Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do Banco de laboratório: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson e Sam-Kyu Kim por suas contribuições para a melhoria de muitos destes protocolos. Este trabalho foi financiado em parte pela concessão da National Science Foundation IOS-0840932 e 0724978 para IOS-SP da

1. vivo criação de Nematóides entomopatogênicos com suas bactérias Symboitic <ol><li> Inverta a 100 x 15 mm de plástico placa de Petri e colocar dois discos de papel de filtro (90 mm) na tampa da cápsula. </li><li> Distribuir uniformemente 1 ml da suspensão de água IJ (juvenis infectantes) (a uma concentração de 1000-2000 IJ / ml) no papel de filtro. NOTA: IJs não precisa ser esterilizada por superfície. </li><li> Adicionar 10 último larvas do maior mellonella waxmoth Galleria para o prato. O objetivo é fornecer cerca de 100-200 IJs / larva. </li><li> Cobrir a tampa com a parte inferior da placa de Petri (Figura 1) e a placa de Petri rotular. Mencione as seguintes informações: nome da espécie de nematóides (se conhecida); isolar código / designação; armadilha infecção data foi definida. </li><li> Coloque o prato dentro de um saco plástico selado livremente (para conservar a umidade) e mantê-lo no escuro a qualquer temperatura ambiente ou em estufa entre 20-25 ° C. Confira pratos diariamente NOTA: Darkness facilita a infecção por nematóides, uma vez que imita condições de infecção natural no solo. </li><li> Depois de 3-5 dias, remover cadáveres com sinais de infecção de nematóides para uma armadilha Branco modificado 7. Nota: Se o cheiro pútrido cadáveres, isso pode ser uma indicação de que a cultura não foi bem sucedida e / ou houve contaminação. Definir uma nova câmara de infecção com um novo lote de nematóides e insetos. </li></ol> 2 In vitro criação de Nematóides entomopatogênicos com suas bactérias simbióticas <ol><li> Fígado e rim Agar Método 9,19 <ol><li> Pique fígado e rim em pedaços pequenos (2 cm de 3 ou menor) e colocar dentro de uma misturadora com NaCl, ágar e 300 ml de água e misturar até que a carne torna-se uma polpa de líquido, pasta grossa ou puré. Em seguida, transferir mistura para um balão de Erlenmeyer de 1 L. </li><li> Adicionar os últimos 200 mL de água para o recipiente misturador e decanta-se quaisquer meios de comunicação para a restanteErlenmeyer. Autoclave durante 15 minutos a 121 ° C. Após autoclavagem permitir agar para esfriar a tocar antes de derramar. NOTA: Pipetting do meio não é recomendado porque este meio tende a ter pedaços de carne. </li><li> Despeje ~ 20 ml de agar para 5 (ou 6) cm placas de Petri, enquanto agitação mão ou agitando o Erlenmeyer entre derrama para uma mídia mais homogênea. Permitir agar para solidificar e armazenar pratos a 4 ° C até ser necessário NOTA: Use uma espátula de metal esterilizado-chama para quebrar qualquer grandes pedaços de carne derramado na placa de Petri. </li></ol></li><li> Lipid Agar Método 9,19 <ol><li> Prepare ágar lipídico pela mistura de caldo nutriente, ágar e extrato de levedura e despeje a mistura em um frasco de 2 L Erlenmeyer. Adicionar H2O destilada e MgCl2 • 6H 2 O e em autoclave durante 15 minutos a 121 ° C. </li><li> Adicione a mistura estéril de óleo e mistura de xarope de milho de milho e mexa ou agite vigorosamente e, muitas vezes para dispersar as gotículas de óleo uniformemente. <br/&gt; NOTA: Esterilizar o óleo de milho e xarope de colocar o volume necessário em um reticulador de UV. O óleo não se dissolver no líquido, mas certifique-se que está em gotículas. </li><li> Despeje ~ 20 ml de ágar sobre a 5 (ou 6) cm placas de Petri e permitir agar solidificar e armazenar em pratos 4 ° C até ser necessário. </li><li> Raia a bactérias simbióticas desejado na placa de agar de lípidos e incubar as placas a 28 ° C durante 24-48 horas. NOTA: Espalhe 100-200 mL de noite (12-16 horas) LB subcultura. </li><li> No dia seguinte, adicionar cerca de 0,4 ml de suspensão de nemátodos esterilizados à superfície (ovos ou juvenis infectantes) e incuba-se as placas à temperatura ambiente, no escuro ou dentro de uma incubadora a 22 ± 3 ° C. NOTA: Não adicionar mais de 0,4 ml de suspensão de nematóides, uma vez que pode criar um ambiente excessivamente úmido que é desfavorável ao crescimento de nematóides. </li><li> Monitorar culturas diária. As culturas deverão produzir uma nova geração de IJ &#39;s em cerca de 12 dias (Figura 2).