This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

<ol>
	<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration.</a> Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+is+activated+in+degenerating+photoreceptors+in+the+rd1+mouse.">Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse.</a> Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+cyclic+nucleotide+gated+(CNG)+channels+in+cGMP-related+retinitis+pigmentosa.">A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa.</a> Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).</li><li>Frasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rod+photoreceptor+rescue+by+a+calcium-channel+blocker+in+the+rd+mouse.">Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse.</a> Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).</li><li>Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+calcium+channel+blocker+diltiazem+on+photoreceptor+degeneration+in+the+rhodopsin+Pro213His+rat.">The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).</li><li>Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+photoreceptor+rescue+with+D-cis-diltiazem+in+the+rd+mouse.">Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+changes+in+outer+segment+free-Ca2++concentration+in+salamander+cone+photoreceptors.">Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors.</a> The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+light+intensity+by+the+cone+photoreceptor+synapse.">Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 48, 555-562 (2005).</li><li>Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+stores+in+vertebrate+photoreceptors.">Calcium stores in vertebrate photoreceptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+calcium+signals+in+mouse+cone+photoreceptors.">Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).</li><li>Johnson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2++dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses.">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells.">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290, 527-528 (1981).</li><li>Hendel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+reporter+of+synaptic+activity+in+vivo.">A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo.</a> Nature Methods. 6, 883-889 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+locus+control+region+adjacent+to+the+human+red+and+green+visual+pigment+genes.">A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes.</a> Neuron. 9, 429-440 (1992).</li><li>Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).</li><li>Baden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+retinal+domains:+near-optimal+sampling+of+achromatic+contrasts+in+natural+scenes+through+asymmetric+photoreceptor+distribution.">A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution.</a> Neuron. 80, 1206-1217 (2013).</li><li>Kemmler, R., Schultz, k., Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+cone+calcium+signals+by+different+horizontal+cell+feedback+mechanisms+in+the+mouse+retina.">Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).</li><li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.+Pflugers+Archive.">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive.</a> European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spikes+in+mammalian+bipolar+cells+support+temporal+layering+of+the+inner+retina.">Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina.</a> Current Biology. 23, 48-52 (2013).</li><li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina.">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+interactions+in+the+outer+retina.">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e488 (2013).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function.">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

