We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.

تم تنفيذ العمل الحيوانات التي أجريت في المركز القومي للحياة البرية الصحة وفقا للمكتب NIH من المبادئ التوجيهية مختبر رعاية الحيوان وتحت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام بروتوكول # EP080716. وكانت الأنسجة من الحيوانات تحصد صياد الهدايا من ولاية ويسكونسن أو ميشيغان أقسام الموارد الطبيعية. 1. إعداد الحل ملاحظة: الحلول المذكورة أدناه مطلوبة لإعداد الركيزة CER الفحص في القسم 2 أدناه. إعداد كل من هذه الحلول من ارتفاع حلول الأسهم تركيز. وستعطى تركيزات المستحسنة للحلول الأسهم في أقواس بعد كل اسم الكيميائية المدرجة ذات الصلة. إعداد جميع حلول جديدة على إعداد الركيزة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحلل العازلة، وإعداد إيجاد حل لليلي في 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5 (1 M تريس، ودرجة الحموضة 7.5 حل الأسهم مستحسن): 100 ملم الصورةكلوريد الكراهية (كلوريد الصوديوم، 1 M حل الأوراق المالية)، و 10 ملم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA، 500 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0 حل الأسهم)، و 0.5٪ NP-40 (10٪ محلول المخزون)، و 0.5٪ deoxycholate (DOC، 10٪ محلول المخزون ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعازلة التحويل، وإعداد محلول كبريتات الصوديوم 0.05٪ دوديسيل (SDS، 10٪ محلول المخزون) و 0.5٪ تريتون X-100 (10٪ محلول المخزون) في 1 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 10، ودرجة الحموضة 7.4 حل الأسهم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن حلول chaotropic، وإعداد اثنين 3 M حلول غوانيدين هيدروكلوريد (GdnHCl، 8 M الأسهم) في برنامج تلفزيوني 1X (حل 10X الأسهم). ضبط درجة الحموضة واحد من الحلول إلى 3.5 ± 0.05 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز (حمض الهيدروكلوريك). تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الثاني يبقى في درجة الحموضة 7.4 ± 0.05 وضبط باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز أو هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) إذا لزم الأمر. </li></ol> 2. إعداد أزواج CER الفحص الركيزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول صحية أنسجة المخ، غير TSE-المصابة من الأنواع ذات الأهمية وإعداد 10٪ حجم الوزن لكل(ث / ت) جناسة في تحلل العازلة باستخدام أي من الطرق التالية: dounce، وحبة طاحونة، أو التجانس الهاون ومدقة. زيادة تحسين الناتجة الخليط بواسطة تعريضهم للتجانس حقنة وإبرة، وذلك باستخدام الإبر زيادة مقياس حتى يمكن يستنشق الركيزة وطرد بكل سهولة من خلال 27 G حقنة إبرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لركائز أعدت من القوارض والثدييات الصغيرة الأخرى، التجانس الدماغ كله (ق)؛ لركائز أعدت من الثدييات الكبيرة، واستخدام OBEX (الدماغ) الأنسجة لتحضير الخليط. عند اختيار كمية جناسة الدماغ، وإعداد ما لا يزيد عن 50٪ من قدرة أجهزة الطرد المركزي المستخدمة لبروتين هطول الأمطار في الخطوة 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت نوعية أنسجة المخ المكتسبة أمر مشكوك فيه، وتقييم مستويات بي ار بي C بواسطة SDS-PAGE 16 و 17 طخة مناعية قبل الركيزة التحضير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم جناسة الدماغ إلى قسمين أحجام متساوية في أنابيب بلاستيكية المخروطية وصفت منفصلة. إضافة GdnHCl (3 M الحلول في 1 PBS) في أي درجة الحموضة 3.5 أو 7.4 إلى كل أنبوب في نسبة 1: حجم 1 إلى جناسة الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من قيم الرقم الهيدروجيني للحلول اثنين. ضبط درجة الحموضة من الحموضة 3.5 الركيزة لدرجة الحموضة ± 0.05 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز. ضمان درجة حموضة الركيزة الأخرى تبقى في درجة الحموضة 7.4 ± 0.05 وضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو حسب الحاجة. تجنب المبالغة قيم درجة الحموضة بإضافة حكيمة من حمض أو قاعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير الحلول على نهاية الإفراط في نهاية خلاط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعجل البروتين من خلال إضافة أربعة مجلدات من الميثانول إلى حلول الركيزة في كل أنبوب مخروطي الشكل، دوامة لخلط جيدا، واحتضان عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الرواسب بواسطة الطرد المركزي عند 13،000 × ز لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. صب بعناية وتجاهل supernatants والسماح الميثانول لتتبخر من الكريات. استخدام أدوات تطبيقها القطن ذات الرؤوس للمساعدة في امتصاص الميثانول تشبث إلى داخل الأنبوب. لا تسمح الكريات إلى الإفراط في الدكتورذ ومرة ​​واحدة الميثانول لم تعد مرئية، انتقل إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات البروتين resuspend في عازلة التحويل. استخدام كمية من تحويل عازلة يساوي المبلغ من جناسة الدماغ المواد انطلاق الاستغناء في كل أنبوب في الخطوة 2.2. ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن المخزن المؤقت التحويل المستخدمة ل resuspend الكريات البروتين من كلا الأس الهيدروجيني 3.5 والاستعدادات الركيزة المعاملة 7.4 هو الحل المعرفة في الخطوة 1.2 أعلاه (والذي يحتوي على مستويات منخفضة من المنظفات ودرجة الحموضة الفسيولوجية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول يصوتن لفترة وجيزة الركيزة في sonicator cuphorn (10 ثانية في ~ 30٪ الطاقة القصوى)، قسامة إلى 0،5-1،0 مل مجلدات في المسمى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إجراء طخة مناعية لمراقبة الجودة (الخطوة 2.9) على قسامة من كل الركيزة. تخزين مأخوذة أخرى في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لإجراء فحص CER (القسم 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مراقبة الجودة على أزواج CER الركيزة قبل استخدامها (الشكل 2). هذه الخطوات تضمن ركائز CER سوف يقوم بتقديمالبريد أفضل النتائج في الدراسات التحويل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان كميات مماثلة من بي ار بي C في ركائز اثنين. مقارنة مستويات بي ار بي في 10-25 ميكرولتر من كل الركيزة التي كتبها SDS-PAGE 16 و 17 immunoblotting. إذا كانت مستويات البروتين في الرقم الهيدروجيني 7.4 و 3.5 ركائز هي داخل ~ 10٪ من بعضها البعض، وأزواج الركيزة مناسبة للاستخدام في الدراسات CER. ملاحظة: يجب على immunoblots PRP لا تظهر أدلة على نطاق واسع تدهور بي ار بي C. يجب أن يكون مناعية بي ار بي أساسا&gt; 20 كيلو دالتون. فرق أقل من هذه الكتلة الجزيئية يمكن أن تكون المنتجات التدهور. وينبغي أن تكون أنماط النطاقات يعادل تقريبا بين أزواج الركيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبما أن بي ار بي C في كل من ركائز يجب أن تكون PK حساسة، علاج 10-25 ميكرولتر من كل الركيزة مع PK في تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل وهضم العينات عند 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الحرارية شاكر. تقييم أي إشارة PRP المتبقية SDS-PAGE 16 و 17 immunoblotting.ركائز مع الدقة PRP ليست مناسبة للاستخدام في الدراسات CER. </li></ol></li></ol> 3. إعداد بذور TSE الوكيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول TSE المصابة أنسجة المخ من الأنواع ذات الأهمية وإعداد 10٪ (ث / ت) جناسة في برنامج تلفزيوني 1X درجة الحموضة 7.4 باستخدام الأساليب المذكورة في الخطوة 2.1 أعلاه. ملاحظة: يمكن أيضا أن تنتج بذور من الأنسجة الأخرى TSE المصابة خارج الجهاز العصبي المركزي، ومع ذلك، كفاءة التحويل من الدماغ المستمدة ركائز عن طريق البذور المستمدة من الأنسجة الطرفية TSE المصابة لم يتم بعد تقييم التجربة في الأدبيات المنشورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة الناتجة جناسة (ق) في 100-300 حجم ميكرولتر في 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لأداء الفحص CER. </li></ol> 4. CER الفحص ملاحظة: فحص CER ينطوي إضافة كمية صغيرة نسبيا من بي ار بي بورصة طوكيو (المنصوص عليها في &quot;البذور&quot;) من نوع واحدإلى وجود فائض النسبي للبي ار بي C (المنصوص عليها في الدماغ غير مصاب &quot;الركيزة&quot;) من الأنواع الأخرى التي تم التشويه والتحريف جزئيا في أي درجة الحموضة 3.5 أو 7.4. وبعد فترة حضانة تمتد الهز، ويتم تقييم يحركها قالب تحويل بي ار بي C التي كتبها بي ار بي بورصة طوكيو في كل رد فعل من جانب إشارة الكثافات من بي ار بي الدقة المتبقية بعد PK الهضم وكشف طخة مناعية. مقارنة مستويات الدقة PRP في ركائز التشويه والتحريف سابقا في درجة الحموضة 3.5 مقابل 7.4 يوفر قدرا من الحواجز القائمة بين الأنواع. وتقدم لمحة عامة التجريبية من هذا الإجراء فحص في الشكل 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد ببطء غير المصابة أزواج CER الركيزة (الفحص يتطلب كميات متساوية من ركائز التشويه والتحريف سابقا في كل من درجة الحموضة 3.5 و 7.4) وحلول البذور TSE-المصابة عن طريق وضعها على رأس سرير من الجليد (حوالي 1 ساعة الوقت ذوبان الجليد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذابة مرة واحدة بشكل كامل، نضح ثم طرد كل حل الركيزة من خلال27 G حقنة إبرة عدة مرات لإعادة التجانس عليه. يصوتن لفترة وجيزة كل حل البذور TSE المصابة لمدة 10 ثانية في ~ 30٪ الطاقة القصوى. إبقاء جميع الحلول على الجليد في حين تستعد ردود الفعل التحويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسمية 5 الفردية منخفضة ملزمة، وأنابيب PCR رقيقة الجدران في كيل بورصة طوكيو التي يجري اختبارها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ردود الفعل التحويل في هذه الأنابيب عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 10٪ محلول البذور TSE-المصابين إلى 95 ميكرولتر من (أ) الركيزة CER أعدت في درجة الحموضة 7.4 و (ب) الركيزة CER أعدت في درجة الحموضة 3.5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة تجريبية، وإعداد ردود فعل موازية في أزواج الركيزة CER التشويه والتحريف سابقا في كل من درجة الحموضة 3.5 و 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين نسب TSE البذور وكيل لغير المصابة الركيزة الدماغ من خلال تقرير التجريبية. البذور مشترك: نسب الركيزة المستخدمة الحفاظ على حجم رد الفعل الكلي 100 ميكرولتر وتشمل 1:99 ميكرولتر، 2:98 5:95 ميكرولتر وميكرولتر. بالنسبة لمعظم التطبيقات، و5:95 ميكرولتر البذور: نسبة حجم الركيزة المناسبة وما قدمت في عشرهو بروتوكول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثلاث عينات السيطرة في كيل بورصة طوكيو التي يجري اختبارها على النحو التالي: (أ) إضافة 5 ميكرولتر من 10٪ محلول البذور TSE-المصابين إلى 95 ميكرولتر عازلة تحويل كعنصر تحكم لمدخلات الدقة الحزب الثورى. إضافة 5 ميكرولتر عازلة التحويل إلى 95 ميكرولتر الركيزة أعد في (ب) الرقم الهيدروجيني 3.5 و (ج) ودرجة الحموضة 7.4 كما ضوابط لغير محددة التحويل، غير قالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة دوامة كل عينة في أنبوب للPCR مغلقة لخلط البذور والركيزة جيدا. اتبع مع نبض لحظة في السرعة المنخفضة مقاعد البدلاء أعلى مصغرة الطرد المركزي لإزالة أي كمية من خليط التفاعل المحاصرين في أنبوب غطاء PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحمل في المسمى بشكل فردي أنابيب PCR إلى مقاعد البدلاء أعلى الحرارية شاكر مجهزة لقبول أنابيب PCR. يهز العينات عند 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد الهز، إضافة sarkosyl إلى تركيز النهائي من 2٪ (ث / ت) وPK إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل. عينات دايجست في 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الحرارية شاكر. NOTE: إضافة sarkosyl لعينات المساعدات بعد التحويل في PK هضم بي ار بي C. يتم استبعاد اشارات ايجابية كاذبة في عينات غير المصنف (الخطوة 4.5) تقريبا بإضافة sarkosyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة SDS-PAGE عينة عازلة، وعينات الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وحل بي ار بي المتبقية الدقة في كل عينة بواسطة SDS-PAGE 16 تليها immunoblotting 17. ملاحظة: بعد إضافة عينة العازلة والتدفئة، وعينات قد تتم معالجة فورا أو يمكن تخزين العينات في -20 ° C أو -80 ° C قبل immunoblotting. تم إنشاء جميع البيانات المقدمة هنا باستخدام أنظمة جل ونقل NOVEX NuPAGE. وعولج عينات فردية من الفحص CER مع العازلة عينة والحد من وكيل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تسخين العينات لاحقا عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتم تحميل 30 ميكرولتر من كل عينة إلى 12٪ مكرر تريس المواد الهلامية الجاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نسبة كفاءة التحويل (CER) كإجراءمن الحواجز القائمة بين الأنواع. مستويات قدر من الدقة PRP بواسطة قياس كثافة 17 و تقسيم الكثافة الإجمالية للعينة الرقم الهيدروجيني 7.4 قبل أن من درجة الحموضة 3.5 العينة. ضرب من قبل 100 لإنتاج مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع البيانات من مكررات التجريبية مستقلة لتوليد وسيلة CER ± الانحراف المعياري لالأنواع مع وكيل TSE معين. </li></ol>