</li><li> Transferir prato inferior com ágar quando nemátodos são vistos rastejando os lados do prato (Figura 3A) para uma armadilha branco modificado (ver Orozco et al. 12) para colher IJ &#39;s (Figura 3B). Execute esta etapa sob uma capela de fluxo laminar para reduzir a contaminação da mídia. </li><li> Colete IJs da armadilha Branco modificado a emergência e enxaguar IJ suspensão para remover qualquer resíduo médio. Loja IJ em água destilada esterilizada, a 10 ° C (numa incubadora a temperatura fria ou ambiente frio) ou utilizar de imediato, se necessário. NOTA: Dependendo do objetivo do estudo, semear as placas com tanto nematóides colonizado-simbiontes ou aposymbiotic. </li></ol></li></ol> 3 In vitro criação de Aposymbiotic (Symbiont-free) entomopatogênicos Nematóides <ol><li> Infect 10-20 G. larvas mellonella com IJs das espécies de nematóides desejados (ver secção 1). Após 3 ou 4 dias (neste momento IJ &#39;s deveriam ter amadurecidopara adultos de primeira geração) recolher cadáveres. NOTA: O tempo até o vencimento e número de fêmeas necessários para obter um número suficiente de ovos varia de acordo com as espécies. Infectar mais G. mellonella larvas se necessário e começar a dissecções, logo no 48 horas após a infecção para avaliar se eles estão em fase de desenvolvimento direita. </li><li> Colocar cada cadáver individualmente em uma caixa de Petri com solução salina (tampão M9 18). Dissecar um cadáver, puxando sua cabeça com uma pinça fina ponta. </li><li> Coletar pelo menos 20 grávidas (com ovos dentro) do sexo feminino, com uma agulha fina (em forma de L, de preferência) e coloque-os em um vidro de relógio contendo 10 ml de tampão M9 (Figura 4A). </li><li> Prepara-se uma solução axenizing, considerando os seguintes ingredientes: 6,75 ml de água destilada, 1,25 ml de NaOH 5 N, e 2,25 ml de solução alcalina disponível comercialmente diluída até 3% de hipoclorito. NOTA: NaOH é uma base de soluções de luvas, óculos e outros adequados de proteçãoroupa deve ser usado. NOTA: Preparar a solução axenizing fresco de cada vez, como água sanitária degrada à luz. Prepare vários lotes de solução axenizing e realizar a esterilização superficial e colheita de ovos em vários vidros de relógio. </li><li> Lavar as fêmeas, pelo menos três vezes com tampão M9 enchimento relógio de vidro com solução tampão e sugando tampão com uma pipeta. Certifique-se que as fêmeas permanecem no vidro de relógio. Repita este passo mais duas vezes. </li><li> Adicionar imediatamente a solução axenizing e permitir que as fêmeas que permanecem nesta solução por não mais de 10-15 minutos. Observar os tecidos de nematóides que começam a desintegrar-se, enquanto os ovos (que são resistentes à solução axenizing) permanecem intactas. </li><li> Interromper manualmente órgãos femininos para acelerar o processo, cortando-as com uma agulha ou um escalpelo (Figura 4B, C). Retire os ovos pipetando-los em 1,5 ml microtubos, evitando a adição de qualquer tecido não dissolvido. NOTA: Use como mquaisquer microtubos como necessário para recolher ovos e trabalhar rapidamente, como na viabilidade dos ovos irá diminuir ao longo de um período prolongado de exposição à solução axenizing. </li><li> Tubos de vórtice por 15 segundos usando o &quot;ajuste de alta velocidade&quot; para remover tecidos mais nematóides anexados aos ovos. Alternativamente, se um vórtice não estiver disponível, pipete subir e descer as soluções várias vezes. </li><li> Ovos de pelotas por centrifugação a cerca de 18.000 g durante 2 min. Aumente a velocidade se os ovos não são suficientes para pellet. Retirar solução axenizing e lavar duas vezes através do enchimento do tubo de microcentrífuga com água destilada estéril e centrifugar mais uma vez a 900 xg durante 1 min. </li><li> Após a última lavagem, ressuspender ovos em 300-500 mL de água destilada estéril e colocá-los em um estéril 3 centímetros de Petri ou esterilizados vidro de relógio. Lembre-se que os ovos já estão esterilizados-superfície, por isso use pipetas estéreis e / ou dicas pippetter e água para manter a limpeza dos ovos. </li><li>Examine os ovos sob um microscópio de dissecação (ampliação 30-50X) para confirmar se eles estão intactos (Figura 4D) e transferi-los para uma placa de 5 cm com agar fígado-rim (ver secção 2.1) NOTA: Não adicionar mais de 400 mL da suspensão de ovos nas placas como ele vai fazer o agar excessivamente molhado. </li><li> Placas de etiqueta com informações adequadas e armazená-los em pé no escuro, a 28 ° C. Eclosão dos ovos deve ser durante a noite evidente. NOTA: A água pode se condensar na tampa do prato, mas ele vai evaporar depois de 1 ou 2 dias. Neste momento, colocar a cápsula no saco de plástico para reter a humidade do agar e evitar a sua secagem. </li><li> Observe pratos periodicamente e descartar todos os pratos que apresentam sinais de fungos ou contaminação bacteriana. Depois de IJ &#39;s são vistas migrar para cima da parede da placa de Petri, remover a tampa e transferir o fundo da placa com agar para uma armadilha branco modificado 12. Considere condições estéreis ao transferir o prato na modified Branco armadilha para evitar a contaminação da mídia exposta. </li><li> Continue monitorando as Armadilhas brancas e colheita IJ, conforme necessário. NOTA: nemátodos Aposymbiotic irá continuar a migrar para dentro da água do colector de branco durante muitos dias e mesmo semanas. </li></ol>