موجودة مسبقا البروتوكولات باستخدام التسجيلات وحيدة الخلية الكهربية أو الكالسيوم 2+ التصوير مع مؤشرات الفلورسنت الاصطناعية تكافح لتسجيل كا 2+ ديناميكية في الماوس مبصرات مخروط لعدد من الأسباب الفنية (انظر المقدمة). بروتوكول الموصوفة هنا يسمح قياس الكالسيوم 2+ الإشارات وحتى المطلقة مستويات الكالسيوم في 2+ الفردية، حدد المحطات الماوس مخروط بطريقة فعالة وبسيطة نسبيا. وقد تم بالفعل استخدام هذا البروتوكول بنجاح في ثلاثة الدراسات التي تتناول جوانب مختلفة من وظيفة مخروط في شبكية العين الماوس صحية. في الدراسة الأولى 10، وHR2.1: تميزت TN-XL الماوس باستخدام المناعية، تسجيلات أرج، واثنين من الفوتون الكالسيوم 2+ التصوير، والصيدلة، وتبين أن التعبير مخروط محددة من جهاز الاستشعار البيولوجي الكالسيوم 2+ لا يعيق تشريح مخروط وظيفة. في الدراسة الثانية 21، لونيوتم تعيين خصائص استجابة الوني من المخاريط الماوس عبر شبكية العين، مما يدل على الاختلافات البارزة في وظيفة مخروط بين &quot;الأخضر&quot; الظهرية التي يهيمن عليها أوبسين و &quot;الزرقاء&quot; بطني شبكية العين الماوس التي يهيمن عليها أوبسين. هذه الاختلافات الإقليمية في خصائص مخروط الملائمة توزيع الفرق التباين في البيئة الطبيعية (أي السماء مقابل الأرض)، مما يشير إلى أن أنواع الأطياف المختلفة من المخاريط الماوس تنص على (قرب) أخذ العينات المثلى من التناقضات الوني، وبالتالي، قد تقدم ميزة تطورية. وفي الدراسة الثالثة 22 ردود الفعل المتبادل أن محطات مخروط محور عصبي تتلقى من الخلايا الأفقية والتحقيق فيها. وجميع آليات التغذية المرتدة الخلايا الأفقية المقترحة تعمل على الجهد بوابات الكالسيوم 2+ القنوات في محطات مخروط محور عصبي 28، محطة مخروط الكالسيوم 2+ يمكن أن تكون بمثابة وكيل لالأفقية الخلية الى مخروط التفاعلات. الدراسة التي Kemmler وزملاء العمل 22 دعاماتويرى أن الخلايا الأفقية تستخدم نظام التغذية المرتدة معقدة تتألف من عدة آليات للسيطرة على مستقبلة للضوء الإفراج الغلوتامات. وتوضح هذه الدراسات براعة بروتوكول صفها وتبين أنه يمكن تكييفها لمجموعة واسعة من المسائل المتعلقة ظيفة مخروط ودوائره متشابك. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البروتوكول يتيح يدرسون المحلية كا 2+ يشير في المقصورات مخروط مختلفة، من أجل التوصل إلى فهم أفضل للمخروط علم وظائف الأعضاء. هذه المعرفة هي مهمة لفهم العمليات الفيزيولوجية المرضية في المخاريط التردي، للسماح في نهاية المطاف لتنمية عقلانية النهج العلاجية المحتملة، ولا سيما بالنسبة للأمراض التنكسية التي تؤثر على المخاريط. في HR2.1: TN-XL خط الماوس، وأعرب عن كا 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي في جميع أنحاء مخروط، باستثناء الجزء الخارجي. وهذا يوفر فرصة للتقييم المباشر وratiometric من الكالسيوم 2+ ديناميكيةالصورة في مقصورات مخروط مختلفة. منذ التغييرات في كا تنعكس 2+ التيارات في الجزء الخارجي في المحطات عبر غشاء المحتملة وتفعيل الناتجة من الجهد بوابات الكالسيوم 2+ القنوات والعمليات في الجزء الخارجي يمكن ملاحظة غير مباشرة. المزالق المحتملة: تشريح شبكية العين هو خطوة حاسمة: في الماوس، وشبكية العين يفصل من فنجان العين عادة بين قطاعات مبصرة الخارجي والظهارة الصبغية. لذلك، تتعرض مبصرة حساسة للضوء شرائح الخارجية للشبكية العين معزولة وحساسة للغاية لالتلف الميكانيكي. يجب توخي الحذر الشديد لا يلحق الضرر عن طريق لمس الجانب مبصرة مع الأدوات أو عن