This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

<ol>
	<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration.</a> Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+is+activated+in+degenerating+photoreceptors+in+the+rd1+mouse.">Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse.</a> Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+cyclic+nucleotide+gated+(CNG)+channels+in+cGMP-related+retinitis+pigmentosa.">A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa.</a> Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).</li><li>Frasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rod+photoreceptor+rescue+by+a+calcium-channel+blocker+in+the+rd+mouse.">Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse.</a> Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).</li><li>Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+calcium+channel+blocker+diltiazem+on+photoreceptor+degeneration+in+the+rhodopsin+Pro213His+rat.">The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).</li><li>Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+photoreceptor+rescue+with+D-cis-diltiazem+in+the+rd+mouse.">Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+changes+in+outer+segment+free-Ca2++concentration+in+salamander+cone+photoreceptors.">Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors.</a> The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+light+intensity+by+the+cone+photoreceptor+synapse.">Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 48, 555-562 (2005).</li><li>Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+stores+in+vertebrate+photoreceptors.">Calcium stores in vertebrate photoreceptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+calcium+signals+in+mouse+cone+photoreceptors.">Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).</li><li>Johnson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2++dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses.">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells.">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290, 527-528 (1981).</li><li>Hendel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+reporter+of+synaptic+activity+in+vivo.">A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo.</a> Nature Methods. 6, 883-889 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+locus+control+region+adjacent+to+the+human+red+and+green+visual+pigment+genes.">A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes.</a> Neuron. 9, 429-440 (1992).</li><li>Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).</li><li>Baden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+retinal+domains:+near-optimal+sampling+of+achromatic+contrasts+in+natural+scenes+through+asymmetric+photoreceptor+distribution.">A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution.</a> Neuron. 80, 1206-1217 (2013).</li><li>Kemmler, R., Schultz, k., Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+cone+calcium+signals+by+different+horizontal+cell+feedback+mechanisms+in+the+mouse+retina.">Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).</li><li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.+Pflugers+Archive.">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive.</a> European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spikes+in+mammalian+bipolar+cells+support+temporal+layering+of+the+inner+retina.">Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina.</a> Current Biology. 23, 48-52 (2013).</li><li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina.">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+interactions+in+the+outer+retina.">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e488 (2013).