<ol>
	<li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.,+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes,+Neoaplectana+and+Heterorhabditis.">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li><li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis.">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li><li>Boemare, N., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology,+taxonomy+and+systematics+of+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> Entomopathogenic Nematology. , (2002).</li><li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genera+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> The Prokaryotes. , 473-488 (2002).</li><li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+(Diptera)+and+Galleria+mellonella+(Lepidoptera).">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li><li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).</li><li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes.">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li><li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li><li>Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+insect+nematology.">Techniques in insect nematology.</a> Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).</li><li>Koppenh&#246;fer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Symbionts+of+Steinernema+and+Heterorhabditis.">Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis.</a> Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).</li><li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp.">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li><li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae,+Heterorhabditidae).">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+(Steinernematidae:+Nematoda).">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li><li>Poinar, G. O., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+(Achromobacteriaceae:+Eubacteriales)+associated+with+a+nematode.">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li><li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pag&#232;s, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Breh&#233;li, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila,+its+nematode+vector,+and+insect+hosts.">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li><li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pag&#232;s, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+(Steinernema)+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+(Xenorhabdus).">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li><li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host,+Steinernema+carpocapsae.">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li><li>Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+parasites,+pathogens+and+associated+of+insects+and+invertebrates+of+economic+importance.">Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando um hospedeiro adequado é um fator chave para o sucesso na criação vivo da EPN. Normalmente, ambos os steinernematids e heterorhabditids podem se reproduzir e concluir com êxito o ciclo de vida das larvas da traça da cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). No entanto, outras espécies de insetos de diferentes famílias e / ou encomendas podem ser considerados. Algumas das espécies nematóides actualmente descritos são conhecidos por ter especificidade para um hospedeir...