طريق تحريك الأنسجة جانبية على سطح لاصق (على سبيل المثال، غشاء فلتر). ويمكن التعرف على شرائح الشبكية عالية الجودة تحت المجهر من قبل سطح القطع نظيفة وبواسطة طبقة مبصرة منظمة تنظيما جيدا مع قطاعات الخارجية واضحة المعالم. التقييم الوظيفي للجودة شريحة يمكن القيام به بسرعة من خلال إضاءة مؤثرات الضوء الساطع وتحديد نسبة من المخاريط تستجيب (على سبيل المثال، في مجال الرؤية مع 10-20 المخاريط). هنا، يجب أن يتم تقييم نوعية استجابة عن طريق حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S / N) (السعة من الضوضاء الأساسي قبل الحافز ضوء مقابل مدى الاستجابة الخفيفة)؛ وينبغي النظر في 3 كحد ادنى عتبة - وS / N من 2. عادة، ونحن تجاهل شرائح مع المخاريط تستجيب أقل من 50٪. شرائح أيضا مع الأقماع التي تعرض المفرط السلوك العفوي ارتفاعه (انظر الشكل 4 في 10) وينبغي التخلص منها. شرائح في غرفة تسجيل تلبي معايير التشريحية والوظيفية المذكورة أعلاه تظهر استجابات متسقة ل1-2 ساعة (لمزيد من التفاصيل على اتساق الاستجابة، انظر 10). لأن شرائح البقاء على قيد الحياة لحبلدنا في غرفة القابضة، ويمكن تجربة ناجحة تستغرق ما يصل الى 6 ساعات. ومن الجدير بالذكر أن هناك بعض القيود فيما يتعلق بدراسة تتراوح طويلة التفاعلات المكانية بين الأقماع والخلايا الأفقية، كما تشريح يقطع حتما الاتصالات الجانبية في شبكات الشبكية. إلا أن زيادة سمك شرائح الشبكية إلى 300 ميكرومتر إلى التقليل هذه المسألة 22. استخدام شرائح الشبكية العمودية يتجنب مسح مخروط حساسة للضوء شرائح الخارجي بواسطة الليزر الإثارة، وبالتالي يمنع إلى حد كبير تبيض أوبسين (للمناقشة مستفيضة، انظر 10،21). ومع ذلك، فإن سجلت الكالسيوم 2+ إشارات يعتمد ليس فقط على مؤثرات الضوء، ولكن أيضا الحصول على المتضررين من عنصر الإضاءة الخلفية التي تم إنشاؤها بواسطة الليزر المسح الإثارة. في الواقع، فإن الإضاءة الخلفية فعالة في مثل هذه التجارب التصوير ثنائي الفوتون هو مزيج من ضوء الليزر متناثرة، وعلى ضوء الفلورسنت المنبعثة من م سجلتLLS، وأي مكون الخلفية LED التحفيز. ولذلك، ينبغي أن يسمح المخاريط للتكيف لا يقل عن 20 - 30 ثانية لمسح الليزر (مع المكون خلفية التحفيز ضوء تشغيل) قبل التسجيل. المزايا والتطبيقات: في حين أن بعض التطبيقات لهذا المخروط الكالسيوم 2+ بروتوكول -imaging وقد وصفت أعلاه 10،21،22، تطبيقات أخرى يمكن تصوره: الدراسات الدوائية في تركيبة مع مخروط الكالسيوم 2+ التصوير قد تحقق كا 2+ مسارات إشارات في الأقماع ويمكن أن تكون استخدامها لاختبار فعالية وفاعلية من العقاقير التي تستهدف مختلف اللاعبين في كا 2+ -signaling 10. ومع ذلك، قد يكون مفتاح التطبيق لدراسة الأمراض التي تصيب ظيفة مخروط. تتوفر العديد من النماذج تنكس الشبكية الماوس محاكاة الأمراض التي تصيب الإنسان. على سبيل المثال، (cpfl 1) الماوس فقدان مخروط مبصرة 1 هو مخروط الأساسي نموذج انحطاط المعاناةمن طفرة Pde6c 29. على العكس، فإن الماوس قضيب انحطاط 1 (الثالثة 1) يعاني من طفرة Pde6b. في حين أن هذا يسبب قضيب الأساسي مبصرة انحطاط 30، بمجرد الانتهاء من الثالثة 1 قضيب الخسارة، الثانوية مجموعات انحطاط مخروط في 1. تهجين هذه الحيوانات مع HR2.1: سوف TN-XL خط تسمح دراسة ومقارنة كا 2+ ديناميكية في كل من انحطاط مخروط الابتدائي والثانوي، ومن المرجح أن توفر معلومات قيمة حول دور الكالسيوم 2+ خلال موت الخلايا المخروطية. أيضا، التي يسببها دواء انحطاط مخروط - على سبيل المثال باستخدام مثبطات انتقائية PDE6 - قد تساعد على تحديد الآليات المصب من انحطاط مخروط 10،29،31. باختصار، وصف بروتوكول هنا يسمح قياس الكالسيوم 2+ في مقصورات التحت خلوية من المستقبلات الضوئية الماوس مخروط، ويقدم فرصا كبيرة للكشف عن مخروط علم وظائف الأعضاء في إطار مجموعة واسعةمن الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص وكلاء الدوائية مصممة لتتداخل مع مخروط الكالسيوم 2+ -signaling وبالتالي تساعد على إنشاء علاجات جديدة لأمراض مخروط.