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function.">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495 (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקולים קיימים מראש באמצעות הקלטות מתא בודד אלקטרו או Ca 2 + הדמיה עם אינדיקטורים ניאון סינטטיים להיאבק כדי להקליט את 2 + Ca הדינמיקה בקולטני אור קונוס עכבר למספר הסיבות טכניות (ראה מבוא). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר המדידה של Ca 2 + אותות ואפילו Ca 2 + רמות מוחלטות במסופים בודדים שנוצר על קונוס העכבר בדרך יעילה ופשוטה יחסית. פרוטוקול זה כבר שימש בהצלחה בשלושה מחקרים העוסקים בהיבטים שונים של תפקוד חרוט ברשתית עכבר בריאה. במחקר הראשון 10, HR2.1: עכבר TN-XL התאפיין באמצעות אימונוהיסטוכימיה, הקלטות ERG, שני פוטונים הדמיה Ca 2 +, ופרמקולוגיה, מראה כי ביטוי קונוס הספציפי של biosensor Ca 2 + לא להפריע האנטומיה חרוט ותפקוד. במחקר השני 21, כרומטיתומאפייני תגובה אכרומטית של קונוסים עכבר מופו על פני הרשתית, מדגימים הבדלים בולטים בתפקוד קונוס בין הגב-נשלט opsin &quot;הירוק&quot; והרשתית &quot;הכחולה&quot; הנשלט opsin הגחון העכבר. הבדלים האזוריים אלה בנכסי קונוס תאמו את חלוקת ניגוד ההפרש בסביבה הטבעית (כלומר, שמים לעומת קרקע), המצביעים על כך הסוגים השונים של קונוסים הרפאים עכבר לספק ל( ליד) דגימה אופטימלית של ניגודים אכרומטית ו, ובכך, עשויה להציע יתרון אבולוציוני. במחקר השלישי 22 המשוב ההדדי שסופי האקסון חרוט מקבלים מהתאים אופקיים נחקר. כפי שכל מנגנוני משוב תא אופקי הציעו לפעול במתח מגודרת 2 + ערוצי Ca בסופי האקסון קונוס 28, מסוף חרוט Ca 2 + יכול לשמש כמדד לאינטראקציות תא אל החרוט אופקיים. המחקר על ידי Kemmler ועמיתים לעבודת 22 תומכיםההשקפה שתאים אופקיים להשתמש במערכת משוב מורכבת הכוללת מספר מנגנונים לשלוט שחרור גלוטמט קולטי האור. מחקרים אלה ממחישים את הרבגוניות של הפרוטוקול המתואר ולהראות שזה יכול להיות מותאם למגוון רחב של שאלות הנוגעות פונקצית חרוט ומעגלים הסינפטי. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר ללמוד Ca 2 + איתות מקומית בתאי קונוס השונים, להבנה טובה יותר של הפיסיולוגיה קונוס. ידע כזה חשוב להבין תהליכי pathophysiological בקונוסים מנוונים, כדי לאפשר סופו של דבר לפיתוח רציונלים של גישות טיפוליות פוטנציאליות, במיוחד למחלות ניווניות המשפיעות על קונוסים. בHR2.1: קו עכבר TN-XL, biosensor Ca 2 + בא לידי ביטוי בכל חרוט, למעט הקטע החיצוני. זה מספק הזדמנות להערכה ישירה וratiometric של Ca 2 + דינמייםים בתאי קונוס שונים. מאז שינויים בCa 2 + זרמים במגזר החיצוני משתקפים במסופים באמצעות פוטנציאל הממברנה וההפעלה של ערוצי Ca 2 + מתח מגודרת וכתוצאה מכך, תהליכים בקטע החיצוני ניתן להבחין באופן עקיף. בעיות פוטנציאליות: הנתיחה של הרשתית היא שלב קריטי: בעכבר, הרשתית נפרדת מעיינית בדרך כלל בין מגזרים חיצוניים קולטי האור ואפיתל הפיגמנט. לכן, המגזרים החיצוניים קולטי האור רגיש לאור של הרשתית המבודדת חשופים ורגישים מאוד לפגיעות מכאניות. יש לנקוט בזהירות רבה שלא לפגוע על ידי נגיעה בצד קולטי האור עם כלים או על ידי הזזת הרקמות הצידה על משטח דבק (למשל, קרום מסנן). יכולות להיות מוכרות פרוסות רשתית באיכות גבוהה מתחת למיקרוסקופ על ידי משטח החיתוך הנקי שלהם ובשכבת קולטי האור מאורגנת היטב עם מגזרים חיצוניים ברורים. הערכה תפקודית של איכות פרוסה יכולה להיעשות במהירות על ידי מהבהב גירויי אור בהירים וקביעת אחוז קונוסים תגובה (לדוגמא, בשדה ראייה עם 10 - 20 קונוסים). הנה, איכות תגובה צריכה להיות מוערכת על ידי חישוב יחס אות לרעש (S / N) (משרעת של רעש בסיס לפני גירוי האור לעומת משרעת של תגובת האור); S / N של 2 - 3 צריך להיחשב כסף המינימאלי. בדרך כלל, אנחנו זורקים פרוסות עם קונוסים מגיבים פחות מ -50%. פרוס גם עם קונוסים המציגים מוגזמת התנהגות spiking הספונטני (ראה איור 4 ב 10) אמור להיות מושלכת. פרוסות בחדר ההקלטה שעומדות בקריטריונים אנטומיים ותפקודיים האמורים להראות תגובות עקביות ל1 - שעה 2 (לפרטים על עקביות תגובה, ראה 10). בגלל פרוסות לשרוד במשך שעותשלנו בתא מחזיק, ניסוי מוצלח יכול להימשך עד 6 שעות. ראוי לציין כי יש כמה הגבלות ביחס לחקר אינטראקציות מרחבי ארוכים הנעות בין קונוסים ותאים אופקיים, כמו חיתוך בהכרח מנתקת קשרי רוחב ברשתות רשתית. עם זאת, הגדלת העובי של פרוסות רשתית 300 מיקרומטר קילה נושא זה 22. השימוש בפרוסות רשתית אנכיות מונעת סריקה של מגזרים חיצוניים קונוס רגיש לאור על ידי לייזר העירור, ולכן, במידה רבה, מונעת הלבנת opsin (לדיון נרחב, לראות 10,21). עם זאת, Ca 2 + האותות נרשמו תלויים לא רק בגירויי האור, אלא גם לקבל מושפע רכיב תאורת רקע שנוצר על ידי לייזר עירור סריקה. למעשה, תאורת הרקע היעילה בניסויי הדמיה שני פוטונים כזה הוא שילוב של אור הלייזר מפוזר, אור הניאון הנפלט על ידי CE נרשםLLS, וכל רכיב רקע גירוי LED. לכן, יש לאפשר קונוסים להתאים לפחות 20 - 30 של לסריקת לייזר (עם רכיב הרקע של גירוי האור מופעלים) לפני ההקלטה. יתרונות ויישומים: בעוד כמה בקשות לקונוס זה Ca 2 + פרוטוקול -imaging תוארו לעיל 10,21,22, ניתן חזו יישומים אחרים: מחקרים פרמקולוגיים בשילוב עם חרוט הדמיה Ca 2 + עשוי לאמת Ca 2 + מסלולי איתות בקונוסים ויכולים להיות משמש לבדיקת יעילות ועצמה של תרופות המכוונות לשחקנים שונים בCa 2 + -signaling 10. עם זאת, יישום עשוי להיות מפתח ללמוד מחלות המשפיעות על תפקוד קונוס. מודלים עכבר ניוון רשתית רבים מחקה מחלות אנושיות זמינים. לדוגמא, העכבר (1 cpfl) הפסד קולטי האור חרוט 1 הוא סבל מודל ניוון חרוט עיקריממוטציה Pde6c 29. לעומת זאת, עכבר ניוון מוט 1 (RD 1) סובל ממוטציה Pde6b. אמנם זה גורם לניוון מוט העיקרי קולטי האור 30, ברגע שאובדן מוט RD 1 הושלם, ערכות ניוון חרוט המשניות ב 1. הכלאת החיות האלה עם HR2.1: קו TN-XL יאפשר לימוד והשוואת 2 + Ca דינמיקה בשני הניוון החרוט הראשוני והמשני ועשוי לספק תובנות רבות ערך לתפקיד של Ca 2 + במוות של תאים חרוט. כמו כן, פרמקולוגית מושרה ניוון קונוס - למשל באמצעות מעכבי PDE6 סלקטיבית - יכול לשמש כדי לזהות את המנגנונים במורד הזרם של 10,29,31 ניוון חרוט. לסיכום, הפרוטוקול מתואר כאן מאפשר מדידת Ca 2 + בתאי subcellular של קולטני האור קונוס העכבר ומציגה הזדמנויות גדולות לחשוף פיזיולוגיה קונוס תחת מגוון רחבתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש להקרנה של סוכנים תרופתיים שנועדו להפריע ל-signaling קונוס Ca 2 + ובכך לסייע להקמת טיפולים חדשים למחלות קונוס.

חזון מתחיל בהפעלה מושרה האור של מפל phototransduction בקולטני אור ברשתית. קולטני אור רוד מאפשר ראייה ברמות אור נמוכות, ואילו קולטני אור קונוס לתווך חזון אור צבע ורזולוציה גבוהה. גני קולטי האור ספציפי רבים רגישים למוטציות המובילות לניוון של תאים אלה. מספר הסמנים מולקולריים הקשורים באובדן קולטי האור זוהה 1, אך עד כה המנגנונים מולקולריים מפורטים ורצף אירועים לא ברורים. הומאוסטזיס שינה Ca 2 + היה העריך להיות הדק של מוות של תאי קולטי האור, השערה נתמכת על ידי עד-הסדרת הפעילות של Ca 2 + פרוטאזות -dependent calpain-הסוג במהלך 2,3 תהליך הניוון. עם זאת, נכון להיום, השערה זו אינה מגובה במדידות פיסיולוגיות של Ca 2 +. חוסר עקביות במספר מחקרים על ההשפעה של חוסמי הערוץ 2 + Ca מחדשמחלות tinal תיגר נוספת על המעורבות של Ca 2 + בתא המוות 4-6, קורא לשיטות להעריך ישירות Ca 2 + בקולטני אור קונוס יונקים. בעבר, רוב ההקלטה החשמלית ובדיקות ההדמיה Ca 2 + בוצעו בדגמים דו-חיים וזוחלים בגלל הגישה קלה יותר לקונוסים 7-9. עם זאת, פיזיולוגיה קולטי האור יונקים עשויה להיות שונה מזה של הלא-יונקים 10 ובמיוחד, בהקשר של ניוון רשתית תורשתי אנושי, הבנה טובה יותר של פיזיולוגיה קולטי האור יונקים היא מפתח לפיתוח טיפולים חדשניים. מודלים של עכברים רבים מחקה מחלות רשתית אנושיות זמינים אך מעט מאוד ידוע על 2 + Ca דינמיקה בקונוסים עכבר 11. טכניקות חשמל אינן מתאימות להקלטות תפוקה גבוהה מאצטרובלים, בפרט לא בעכברים, שבו מוטות (~ 97%) במספרם באופן משמעותי קונוסים (~ 3%) 12 </sעד&gt;. יתר על כן, טכניקות אלקטרו רגישות כגון הקלטות תיקון מהדק כל התא להפריע הסביבה תאית ולספק נתונים על Ca 2 + זרמים אבל לא על Ca 2 + ריכוזים תאיים מוחלטים. לפיכך, על אף ההחלטה הזמנית הנמוכה, הדמיה היא שיטת הבחירה כאשר פונים שאלות על קונוס דינמיקת Ca 2 +. הנושא המרכזי בהדמיה הוא איך לתייג באופן סלקטיבי את הקונוסים עם צבע מחוון ניאון Ca 2 +. מידור מתאים וספציפיות תא הוא קשה להשגה על