لذلك تحليل الحمض النووي على نطاق الجينوم الميثيل مع منصة لوس انجليس لاحراف معقد من ميخالة الحمض النووي في الجينوم البشري يمكن أن توفر معلومات هامة من المؤشرات الحيوية اللاجينية في سرطان الجهاز الهضمي. على الرغم من أن هذه المنصة LA لحرف معقد من ميثيل الحمض النووي في الجينوم البشري، فمن الأمثل من حيث التكلفة والتغطية الجينومية. لذا فإن إثبات الإجراء سيكون هيروتاكا موموس، وهو طالب دراسات عليا من مختبري.
للبدء، وإعداد 10 ميكرومتر من الأجزاء المضمنة البارافين غير المطّرقة غير المُثبَّتة. ضع الشرائح في حامل شريحة زجاجية وملأها بالملاط الملحي، مع التأكد من أن جميع الأنسجة على الشريحة مغمورة. اترك الشرائح في الزيلين لمدة 15 دقيقة، ثم صب من الزيلين في حين عقد الشرائح مع طرف ماصة بحيث لا تسقط.
صب في أكثر من الزيلين إلى نفس المستوى كما كان من قبل وكرر الحضانة. صب من الزيلين وملء حامل الشريحة مع الإيثانول 100٪، والتأكد من أن جميع الأنسجة على الشريحة مغمورة بالكامل. اترك الشرائح في الإيثانول لمدة ثلاث دقائق، ثم استبدل الإيثانول بالإيثانول الطازج واسمح لهم بالاحتضان لمدة دقيقتين إضافيتين.
صب قبالة الإيثانول وإزالة الشرائح. ضعها بعناية على منشفة ورقية نظيفة واسمح لها بالجفاف لمدة 10 دقائق. ملء 1.5 ملليلتر أحادية الاستخدام البولي بروبلين أنبوب مع 80 ميكرولتر من العازلة تحلل ووضع تلميح ماصة نظيفة في المخزن المؤقت.
تحديد أنسجة السرطان في منطقة الورم الأكثر ملاءمة ل macrodissection وفقا لH & E المناسبة مقطع الملون، ثم macrodissect أنسجة السرطان على أساس القسم ملحوظ. اتخاذ شفرة الحلاقة نظيفة وكشط بلطف الأنسجة السرطانية الخروج من الشريحة في محاولة لإبقائه في قطعة واحدة. استخدام تلميح ماصة لنقل الأنسجة كشط في تحلل قارورة العازلة.
كرر هذه العملية مع باقي الشرائح. بعد كل الأنسجة في الأنبوب، استخدم الطرف للتأكد من أن الأنسجة مغمورة بالكامل وغير ملتصقة بالحائط. أضف 20 ميكروليتر من بروتياز سيرين ذات الصلة الفرعية إلى القارورة ونفض الغبار بلطف لخلط.
ضع القارورة في كتلة حرارة 55 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها، مع التأكد من دوامة قليلا بعد ساعتين. إجراء علاج بيسلفيت على 45 ميكرولترات من الأنسجة المهضمة باستخدام طقم تحويل ثنائي الفلتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إضافة خمسة ميكرولترات من العازلة التخفيف إلى العينة واحتضانه في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
وفي الوقت نفسه، إعداد كاشف تحويل البيسلفيت بإضافة 750 ميكرولترات من الماء المقطر و 210 ميكرولترات من عازلة التخفيف إلى أنبوب واحد من كاشف التحويل CT. اخلط الأنابيب عن طريق الدوامة لمدة 10 دقائق ، ثم أضف 100 ميكرولترات من كاشف التحويل المقطعي المعد لكل عينة ويخلط بواسطة الانقلاب. احتضان العينات في الظلام في 50 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة.
بعد الحضانة، ضع العينات على الجليد لمدة 10 دقائق. إضافة 400 microliters من العازلة ملزمة وخلط كل عينة عن طريق pipetting صعودا وهبوطا. قم بتحميل كل عينة في عمود دوران ووضع العمود في أنبوب جمع ملليلتر اثنين.
الطرد المركزي العينات في سرعة كاملة لمدة دقيقة واحدة وتجاهل تدفق من خلال. أضف 200 ميكرولترات من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل عمود وتدور بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة، ثم تجاهل التدفق من خلال. إضافة 200 ميكرولترات من العازلة desulphonation إلى كل عمود والسماح للأعمدة للوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
بعد الحضانة، تدور الأعمدة بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة وتجاهل تدفق من خلال. اغسل العمود مرتين مع 200 ميكرولترات من الغسيل العازلة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة بعد كل غسل. إضافة 46 ميكرولترات من الماء المقطر إلى كل عمود ووضعها في أنبوب البولي بروبلين معقم جديد 1.5 ملليلتر.
تدور الأنابيب لمدة دقيقتين ل elute الحمض النووي وتجاهل العمود. الحمض النووي جاهز الآن للتحليل استخدام الحمض النووي المعدل من البيسلفيت كنموذج لل PCR الكمي الخاص بالنموذج لتقييم مثيلة المنطقة المروجة في كل تحليل جيني.
الجمع بين الكواشف كما هو موضح في مخطوطة النص واستخدام 96 جيدا في الوقت الحقيقي PCR الصك لتشغيل بروتوكول الدراجات الحرارية. تظهر خصائص 48 مريضًا مصابًا بسرطان المعدة في مجموعة التدريب هنا. وكان متوسط عمر المرضى 74 سنة وضمت الفوج 38 ذكرا و 10 إناث.
أولا، تم تحميل جميع العينات الـ 48 لتحديد القيم المتطرفة. وأعطت عينتان قمم أكبر من انحرافين معياريين تم إزاحتها عن الآخرين وأزيلت هذه العينات. تم تقسيم خريطة الحرارة الناتجة إلى مجموعتين على أساس المثيلات العالية والمنخفضة.
تسمح هذه الخريطة الحرارية بالتصور من أعلى 50 مسابير في غضون 1،500 أزواج قاعدة من موقع بدء النسخ في التحليل التفاضلي الميثيل. ظهر نوع السرطان ووجود ورم خبيث العقدة الليمفاوية كعوامل تنبؤية مستقلة كبيرة عندما استخدمت العوامل المرضية السريرية كcovariates في التحليل متعدد المتغيرات. وأخيراً، وجد أن جين EPB41L3 مرتبط بقوة بتدوين مجموعة التدريب في مجموعات الميثيل عالية ومنخفضة في تحليل الميكروسا.
تم التحقق من نتائج تحليل الميكروسا لـ EPB41L3 في مجموعة الاختبار باستخدام PCR الكمي الخاص بالميثيل. وكانت مركبات الـ RMVs من EPB41L3 في أنسجة PGC أعلى بكثير من تلك الموجودة في بقايا سرطان المعدة في تحليل المتغيرات الأحادية. وبالمثل، كانت RMVs في العينات مع الانبثاث العقدة الليمفاوية أعلى بكثير من تلك التي لا نقائل العقدة الليمفاوية.
لذلك مطلوب تحديد على الأنسجة السرطانية الأكثر ملاءمة ل macrodissection وفقا لH & E المناسبة مقطع الملون لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح.