الرؤية تبدأ مع تفعيل الناجم عن ضوء سلسلة phototransduction في المستقبلات الضوئية في شبكية العين. مبصرات قضيب تسمح الرؤية في ضوء المستويات المنخفضة، في حين أن خلايا مستقبلة للضوء مخروطية تتوسط اللون وعالية الدقة للرؤية ضوء النهار. العديد من الجينات مبصرة محددة عرضة للطفرات التي تؤدي إلى تدهور هذه الخلايا. وقد تم تحديد عدد من الواسمات الجزيئية المرتبطة مع فقدان مبصرة 1، ولكن حتى الآن الآليات الجزيئية مفصلة وتسلسل الأحداث لا تزال غير واضحة. وتكهن تغيير كا 2+ التوازن ليكون نقطة انطلاق لموت الخلايا المستقبلة للضوء، وهي الفرضية التي يدعمها تنظيم يصل لنشاط الكالسيوم 2+ معتمد على البروتياز calpain من نوع خلال 2،3 عملية انحطاط. ولكن، حتى الآن، لا تدعمها هذه الفرضية من قبل القياسات الفسيولوجية من الكالسيوم 2+. التناقضات في العديد من الدراسات حول تأثير الكالسيوم 2+ حاصرات قناة في إعادةمزيد من الطعن الأمراض tinal مشاركة الكالسيوم 2+ في موت الخلايا 4-6، داعيا إلى أساليب لتقييم مباشرة الكالسيوم 2+ في مبصرات مخروط الثدييات. سابقا، وقد تم تنفيذ معظم تسجيل الكهربائية والدراسات التصوير الكالسيوم 2+ في نماذج من البرمائيات والزواحف بسبب سهولة الحصول على المخاريط 7-9. ومع ذلك، قد يكون الثدييات علم وظائف الأعضاء مبصرة يختلف عن ذلك من غير الثدييات 10 وخاصة، في سياق البشري تنكس الشبكية الوراثي، فهم أفضل من الثدييات علم وظائف الأعضاء مبصرة هو المفتاح لتطوير علاجات مبتكرة. كثيرة نماذج الماوس محاكاة أمراض الشبكية البشرية المتاحة ولكن لا يعرف الكثير عن الكالسيوم 2+ ديناميكية في المخاريط الماوس 11. التقنيات الكهربائية ليست مناسبة للتسجيلات عالية الإنتاجية من المخاريط، ولا سيما ليس في الفئران، حيث قضبان (~ 97٪) يفوق عدد كبير المخاريط (~ 3٪) 12 </sتصل&gt;. وعلاوة على ذلك، وتقنيات الكهربية حساسة مثل خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك تخل الوسط بين الخلايا وتوفر البيانات حول Ca 2+ التيارات ولكن ليس على الكالسيوم داخل الخلايا 2+ تركيزات المطلقة. وبالتالي، على الرغم من القرار الزماني أقل، والتصوير هو الأسلوب المفضل عند معالجة تساؤلات حول مخروط الكالسيوم 2+ ديناميات. القضية الرئيسية مع التصوير هي كيفية تسمية انتقائي المخاريط مع الكالسيوم الفلورسنت 2+ صبغ المؤشر. التقسيم السليم وخصوصية خلية من الصعب تحقيقه من خلال &quot;الجزء الأكبر التحميل&quot; الاصطناعية الكالسيوم 2+ الأصباغ المؤشر في الأنسجة. ونتيجة لذلك، والأقماع المسمى، قضبان 13،14، والخلايا الدبقية مولر لا يمكن تمييزها بشكل موثوق. أيضا، والأصباغ الاصطناعية تميل إلى يتسرب من الخلايا، ومنع التسجيلات لفترات طويلة في ظل ظروف مماثلة. وعلاوة على ذلك، وتحميل الاصطناعية مؤشرات الكالسيوم 2+ في شكل AM استر على إشكالية، لأنها تتطلب ديtergents (على سبيل المثال، DMSO) ويولد الفورمالديهايد 15. لالمطلقة الكالسيوم 2+ القياسات والمؤشرات ratiometric إلزامية. ومع ذلك، فإن أفضل مؤشر ratiometric الاصطناعية المتاحة حاليا FURA-2 يتطلب ضوء الإثارة في نطاق 700-760 نانومتر (لمدة الفوتون الإثارة)، والتي، اعتمادا على كثافة، ويمكن في حد ذاته تحفيز المخاريط، وبالتالي عرقلة دراسات مخروط الكالسيوم 2+ ديناميكية في ظل ظروف الإضاءة الفسيولوجية. على عكس الأصباغ الاصطناعية، ويمكن التعبير عن المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ المؤشرات في نوع الانتقائي الخلية الطريقة. انهم لا يتسرب من الخلايا، وبالتالي، إذا تم تجنب التبييض، وقياسات ratiometric طويلة وموثوق بها أمر ممكن. عندما جنبا إلى جنب مع اثنين من الفوتون المجهري، يمثل نوع انتقائي الخلايا التعبير كا 2+ أجهزة الاستشعار أداة قوية لتقييم ودراسة دوين الخلوي الكالسيوم 2+ في ظل الظروف الفسيولوجية إلى حد كبير 13،16،17 </سوب&gt;. هنا، نحن تصف البروتوكول لدراسة الخفيف أثار التحفيز مخروط الكالسيوم 2+ ديناميكية في المعدلة وراثيا الكالسيوم 2+ خط جهاز الاستشعار البيولوجي الماوس (HR2.1: TN-XL)، والذي يعبر عن القائم الحنق الكالسيوم 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي TN-XL 18 انتقائي في المخاريط، تحت البشرية أوبسين الأحمر المروج HR2.1 19. للوصول إلى محطات مخروط، كان يعمل على إعداد شريحة الجسم الحي السابقين 20. تم بالفعل استخدام بروتوكول بنجاح في ثلاث دراسات على وظيفة مخروط في الفئران السليمة 10،21،22. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول يسمح بدراسة مخروط الكالسيوم 2+ يشير في ظروف جينية محددة، على سبيل المثال، من خلال تهجين نماذج الماوس لتنكس الشبكية الوراثي مع HR2.1: الفئران TN-XL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for tissue chopper</td>
			<td>MARTOR KG</td>
			<td>ARGENTAX No. 1044</td>
			<td>0.25 mm; http://www.martor.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AABG01300</td>
			<td>Filter type: 0.8 &#181;m; http://www.emdmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP</td>
			<td>CP pharma</td>
			<td>AP/DRUGS/220/96</td>
			<td><a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/green LED-based full-field stimulator</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>for details, see10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open source microprocessor board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software CfNT</td>
			<td>Custom-written</td>
			<td></td>
			<td>developed by Michael M&#252;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC3-4 System focal perfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instrument</td>
			<td></td>
			<td>with 100 &#956;m-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td>
			<td>Newport Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Movable objective microscope (MOM), 
			Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPlanFL 20x/0.95w objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer 100 series</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.surgivet.com/">http://www.surgivet.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Calcium salt</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I24222</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101191250</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ95</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

خلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين مخروط (المخاريط) تخدم رؤية ضوء النهار وهي أساس تمييز الألوان. تخضع الأسعار لانحطاط، وغالبا ما تؤدي إلى العمى في كثير من أمراض شبكية العين. الكالسيوم (الكالسيوم 2+)، رسول الثاني رئيسيا في إشارة مستقبلة للضوء والتمثيل الغذائي، وقد اقترح أن تكون مرتبطة بشكل غير مباشر مع انحطاط مستقبلة للضوء في مختلف النماذج الحيوانية. دراسة منهجية هذه الجوانب من مخروط علم وظائف الأعضاء وأعيقت الفيزيولوجيا المرضية التي كتبها الصعوبات تسجيل كهربائيا من هذه الخلايا الصغيرة، ولا سيما في الماوس حيث تهيمن على شبكية العين عن طريق المستقبلات الضوئية قضيب. للتحايل على هذه المشكلة، أنشأنا اثنين من الفوتون الكالسيوم 2+ بروتوكول التصوير باستخدام خط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي TN-XL حصرا في الأقماع ويمكن تهجينها مع نماذج الماوس لانحطاط مبصرة. بروتوكول الموصوفة هنا ينطوي على إعداد المقاطع الرأسية (R20؛ شرائح &quot;) من شبكية العين من الفئران والتصوير الضوئي من التغيرات أثار التحفيز الخفيفة في مخروط كا مستوى 2+. بروتوكول يسمح أيضا &quot;في شريحة قياس&quot; للمطلقة الكالسيوم 2+ تركيزات؛ كما التسجيلات يمكن اتباعها من قبل المعايرة. هذا البروتوكول يتيح الدراسات إلى خصائص مخروط وظيفية، ويتوقع أن تسهم في فهم مخروط الكالسيوم 2+ يشير فضلا عن تورط محتمل ل Ca 2+ في مبصرة الموت وتنكس الشبكية.

من خلال الجمع بين شرائح عمودية (الشكل 1) التي أعدت من HR2.1: TN-XL الماوس شبكية العين مع اثنين من الفوتون التصوير (الشكل 2)، تمكنا من إجراء قياسات ratiometric من ضوء أثار التحفيز الكالسيوم 2+ إشارات في محطات محوار مخروط مبصرة . هذا النهج يمثل تحسنا كبيرا في الوصول إلى تصور والمخاريط الماوس فوق أساليب التصوير الضوئية الموجودة مسبقا مع الاصطناعية مؤشرات الكالسيوم 2+. على سبيل المثال، والتعبير عن مخروط محددة من الكالسيوم ratiometric المشفرة وراثيا 2+ جهاز الاستشعار البيولوجي TN-XL سهلت كثيرا من تحديد محطات مخروط محور عصبي (انظر رويس في الشكل 3A). لذلك، لدينا بروتوكول يزيل خطر إشارات تسجيل الأصل غير واضح، على سبيل المثال إشارات &quot;مختلطة&quot; مع مساهمات من كل مخروط وقضيب محور عصبي المحطات. نهجنا يسمح حل ردود احد للمحاكمة في مستوى indiviالمزدوج محطة مخروط محور عصبي. ويتميز النتوء الخفيف أثار كا 2+ من محطة مخروط بزيادة ونقصان في المانحة ومتقبل مضان، على التوالي (الشكل 3B). انخفاض في نسبة مضان (R) يتوافق مع قذف الكالسيوم 2+ من محطة مخروط (الشكل 3C)، الناجم عن فرط الاستقطاب الناجم عن الضوء للمخروط وإغلاق لاحق من الجهد بوابات الكالسيوم 2+ القنوات. لأنه لا يمكن رصدها عدة محطات مخروط محور عصبي في وقت واحد (الشكل 3A)، الحصول على البيانات فعال جدا ومئات من الردود مخروط الكالسيوم 2+ يمكن جمعها في تجربة واحدة. من خلال تقييم هذه الردود كميا (الشكل 4)، مخروط الكالسيوم 2+ إشارات يمكن مقارنتها وتقييمها في مجموعة من الظروف (انظر مناقشة). غالبا ما يكون كافيا لاستخدام النسبة بين الحنق متقبل (السترين) و-donor (eCFP) مضان(F A / F D؛ لمزيد من التفاصيل، انظر 3.4) كإجراء النسبي من الخلايا مستوى الكالسيوم 2+. ومع ذلك، وكلما لزم الأمر، يمكن معايرة نسبة الحصول المطلقة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ تركيزات ([كا 2+]) (الشكل 5). في الإضاءة الخلفية المستخدمة في هذا البروتوكول (لمزيد من التفاصيل، انظر 10 والشكل 3 أسطورة)، أسفرت عن معايرة تقديرا ليستريح المطلق [كا 2+] في &quot;البرية من نوع&quot; HR2.1: TN-XL محطات الماوس مخروط 243 ± 159 نيوتن متر (يعني ± SD)، والذي هو ضمن نطاق ذكرت بالنسبة للفئران في الأدب (11). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> الشكل 1. إعداد شرائح الشبكية العمودية. (A) معزولة وسوت شبكية العين أعدت للتشريح. (B) قطعة مستطيلة من شبكية العين (قه ه المربع الأحمر في A) التي شنت على غشاء رقة الترشيح (رمادي غامق) تشريح بعد. (C) أعلى نظرا للشريحة الشبكية محمولة على غشاء ثابتة على ساترة الزجاج باستخدام الشحوم. (D) الرسم التخطيطي لجزء من شريحة الشبكية (انظر الإطار الأحمر في C). يشار إلى مبصرات مخروط باللون الأخضر. V، بطني. D، الظهرية. N، الأنف. T والزمنية. OS، الجزء الخارجي؛ ONL، طبقة النووية الخارجي؛ اوبل، طبقة ضفيري الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية. IPL، طبقة ضفيري الداخلية؛ GCL، طبقة الخلايا العقدية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> الشكل 2. ثنائي الفوتون التصوير من شرائح الشبكية: رسم توضيحي لتكوين تسجيل أعلى: مياه الغمر عدسة موضوعية تركز على أن يكونصباحا من الليزر المسح الضوئي (أحمر السهم نحو الانخفاض) في شبكية العين، وجمع مضان المنبعثة (الأسهم الصاعدة). عدسة ايضا تجمع تنتقل عن طريق الأشعة تحت الحمراء من LED الإضاءة التي شنت تحت المكثف عند تصوير شريحة باستخدام كاميرا CCD المركز:. شريحة الشبكية التي تقام في غرفة تسجيل ومع perfused حل خارج الخلية أسفل: عدسة المكثف تركز الضوء من المصابيح التحفيز (وLED الأشعة تحت الحمراء للتصوير كاميرا CCD) من خلال الجزء السفلي شفاف للغرفة تسجيل في أنسجة الشبكية. IR LED، الأشعة تحت الحمراء الصمام الثنائي الباعثة للضوء. CCD، جهاز إلى جانب المسؤول. BP، الفرقة تمرير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> الشكل 3. خفيفة إستدعردود د كا 2+ في محطات محوار من المستقبلات الضوئية الماوس مخروط. (A) بقي من الزمن: تركز تسجيلات على المحطات متشابك (مربع أحمر) من مبصرات مخروط (الأخضر) في شرائح الشبكية الحق: مثال لمنطقة تسجيلها مع 7 محطات الفردية. وسجلت مضان باستخدام قناتين: واحد للالسترين الحنق متقبل (أعلى؛ 535 BP 50) واحد للالحنق الجهات المانحة eCFP (أسفل؛ 480 BP 32) (B) التغييرات الخفيفة، أثار في السترين (F A) وeCFP (F D) مضان سجلت في ROI واحد. الردود (C) كا 2+ (كنسبة F A / F D) من محطة مخروط لسلسلة من 1 ثانية ومضات الضوء الساطع في 5 فترات ثانية. العائد على الاستثمار، والمنطقة في المصالح؛ BP، وتصفية الفرقة تمرير؛ F، كثافة مضان. الاتحاد الافريقي، وحدات التعسفي. الحنق، فورستر نقل الطاقة الرنين. eCFP، وتعزيز البروتين مضان سماوي. كثافة التحفيز (كما صمعدل النموذجية المتعلقة بصحة-المماكبة في 10 3 · ف · ق -1 في مخروط): 13.0 و 12.8 لM- وS-opsins، على التوالي، مضيفا على مستوى الخلفية (= المصابيح قبالة والمسح الضوئي الإثارة ليزر) 10 ~ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> الرقم 4. التحليل الكمي المثالية لمخروط أثار الخفيف الكالسيوم 2+ الردود (A) خفيفة أثار كا 2+ الردود (كما ΔR) من محطة مخروط واحدة (المحاكمات واحدة: آثار الرمادية، ن = 16؛ يعني: أثر أسود ) (B) المعلمات لتحديد متوسط ​​الكالسيوم 2+ رد: يستريح الكالسيوم 2+ مستوى (قاعدة R) الذي يمثل خط الأساس قبل التحفيز الخفيفة، حجم الاستجابة كما ARعصام قيد منحنى (R A) وذروة السعة (R أمبير)، حركية بداية استجابة (ر الارتفاع، الفاصل الزمني من 20٪ إلى 80٪ من R أمبير) وتعويض (ر الاضمحلال، والفاصل الزمني من 80٪ 20٪ من R أمبير). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> الرقم 5. تقدير المطلق تركيز الكالسيوم 2+. يستريح الكالسيوم 2+ تركيز ([كا 2+]، ونسبة F A / F D) المسجلة في محطات محوار 8 مخروط في الماوس TN-XL (الدوائر، مع متوسط ​​± SD) لمختلف الحلول خارج الخلية: مرتين في القياسية المتوسطة خارج الخلية (السيطرة 1 و 2)، ثم مع الحد الأدنى (&quot;صفر&quot;) [كا 2+] (10 ملي EGTA) لد مع ارتفاع [كا 2+] (2.5 ملم)، وهذا الأخير شرطين في وجود 5 ميكرومتر ionomycin لكي تتوازن خارج الخلية والكالسيوم داخل الخلايا 2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina at JoVE.com

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

وصفنا بروتوكول لمراقبة كا 2+ ديناميكية في محطات محوار مبصرات مخروط باستخدام إعداد شريحة فيفو السابقين في شبكية العين الماوس. هذا البروتوكول يسمح دراسات شاملة للمخروط الكالسيوم 2+ الإشارات في نظام المهم نموذج الثدييات، والفأر.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.5K Views.  University of Tübingen.  وصفنا بروتوكول لمراقبة كا 2+ ديناميكية في محطات محوار مبصرات مخروط باستخدام إعداد شريحة فيفو السابقين في شبكية العين الماوس. هذا البروتوكول يسمح دراسات شاملة للمخروط الكالسيوم 2+ الإشارات في نظام المهم نموذج الثدييات، وال?...

Video: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal تسجيلات ERG من شبكية العين الفأر: ورود Photoresponses المخروط

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

استخدام pHluorin لتقييم ديناميات مستقبلات الإرشاد أكسون في زراعة الخلايا وفي الجنين الفرخ

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

تصور جسيم داخلي حيوية في محطات عصب المعيشة مع رباعية الابعاد التصوير الإسفار

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...