<ol>
	<li>Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).</li><li>Hill, A. F., Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+strains+and+species+barriers.">Prion strains and species barriers.</a> Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).</li><li>Scott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+hamster+prion+protein+produce+species-specific+scrapie+infectivity+and+amyloid+plaques.">Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques.</a> Cell. 59 (5), 847-857 (1989).</li><li>Prusiner, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenetic+Studies+Implicate+Interactions+between+Homologous+Prp+Isoforms+in+Scrapie+Prion+Replication.">Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication.</a> Cell. 63, 673-686 (1990).</li><li>Telling, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+Propagation+in+Mice+Expressing+Human+and+Chimeric+Prp+Transgenes+Implicates+the+Interaction+of+Cellular+Prp+with+Another+Protein.">Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein.</a> Cell. 83, 79-90 (1995).</li><li>Hill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+same+prion+strain+causes+vCJD+and+BSE.">The same prion strain causes vCJD and BSE.</a> Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).</li><li>Torres, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+modulating+the+prion+species+barrier+and+its+passage+consequences.">Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences.</a> PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).</li><li>Groschup, M. H., Buschmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+prion+diseases.">Rodent models for prion diseases.</a> Vet Res. 39 (4), 32 (2008).</li><li>Korth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abbreviated+incubation+times+for+human+prions+in+mice+expressing+a+chimeric+mouse-human+prion+protein+transgene.">Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).</li><li>Kocisko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+specificity+in+the+cell-free+conversion+of+prion+protein+to+protease-resistant+forms:+a+model+for+the+scrapie+species+barrier.">Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).</li><li>Raymond, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+molecular+barrier+limiting+susceptibility+of+humans,+cattle+and+sheep+to+chronic+wasting+disease.">Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.</a> EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).</li><li>Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+the+transmission+barrier.">In vitro studies of the transmission barrier.</a> Prion. 3 (4), 220-223 (2009).</li><li>Zou, W. Q., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+detergents+enhance+in+vitro+conversion+of+human+brain+PrPC+to+a+PrPSc-like+form.">Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form.</a> J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).</li><li>Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+barriers+for+chronic+wasting+disease+by+in+vitro+conversion+of+prion+protein.">Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).</li><li>Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+prion+protein+conversion+suggests+risk+of+bighorn+sheep+(Ovis+canadensis)+to+transmissible+spongiform+encephalopathies.">In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies.</a> BMC Vet Res. 9, 157 (2013).</li><li>Chandler, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalopathy+in+mice+produced+by+inoculation+with+scrapie+brain+material.">Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.</a> Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).</li><li>Browning, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+prions+from+mule+deer+and+elk+with+chronic+wasting+disease+to+transgenic+mice+expressing+cervid+PrP.">Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP.</a> J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).</li><li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+sheep+and+goats+with+transmissible+mink+encephalopathy+virus.">Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus.</a> Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).</li><li>Rubenstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+surveillance+and+antigen+conformation+determines+humoral+immune+response+to+the+prion+protein+immunogen.">Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen.</a> J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).</li><li>Castilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+species+barrier+by+PrP(Sc)+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions.">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134 (5), 757-768 (2008).</li><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).</li><li>Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quaking-induced+conversion:+a+highly+sensitive+assay+for+prion+detection.">Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection.</a> Prion. 5 (3), 150-153 (2011).</li><li>Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaking+Alone+Induces+De+Novo+Conversion+of+Recombinant+Prion+Proteins+to+beta-Sheet+Rich+Oligomers+and+Fibrils.">Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils.</a> PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).</li><li>Mathiason, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease.">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li><li>Seelig, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lesion+Profiling+and+Subcellular+Prion+Localization+of+Cervid+Chronic+Wasting+Disease+in+Domestic+Cats.">Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats.</a> Vet Pathol. , (2014).</li><li>Stewart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predictions+of+prion+disease+susceptibility+in+carnivore+species+based+on+variability+of+the+prion+gene+coding+region.">Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region.</a> PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).</li><li>Russell, W. M., Burch, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , (1959).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

لالانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول، ينبغي إيلاء الاهتمام لمستويات بي ار بي C في غير المصابة أنسجة المخ تستخدم لإعداد الركيزة (الخطوة 2.1.2) والبذور إلى الركيزة نسبة للتفاعلات التحويل (الخطوة 4.4.2). في تجربتنا، والعقول يمكن استخراجها لاستخدامها بوصفها الركيزة CER بعد ...

الاعتلال الإسفنجي للانتقال (TSEs، وأمراض بريون) هي مجموعة من الأمراض العصبية القاتلة مع فترات الحضانة الطويلة التي تؤثر على مجموعة متنوعة من الحيوانات والبشر. وتتألف العامل المسبب للمرض من المفترض TSEs من أيزومر تتجمع من بروتين بريون المضيف (بي ار بي) التي هي قادرة على التكاثر الذاتي التي يحركها قالب تحويل شكل الخلوي الطبيعي للبي ار بي (بي ار بي C) إلى معدية، ويرتبط مرض شكل (بي ار بي TSE) التي تتراكم في أنسجة الجهاز العصبي المركزي للمضيف المصاب 1. البريونات المعدية نقل الثدييات عموما من المضيف إلى المضيف بطريقة أنواع محددة، والتي أدت إلى مفهوم &quot;الحواجز القائمة بين الأنواع بورصة طوكيو&quot; الحد من انتقال الأحداث بين الأنواع 2. ليست مفهومة جيدا المحددات البيولوجية للالحواجز القائمة بين الأنواع بريون. الأحماض الأمينية تشابه تسلسل بين المعدية بي ار بي بورصة طوكيو والمضيف بي ار بي C جوتؤثر بقوة سواء التحويل يأخذ مكان 3-5، ولكن لا يزال غير كاف لتفسير كل الأحداث انتقال بريون لوحظ في الجسم الحي 6،7. وبالتالي، فقد اعتمد توصيف حواجز الأنواع بورصة طوكيو إلى حد كبير على دراسات التحدي الحيوان: تعريض الحيوانات ساذجة من نوع معين لالبريونات من آخر وقياس الناتجة فترة حضانة ظهور المرض ومعدل الهجوم كمؤشرات للكفاءة الإرسال. وتستخدم أيضا الفئران معربا عن بي ار بي C من الأنواع مغاير لهذا النوع من الدراسة 8. التكاليف المرتبطة بإنتاج المعدلة وراثيا الماوس واختبارات بيولوجية بريون التي طال أمدها، فضلا عن الاعتبارات الأخلاقية للاستخدام الحيواني، هي العقبات التي تحول دون تحقيق التجريبي الحواجز الأنواع بورصة طوكيو. تقييم الحواجز القائمة بين الأنواع البشرية لTSEs يعتمد على الفئران المهندسة للتعبير عن الإنسان بي ار بي C. هذه الفئران تتطلب فترات حضانة طويلة الرضوخ لTSEs الإنسان أو تعديلات على رانه البشري جزيء بي ار بي C لبدء المرض السريع 9. فترات حضانة TSEs غير البشرية في هذه الفئران قد تمتد إلى ما بعد عمر الفأر العادي مما يجعل تفسير النتائج السلبية الصعبة. كما استخدمت الرئيسيات غير البشرية كوكلاء لدراسة حواجز الجنس البشري، ولكن هذه الدراسات لا محفوف نفس التحديات التي تواجهها أنواع أخرى من التجارب على الحيوانات والرئيسيات غير البشرية قد لا ألخص بالضبط المرض لأنها تسير في الإنسان المضيف. لا تزال اختبارات بيولوجية الحيوان &quot;المعيار الذهبي&quot; طريقة لقياس قابلية الأنواع إلى بورصة طوكيو، ولكن أجبرت العقبات والتكاليف والأخلاق من هذه الدراسات على الحيوانات الحية التحقيق في البدائل. وهناك عدد من فحوصات في المختبر، استنادا إلى تقييم تحويل المضيفة بي ار بي C إلى بروتين K (PK) دولة مقاوم لل(احتياط PRP) عند المصنف من قبل بي ار بي بورصة طوكيو، وقد وضعت واستخدامها لتحقيق TSE SPecies الحواجز 10-12. أمثلة لفحوصات في المختبر وتشمل فحوصات خالية من الخلايا التحويل، البروتين misfolding التضخيم دوري (PMCA)، ونسبة كفاءة التحويل (CER) فحص 10-14. في حين أن أيا من هذه المقايسات تأخذ في الاعتبار العوامل المحيطية المشتركة في حواجز الأنواع بعد العدوى الطبيعية، وكلها يمكن أن تكون مفيدة لتحديد المضيفين يحتمل أن تكون عرضة للTSEs. هنا نقدم بروتوكول للمقايسة CER، التي تستخدم اثنين من التشويه والتحريف ركائز بي ار بي C المستمدة من الخليط المخ المعتادة في مقاعد البدلاء الأعلى ردود الفعل تحويل بريون (الشكل 1) 13. بي ار بي C في الركيزة التشويه والتحريف في درجة الحموضة 7.4 لا يمكن تحويلها إلى الدقة PRP التي كتبها بي ار بي TSE المصنفة في رد الفعل في حالة عدم وجود الحواجز القائمة بين الأنواع 14. في المقابل، تمسخ من بي ار بي C في الركيزة الأخرى في درجة الحموضة 3.5 يسمح ليتم تحويلها إلى بي ار بي الدقة حضانة التاليةمع بي ار بي TSE من أي نوع من الأنواع وبمثابة الرقابة على التحويل. فإن نسبة التحويل من بي ار بي C إلى الدقة PRP في درجة الحموضة 7.4 الركيزة نسبة إلى أن الركيزة درجة الحموضة 3.5 يوفر قدرا من الحواجز القائمة بين الأنواع. لقد وجدنا أن الفحص CER يتنبأ يعرف الحواجز الأنواع من الفئران المخبرية لمختلف TSEs واستخدمت مقايسة في الجهود الرامية إلى التنبؤ الحواجز القائمة بين الأنواع العديد من أنواع الثدييات، بما في ذلك كبش الجبال الصخرية، إلى مرض الهزال المزمن (CWD) وغيرها من TSEs 14، 15. المحققون ترغب في أداة السماح الفحص السريع للحواجز الأنواع TSE أو تقييم تحويل بي ار بي C -to-بي ار بي احتياط سوف تجد هذه المنهجية مفيدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:287px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">12% Bis-Tris SDS-PAGE gels</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">ZROB05&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Other varieties of beads are also effective</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:296px;">Antibodies</td>