Nematóides entomopatogênicos (EPN) Steinernema e Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) e suas bactérias simbiontes, Xenorhabdus e Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) são considerados um modelo emergente de animal terrestre-micróbio relações simbióticas 2-4,6,10,19. Xenorhabdus e Photorhabdus spp. são abrigados como simbiontes no intestino da única etapa de vida livre dos nematóides, também conhecido como o juvenil infecciosa (IJ) ou 3a etapa infecciosa juvenil 8,10,13. O par bactéria nematóide é patogênico para uma ampla gama de insetos e tem sido implementado com sucesso no controle biológico e manejo integrado de pragas em todo o mundo 6,8. Aqui vamos mostrar uma seleção de in vivo e in vitro técnicas que são frequentemente exercidos com a criação de EPN em condições de laboratório. Eun métodos in vivo contemplar um inseto hospedeiro para a criação dos nematóides. Normalmente, estágios imaturos de várias ordens de insetos (ou seja, Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) São considerados hospedeiros apropriados. Métodos in vivo são geralmente considerados para a manutenção de culturas de nematóides no laboratório. Este método pode não ser apropriado quando se considera a produção em massa dos nematóides. Grandes quantidades de insetos hospedeiros podem ser necessários para este fim exigindo mais tempo e os custos adicionais relacionados com o inseto criação. Nematóides podem também ser cultivadas in vitro em vários meios de comunicação. Dependendo do objetivo do estudo, métodos in vitro podem ou considerar a incorporação das bactérias simbióticas na mídia. Nesta apresentação, descrevemos dois métodos comumente utilizados para a propagação de EPN. Os componentes dos meios fornecer uma fonte de nutrientes para a bactéria simbiótica umnd uma fonte de esteróis para os nematóides. métodos in vitro oferecem a vantagem da criação de EPN sem um inseto hospedeiro. Originalmente, muitos dos meios de comunicação in vitro desenvolvido foram utilizados para a multiplicação de EPN quando insetos hospedeiros adequados não estão disponíveis. No entanto, ao longo dos últimos anos, in vitro métodos de criação tornaram-se amplamente utilizados em pesquisas com o objetivo de entender a relação de mutualismo entre EPN e suas bactérias simbióticas 17,19. As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinados pelo Banco Laboratory, da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">For &lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; Infections</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>Grade 1 filter paper recommended</td></tr><tr><td>Insect hosts</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>&lt;em&gt;Galleria mellonella&lt;/em&gt; are recommended</td></tr><tr><td colspan="4">For Liver-kidney Agar (for 500 ml)</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Beef liver, 50 g</td><td>Locally sourced; butcher or supermarket</td><td></td><td>Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td></tr><tr><td>Beef kidney, 50 g</td><td>Locally sourced; butcher or supermarket</td><td></td><td>Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td></tr><tr><td>Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>any research grade NaCl can be used</td></tr><tr><td>Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>any media grade agar can be used</td></tr><tr><td>500 ml distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">For Lipid Agar (for 1 L)</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient broth, 8 g</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract, 5 g</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>Corn oil, 4 ml</td><td>Any brand</td><td>Locally source; supermarket</td><td>Any brand of corn oil can be used</td></tr><tr><td>Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and swirl for homogeneity</td><td>Karo</td><td>Locally sourced; supermarket</td><td></td></tr><tr><td>Agar, 15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>any media grade agar can be used</td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

