تحاول مجموعتنا متعددة التخصصات فهم كيف يمكن للبروتين المعدي ، البريون ، أداء مهام بيولوجية معقدة. نحن مهتمون أيضا بكيفية بقاء البريونات في البيئة لسنوات إلى عقود. بعد إجراءات إزالة التلوث من البريون ، لم تكن هناك طريقة قوية لتحديد فعالية تعطيل البريون.
نحن نحاول معالجة هذه المشكلة من خلال بحثنا. تسمح طريقة المسح ، إلى جانب RT-QuIC ، بأخذ عينات من مجموعة واسعة من الأسطح للكشف عن أنشطة بذر البريون. يمكن استخدام هذا للكشف عن البريونات المرتبطة بالسطح في البيئات المختبرية أو السريرية أو البيئية.
أنا مهتم بفهم كيفية تفاعل البريونات مع الأسطح ومتطلبات البريونات المرتبطة بالسطح لإثبات العدوى. للبدء ، حدد وقم بتسمية مناطق المراقبة المناسبة للمسح. قم بإعداد أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مليلتر لكل منطقة محددة وأضف 250 ميكرولترا من DPBS إلى الأنبوب الأول ، مع ترك الأنبوب الثاني فارغا.
استرجع المسحات المصنوعة من الرغوة من التخزين في منطقة خالية من تلوث البريون. قم بإعداد الضوابط الإيجابية والسلبية باستخدام متجانسات الدماغ المناسبة أو BH في DPBS. باستخدام قفازات نظيفة ، استرجع العدد المطلوب من مسحات الرغوة من العبوة وضعها في جانب المقبض لأسفل في رف أنبوبي.
التأكد من أن الأطراف لا تلامس الأسطح الأخرى. أمسك مسحة رغوة نظيفة من المقبض ، ضع 50 ميكرولترا من عينات التحكم الإيجابية والسلبية على أطراف المسحة. باستخدام المقص ، اقطع المقبض الزائد للمسحة إلى نصف طولها تقريبا وضع المسحة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المحمل مسبقا لغمر طرف الرغوة في DPBS.
أمسك بقطعة مسحة من طرف الرغوة النظيفة من المقبض ، بلل طرف الرغوة مسبقا بالماء الجزيئي وتخلص من الماء الزائد. ضع طرف الرغوة المبلل على المنطقة المختارة للمراقبة وامسح المنطقة ذهابا وإيابا 10 مرات تقريبا مع تدوير طرف المسحة على السطح في نفس الوقت. باستخدام المقص ، اقطع المقبض الزائد للمسحة إلى نصف طولها تقريبا وضع المسحة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المحمل مسبقا لغمر طرف الرغوة في DPBS ، مما يضمن إغلاق الغطاء تماما.
تخلص من القفازات واستبدلها بأخرى جديدة قبل الانتقال إلى موقع المسح التالي لتقليل التلوث المتبادل. لاستخراج المسحة ، ضع أنبوب الطرد المركزي الصغير في رف أنبوب دائري واغمر الرف في حمام مائي لصوت قرن الكأس. تأكد من أن مسحة الرغوة في DPBS داخل الأنبوب تحت سطح الماء ، مع ترك أجزاء المقبض غير مغمورة.
قم بتشغيل العينة لمدة 15 ثانية في المجموع مع خمس ثوان وخمس ثوان من الدورات. بعد الصوتنة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 15 ثانية تقريبا لجمع DPBS في الجزء السفلي من الأنبوب قبل النقل. باستخدام ماصة P 1000 مضبوطة على 250 ميكرولتر ، اجمع بعناية كل مستخلص المسحة السائلة من الأسفل إلى الأنبوب الفارغ المقابل المسمى مسبقا.
تخلص من الأنبوب المستخدم الذي يحتوي على المسحة. ركز العينة في مكثف فراغ ، مع التأكد من فتح غطاء الأنبوب ، عند اكتمال الدورة ، تأكد من تركيز العينة بالكامل مع بقاء حبيبات فقط. قم بتخزين الحبيبات على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام الآخر.
لتحليل RT-QuIC ، قم بإعداد لوحة تحكم سلبية وإيجابية مع تجانس الدماغ المقابل المخفف في محلول تخفيف الأنسجة. الآن قم بإذابة حبيبات مستخلص المسحة المخزنة من الفريزر تحت الصفر 80 درجة مئوية وأعد تعليق مستخلص المسحة المجففة ب 50 ميكرولتر من الماء الجزيئي عن طريق سحب العينات. دوامة لفترة وجيزة ، واترك العينة في درجة حرارة الغرفة.
قم بتحميل ميكرولترين من أدوات التحكم في اللوحة السالبة والموجبة متبوعة بمستخلصات المسحة في آبار الألواح RT-QuIC المعنية. لم تتجاوز مسحات التحكم السلبية عتبة التألق الإيجابي ، مما يؤكد عدم وجود تلوث أثناء الإجراءات. أظهرت مستخلصات مسحة التحكم الإيجابية بذرا ثابتا في جميع الآبار المكررة ، مما يدل على حساسية الكشف المناسبة.
فشلت عينات المسحة السطحية من المناطق غير الملوثة في إظهار البذر فوق العتبة ، مما يؤكد سلبية البريون. أظهرت الأسطح الملوثة بالبريون بذرة فوق العتبة بنسب نقاط قصوى متفاوتة وأوقات مضان مقارنة بالضوابط. فشلت الأسطح الملوثة بالبريون المعالجة بالتبييض في زرع RT-QuIC ، مما يدل على تطهير فعال.
أظهرت بعض القطع الأثرية السطحية منحنيات حركية متغيرة وأوقات مضان أطول تشير إلى إيجابيات خاطئة محتملة ، على الأرجح بسبب وجود غبار أو مواد كيميائية متبقية على السطح.