			<td style="width:205px;">various suppliers</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;">Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bead homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">BBY24M</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:157px;">369434</td>
			<td style="width:287px;">High speed with temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:205px;">Uline</td>
			<td style="width:157px;">S-18991</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Cuphorn sonicator</td>
			<td style="width:205px;">Heat Systems-Ultrasonics</td>
			<td style="width:157px;">W-380</td>
			<td style="width:287px;">Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">Densitometry software program</td>
			<td style="width:205px;">UVP</td>
			<td style="width:157px;">Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software</td>
			<td style="width:287px;">Other programs, such as NIH ImageJ, will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:157px;">885300</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">End-over-end mixer</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">H5600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetra acetic acid</td>
			<td style="width:205px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:157px;">P-770</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine hydrochloride, 8M</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">24115</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating block</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">11-718</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">435570</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: strong acid</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0008</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A454-4</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-centrifuge</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">C1301</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">L-5125</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:205px;">Amresco</td>
			<td style="width:157px;">M158</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">SDS-PAGE gel system</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NuPAGE electrophoresis system</td>
			<td style="width:287px;">Other SDS-PAGE systems will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">PCR tubes (low-binding)</td>
			<td style="width:205px;">Axygen</td>
			<td style="width:157px;">PCR-02-L-C</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Pestle homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">03-392-106</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pH meter</td>
			<td style="width:205px;">Sentron</td>
			<td style="width:157px;">SI600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyvinyldifluoride membrane</td>
			<td style="width:205px;">Millipore</td>
			<td style="width:157px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:157px;">V3021</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:296px;">Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0009</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">D6750</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">28364</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">S5881</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemica; strong base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Syringe</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;">Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Syringe needles</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Thermoshaker (PCR tube shaker)</td>
			<td style="width:205px;">Hangzhou All Sheng Instruments</td>
			<td style="width:157px;">MS-100</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Tris base</td>
			<td style="width:205px;">Bio Basic&#160;</td>
			<td style="width:157px;">77-86-1</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:205px;">Integra Chemical Company</td>
			<td style="width:157px;">T756.30.30</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Vortexer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">12-812</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing transmissible spongiform encephalopathy species barriers with an in vitro prion protein conversion assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