Nematóides entomopatogênicos (EPN) (Steinernematidae e Heterorhabditidae) têm uma parceria de mutualismo com Gram-negativo proteobactérias gama da família Enterobacteriaceae bactérias. Xenorhabdus estão associados com steinernematids nematóides enquanto Photorhabdus são simbiontes de heterorhabditids. Juntos nemátodos e bactérias formam um complexo insecticida potente que mata uma ampla gama de espécies de insectos numa íntima e específica. Aqui, demonstramos in vivo e in vitro de técnicas vulgarmente utilizadas na criação desses nemátodos em condições de laboratório. Além disso, estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN e também servir de base para outros bioensaios que utilizam esses organismos de investigação. A produção de aposymbiotic nematóides (free-simbiontes) muitas vezes é fundamental para uma profunda e abordagem multifacetada para o estudo da simbiose. Esteprotocolo não requer a adição de antibióticos e pode ser realizada num curto período de tempo com equipamento de laboratório standard. Nemátodos produzidos deste modo são relativamente robusta, embora a sua sobrevivência na armazenagem pode variar dependendo da espécie utilizada. As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinado pelo Laboratório de P. da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.

O método in vivo criação usa insetos vivos como hospedeiros para o crescimento e reprodução do nematóide. Câmaras de infecção são um método eficiente para expor insetos IJs. Esta é a única etapa no ciclo de vida dos nematóides que os vetores de bactérias simbiontes de um inseto hospedeiro para outro. Figura 1 mostra a configuração para uma câmara de infecção, bem como os materiais necessários para construir esta câmara. In vitro métodos de criação permitir EPN ...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae at JoVE.com

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.

In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.4K visualizações.  University of Arizona.  O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar. 

Vídeo: In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Ambiente

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genética

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

Alta e Baixa Screens rendimento com galhas-Nematóides Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Imunologia e Infecção

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Biologia

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

<meta charset="utf8"></head><body>Otimizando a infecção por nematóides de pinheiro em Pinus pinaster

Infection of In Vivo and In Vitro Pines with the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus and Isolation of Induced Volatiles

The pinewood nematode (PWN) is a phytoparasite that causes pine wilt disease (PWD) in conifer species. This plant parasitic nematode has heavily contributed to pine deforestation in Asian countries, e.g., Japan, China, and Korea. Over the last two decades, in Europe, Portugal and Spain have been greatly affected. Research on the mechanisms of PWN infection and/or PWD progression in susceptible host species relies on the controlled infection of pine seedlings under greenhouse conditions. This technique is laborious and mobilizes substantial economic and human resources. Additionally, it can be prone to variability that results from the genetic diversity associated with some pine species but also from the interference of external factors. As an alternative, in vitro co-cultures of pine with PWNs offer a more advantageous system for studying biochemical changes since they a) allow controlling single environmental or nutritional variables, b) occupy less space, c) require less time to obtain, and d) are&#160;free from contamination or from host genetic variation. The following protocol details the standard in vivo PWN infection of Pinus pinaster, the maritime pine, and the establishment of the novel in vitro co-cultures of pine shoots with the PWN as an improved methodology to study this phytoparasite influence on pine volatiles. PWN-induced volatiles are extracted from in vivo and in vitro infected pines by hydrodistillation and distillation-extraction, and the emitted volatiles are captured by solid phase microextraction (SPME), using fiber or packed column techniques.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Sistema de co-cultura in vitro de brotos de pinheiro e nematóide de pinheiro para estudar a resposta volátil do hospedeiro

The protocol describes the in vivo and in vitro pinewood nematode infection of Pinus pinaster and their volatilome analysis through Gas Chromatography (GC) and GC coupled to Mass Spectrometry (GC-MS).

In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo