화 나트륨은 솔루션 장갑, 고글 기본 및 보호 적절한 다른입니다옷을 착용해야합니다. 참고 : 표백제 빛으로 감소함에 따라, 신선한 axenizing 솔루션마다를 준비합니다. axenizing 솔루션의 여러 배치를 준비하고 여러 시계 안경 계란의 표면 살균 및 수확을 수행합니다. </li><li> M9 버퍼가 완충 용액으로 시계 유리를 작성하고 피펫 버퍼를 빨아과 여성에게 적어도 세 번 씻어. 여성이 시계 유리에 남아 있는지 확인합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. </li><li> 즉시 axenizing 솔루션을 추가하고, 여성은 10 ~ 15 분 이상 더 이상이 솔루션에 남아 할 수 있습니다. (axenizing 솔루션에 저항) 계란은 그대로 유지하면서 붕괴하기 시작 선충 조직을 관찰한다. </li><li> 수동 니들 또는 메스 (도 4B, C)로 절단함으로써, 처리 속도를 높이기 위해 여성의 신체를 방해. , 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 피펫 팅 분해되지 않은 조직을 추가 피함으로써 알을 제거합니다. 참고 : m로 사용모든 마이크로 원심 튜브는 필요에 알을 수집하고 난의 생존력이 axenizing 용액에 노출 장기간에 걸쳐 감소하는 바와 같이, 빨리 작동한다. </li><li> &quot;고속 설정&quot;을 사용하여 15 초 동안 소용돌이 튜브는 또한 계란에 부착 된 선충 조직을 제거합니다. 소용돌이를 사용할 수없는 경우 또는 최대 피펫 용액을 여러 번 다운. </li><li> 약 18,000g 2 분 동안 원심 분리하여 펠렛 계란입니다. 계란이 충분히 펠렛을하지 않으면 속도를 높입니다. axenizing 솔루션을 제거하고 1 분 동안 900 XG에 멸균 증류수와 원심 분리기를 한 번 더 microcentrifuge 관을 작성하여 두 번 헹군다. </li><li> 마지막 세척 후, 멸균 증류수 300 ~ 500 ㎕의 계란을 재현 탁하고 멸균 3cm 페트리 접시 또는 멸균 시계 유리에 배치합니다. 계란은 이제 표면 살균 것을 기억하십시오, 그래서 계란의 청결을 유지하기 위해 멸균 피펫 및 / 또는 pippetter 팁과 물을 사용합니다. </li><li>그들은 (그림 4D) 그대로 확인 해부 현미경 (30-50X 배율)에서 계란을 검사 및 간 - 신장 한천 5cm 플레이트로 전송 (2.1 절 참조) 참고 :이 한천이 과도하게 젖은 것 같은 접시에 계란 서스펜션의 400 개 이상의 μl를 추가하지 마십시오. </li><li> 해당 정보를 라벨 판과 28 ° C에서 어둠 속에서 수직으로 저장합니다. 계란의 부화하는 것은 분명 밤새도록해야한다. 참고 : 물이 접시의 뚜껑에 응축 할 수 있지만 1 ~ 2 일 후 증발됩니다. 이 때, 한천의 수분을 유지하고 그것의 건조를 방지하기 위해 비닐 봉지에 접시를 놓습니다. </li><li> 주기적으로 요리를 관찰하고 곰팡이 나 세균 오염의 흔적이 어떤 요리를 폐기합니다. IJS가 페트리 접시의 벽을 볼 이주되면, 뚜껑을 제거하여 흰색 변경됨 트랩 (12)과 하부 한천 접시 옮긴다. 로 변형 된 접시를 전송할 때 멸균 조건을 고려D 화이트 트랩 노출 매체의 오염을 방지한다. </li><li> 필요에 따라 화이트 트랩 및 수확 IJ 모니터링을 계속합니다. 참고 : Aposymbiotic 선충 많은 일, 심지어 주 동안 화이트 트랩의 물에 이주 할 것입니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

적합한 호스트를 사용하여 EPN의 생체 양육의 성공을위한 핵심 요소이다. 일반적으로, 모두 steinernematids 및 heterorhabditids는 재현 할 수 성공적으로 더 큰 왁스 나방, 갤러리아 mellonella (나비목 : Pyralidae)의 유충에 자신의 라이프 사이클을 완료합니다. 그러나, 다른 가족 및 / 또는 명령에서 다른 종의 곤충이 고려 될 수있다. 현재 설명 선충 종의 몇몇은 특정 곤충 호스트에 대해 특이성을...

곤충 병원성 선충 (EPN) Steinernema와 Heterorhabditis 종. (Steinernematidae, Heterorhabditidae)과 세균의 공생, Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종 (장내 세균)이 육상 동물 - 미생물의 공생 관계 2-4,6,10,19. Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종의 응급 모델로 간주됩니다. 또한 감염 청소년 (IJ) 또는 제 3 단계 청소년 8,10,13 감염성로 알려져있는 선충의 유일한 자유 생활 단계의 장내 공생로 숨겨있다. 박테리아 - 선충 쌍 곤충의 광범위한 병원성이고 성공적 생물학적 해충 제어 및 통합 관리 프로그램 6,8 전세계에서 구현되었다. 여기에서 우리는 생체 내에서 자주 실험실 조건에서 EPN의 양육을 위해 행사 될 체외 기술에의 선택을 보여줍니다. 나는N 생체 방법은 선충의 양육에 대한 곤충 호스트를 찬찬히. 일반적으로, 다양한 곤충 주문 (즉 나비목, 딱정벌레 목, 파리목, 등.)의 미성숙 단계에 적합한 호스트로 간주됩니다. 방법은 일반적으로 실험실에서 선충 문화의 유지 보수를 위해 간주됩니다 생체 내. 선충의 대량 생산을 고려할 때이 방법은 적합하지 않을 수 있습니다. 곤충 호스트의 많은 양이 더 많은 시간과 곤충 사육에 관련된 추가 비용을 요구하고이 목적을 위해 요구 될 수있다. 곤충 병원성 선충은 여러 매체에 체외에서 배양 할 수있다. 연구의 목표에 따라 시험 관내 방법에하는 것은 미디어의 공생 박테리아의 통합을 고려하거나. 이 프레젠테이션에서는 EPN의 전파 널리 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다. 미디어 성분 공생 박테리아 용 영양소 원을 제공차 선충에 대한 스테롤 소스. 체외 방법은 곤충 호스트없이 장점에게 EPN의 양육을 제공합니다. 적합한 곤충 호스트가 이용할 수없는 경우에 원래 개발 된 체외 미디어의 많은 EPN의 승산을 위해 사용되었다. 그러나 지난 몇 년 동안, 시험관 양육 방법이 널리 EPN과 공생 세균 (17, 19) 사이의 의존형 관계를 이해하는 것을 목표로 연구에 이용되고있다. 이 프레젠테이션에 자세히 기술은 증권 연구소, 애리조나 (투싼, AZ, USA)의 대학에서 다양한 저자에 의해 기술 및 정제에게 해당합니다. 이러한 기술은 해충 관리 목적을 위해 이들 유기체의 대량 생산에 사용되는 기술의 본체로부터 구별한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1827">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:485px;">Material&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Company</td>
			<td style="width:488px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:485px;">For in vivo Infections</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:488px;">25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:485px;">Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose</td>
			<td style="width:260px;">Whatman/VWR</td>
			<td style="width:488px;">28450-081</td>
			<td style="width:595px;">Grade 1 filter paper recommended</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:485px;">Insect hosts</td>
			<td style="width:260px;">Timberline</td>
			<td style="width:488px;">http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td>
			<td style="width:595px;">Galleria mellonella are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:485px;">For Liver-Kidney Agar (for 500 ml)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:485px;">60 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Beef Liver, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:485px;">Beef Kidney, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration )</td>
			<td style="width:260px;">Acros/VWR</td>
			<td>200002-434</td>
			<td style="width:595px;">any research grade NaCl can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">500 ml distilled H20&#160;</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">For Lipid Agar (for 1 L)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Nutrient Broth, 8 g</td>
			<td style="width:260px;">BD/VWR</td>
			<td>90002-660</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Yeast Extract, 5g</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM1.03753.0500</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Magnesium Chloride Hexahydrate,&#160; 10 ml (0.2g/ml)</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM-MX0045-1</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">Corn Oil, 4 ml</td>
			<td style="width:260px;">Any brand</td>
			<td style="width:488px;">Locally source; supermarket</td>
			<td style="width:595px;">Any brand of corn oil can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:485px;">Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity</td>
			<td style="width:260px;">Karo</td>
			<td style="width:488px;">Locally sourced; supermarket</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar, 15 g</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Distilled H20,890 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

Photorhabdus가 heterorhabditids의 공생 동안 곤충 병원성 선충 (EPN) (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)은 장내 세균. Xenorhabdus 박테리아가 steinernematids 선충과 관련된 가족의 그람 음성 감마-Proteobacteria와 의존형 협력 관계를 가지고있다. 함께 선충 및 박테리아는 친밀하고 구체적인 협력 곤충 종의 넓은 범위를 죽이는 강력한 살충 복합체를 형성한다. 여기서, 우리는 생체 내에서 일반적 실험실 조건에서이 선충의 양육에 사용되는 체외 기법을 보여줍니다. 또한,이 기술은 EPN 문화의 성공적인 설립을위한 주요 단계를 대표하고 또한 연구에 대한 이러한 생물을 활용, 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다. aposymbiotic (공생 무료) 선충의 생산은 종종 공생의 연구에 대한 심층와 다각적 인 접근 방법에 대한 중요합니다. 이프로토콜은 항생 물질의 첨가를 필요로하지 않고, 표준 실험실 장비와 짧은 시간에 달성 될 수있다. 저장 영역에서의 생존율이 사용 종에 따라 다를 수 있지만,이 방법으로 제조 선충은 비교적 견고. 이 프레젠테이션에 자세히 기술은 P. 주식의 연구소, 애리조나 대학 (투싼, AZ, USA)에 의해 다양한 저자에 의해 기술과 세련된 사람들에 해당합니다. 이러한 기술은 해충 관리 목적을 위해 이들 유기체의 대량 생산에 사용되는 기술의 본체로부터 구별한다.

생체 양육 방법은 선충의 성장과 재생을위한 호스트로 살아있는 곤충을 사용합니다. 감염 챔버 곤충 IJS를 노출시키는 효율적인 방법이다. 이는 다른 하나의 곤충 호스트로부터 세균 공생을 벡터 선충의 생활주기에서 유일한 단계이다. 1 감염 챔버뿐만 아니라이 챔버를 구축하는 데 필요한 재료 설정 보여준다. 체외 사육 방법이 허용 EPN 곤충 호스트없이 성?...

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In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

이 프레젠테이션의 목표는 생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 양육을위한 체외 기술에 증명하는 것입니다. 체외 방법이 풍부한 한천 미디어를 활용하는 반면, 생체 내 방법, 곤충 호스트와이 선충의 양육을 고려하십시오.

생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 체외 양육 (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.4K 조회수.  University of Arizona.  이 프레젠테이션의 목표는 생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 양육을위한 체외 기술에 증명하는 것입니다. 체외 방법이 풍부한 한천 미디어를 활용하는 반면, 생체 내 방법, 곤충 호스트와이 선충의 양육을 고려하십시오. 

비디오: In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

연구

환경과학

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

유전학

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

면역학 및 감염병학

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

생물학

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

<meta charset="utf8"></head><body>Pinus pinaster 의 Pinewood 선충 감염 최적화

Infection of In Vivo and In Vitro Pines with the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus and Isolation of Induced Volatiles

The pinewood nematode (PWN) is a phytoparasite that causes pine wilt disease (PWD) in conifer species. This plant parasitic nematode has heavily contributed to pine deforestation in Asian countries, e.g., Japan, China, and Korea. Over the last two decades, in Europe, Portugal and Spain have been greatly affected. Research on the mechanisms of PWN infection and/or PWD progression in susceptible host species relies on the controlled infection of pine seedlings under greenhouse conditions. This technique is laborious and mobilizes substantial economic and human resources. Additionally, it can be prone to variability that results from the genetic diversity associated with some pine species but also from the interference of external factors. As an alternative, in vitro co-cultures of pine with PWNs offer a more advantageous system for studying biochemical changes since they a) allow controlling single environmental or nutritional variables, b) occupy less space, c) require less time to obtain, and d) are&#160;free from contamination or from host genetic variation. The following protocol details the standard in vivo PWN infection of Pinus pinaster, the maritime pine, and the establishment of the novel in vitro co-cultures of pine shoots with the PWN as an improved methodology to study this phytoparasite influence on pine volatiles. PWN-induced volatiles are extracted from in vivo and in vitro infected pines by hydrodistillation and distillation-extraction, and the emitted volatiles are captured by solid phase microextraction (SPME), using fiber or packed column techniques.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 숙주 휘발성 반응을 연구하기 위한 소나무 새싹과 소나무 선충의 시험관 내 공동 배양 시스템

The protocol describes the in vivo and in vitro pinewood nematode infection of Pinus pinaster and their volatilome analysis through Gas Chromatography (GC) and GC coupled to Mass Spectrometry (GC-MS).

생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 체외 양육 (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus 에 의한 In Vivo 및 In Vitro Pines 감염 및 유도 휘발성 물질의 분리

생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 체외 양육 (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)

요약

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토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus 에 의한 In Vivo 및 In Vitro Pines 감염 및 유도 휘발성 물질의 분리

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steinernematidae, Heterorhabditidae)