الاستخدام الناجح للمقايسة CER يعتمد إلى حد كبير على نوعية من أزواج الركيزة المستخدمة في تفاعلات التحويل. لهذا السبب، والإجراءات لإعداد أزواج الركيزة CER التالية، ينبغي إجراء طخة مناعية لمراقبة الجودة (الشكل 2). لكل من ركائز، فحص 10-25 ميكرولتر من immunoblotting. بي ار بي...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay at JoVE.com

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

تقييم المنقولة جنون الأنواع دماغي الحواجز مع<em&gt; في المختبر</em&gt; بريون تحويل البروتين الفحص

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

assessing-transmissible-spongiform-encephalopathy-species-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

7.7K Views.  USGS National Wildlife Health Center. Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Video: Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

المؤشرات الحيوية في نموذج حيواني لكشف الاقتران العصبية، الدموية، والسلوكية للPTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

تقييم التغييرات المشوهة في نموذج الزرد من التعرض الكحول الجنينية

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

عزل Oligomers بي ار بي القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في دماغ الإنسان العادي

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:<em&gt; في المختبر</em&gt; ثنائي الخلايا العصبية اللدونة الفحص

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

باستخدام فيروس الغدة اسوشيتد كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في مرض

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

A الخنزير الصغير نموذج من الأطفال حديثي الولادة نقص الأوكسجين، اعتلال الدماغ الإقفاري

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

النمذجة دماغي من الولادة المبكرة قبل الولادة عن طريق نقص الأكسجة-نقص التروية مع lipopolysaccharide في البينية الذي يحيط بالجنين في الفئران

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key element is the quantitative determination of a tumor-specific genetic alteration in relation to a universal sequence using a dual-probe digital PCR assay and the subsequent calculation of the proportion of tumor cells. The assay is carried out on a culture containing tumor cells of an established line and spiked-in non-tumor cells. The mixed culture is treated with a test drug at various concentrations. After the treatment, DNA is prepared directly from the survived adhesive cells in wells of 96-well plates using a simple and inexpensive method, and subjected to a dual-probe digital PCR assay for measuring a tumor-specific genetic alteration and a reference universal sequence. In the present demonstration, a heterozygous deletion of the NF1 gene is used as the tumor-specific genetic alteration and a RPP30 gene as the reference gene. Using the ratio NF1/RPP30, the proportion of tumor cells was calculated. Since the dose-dependent change of the proportion of tumor cells provides an in vitro indication for specificity of the drug, this genetic and cell-based in vitro assay will likely have application potential in drug discovery. Furthermore, for personalized cancer-care, this genetic- and cell-based tool may contribute to optimizing adjuvant chemotherapy by means of testing efficacy and specificity of candidate drugs using primary cultures of individual tumors.

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

The goal of this protocol is to assess specificity of anticancer drugs in vitro using mixed cultures containing both tumor and non-tumor cells.

تقييم خصوصية المضاد للسرطان المخدرات<em&gt; في المختبر</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

حديثي الولادة الفئران كوكلار تقنية إكسبلانت باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; أداة الفحص في أبحاث السمع

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...