ידי &quot;בתפזורת טעינה&quot; סינטטי Ca 2 + צבעי מחוון לתוך הרקמה. כתוצאה מכך, קונוסים שכותרת, מוטות 13,14, ותאי גליה מולר לא יכולים להיות מהימן מכובדים. כמו כן, צבעים סינטטיים נוטים לדלוף החוצה של התאים, מונעים הקלטות ממושכות בתנאים עקביים. יתר על כן, טוענים Ca 2 + אינדיקטורים סינטטיים בצורת AM-אסתר הוא בעייתי, כפי שהוא דורש דהtergents (למשל, DMSO), ויוצר פורמלדהיד 15. לCa 2 + מדידות מוחלטות, מדדי ratiometric הם חובה. עם זאת, מדד ratiometric הסינתטי זמין כרגע הטוב ביותר הפורע-2 דורשים עירור אור בטווח של 700-760 ננומטר (עירור שני פוטונים), אשר, בהתאם לעוצמתה, יכולה בעצמו לעורר את הקונוסים, ובכך לעכב את הלימודים של קונוס Ca 2 + דינמיקה בתנאי תאורה פיסיולוגיות. בניגוד לצבעים סינטטיים, יכולים לבוא לידי ביטוי Ca 2 + אינדיקטורים גנטי מקודדים באופן סלקטיבי סוג תא. הם לא ידלפו החוצה של תאים, ולכן, אם ההלבנה הוא נמנע, מדידות ratiometric ממושכות ואמינות הן אפשריות. תא סוג סלקטיבי ביטוי של 2 + חיישני Ca, בשילוב עם שני פוטונים במיקרוסקופ, מייצג כלי רב עוצמה כדי להעריך וללמוד subcellular Ca 2 + במידה רבה בתנאים פיסיולוגיים 13,16,17 </sup&gt;. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ללמוד חרוט עורר גירוי אור Ca 2 + דינמיקה בקו מהונדס Ca 2 + עכבר biosensor (HR2.1: TN-XL), המבטא את בסיס סריג Ca 2 + biosensor TN-XL 18 באופן סלקטיבי בקונוסים, תחת HR2.1 אמרגן opsin האדום האנושי 19. כדי לגשת למסופי קונוס, הכנת פרוסה לשעבר vivo 20 הועסקה. הפרוטוקול כבר בהצלחה בשימוש בשלושה מחקרים על תפקוד חרוט בעכברים בריאים 10,21,22. יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר לימוד Ca קונוס 2 + איתות תנאים גנטיים ספציפיים, למשל, על ידי הכלאת עכברי מודל לניוון רשתית תורשתי עם HR2.1: עכברי TN-XL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for tissue chopper</td>
			<td>MARTOR KG</td>
			<td>ARGENTAX No. 1044</td>
			<td>0.25 mm; http://www.martor.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AABG01300</td>
			<td>Filter type: 0.8 &#181;m; http://www.emdmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP</td>
			<td>CP pharma</td>
			<td>AP/DRUGS/220/96</td>
			<td><a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/green LED-based full-field stimulator</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>for details, see10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open source microprocessor board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software CfNT</td>
			<td>Custom-written</td>
			<td></td>
			<td>developed by Michael M&#252;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC3-4 System focal perfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instrument</td>
			<td></td>
			<td>with 100 &#956;m-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td>
			<td>Newport Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Movable objective microscope (MOM), 
			Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPlanFL 20x/0.95w objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer 100 series</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.surgivet.com/">http://www.surgivet.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Calcium salt</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I24222</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101191250</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ95</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

קולטני אור ברשתית קונוס (קונוסים) משרת חזון אור יום והם הבסיס של אפליית צבע. הם כפופים לניוון, לעתים קרובות מובילים לעיוורון בהרבה מחלות רשתית. סידן (Ca 2 +), שליח שני מפתח באיתות קולטי האור וחילוף חומרים, הוצע להיות מקושר באופן עקיף עם ניוון קולטי האור במודלים של בעלי חיים שונים. באופן שיטתי לומד היבטים של הפיסיולוגיה קונוס אלה והפתופיזיולוגיה כבר הקשתה על ידי הקשיים של חשמל הקלטה מהתאים הקטנים אלה, בפרט בעכבר שבו הרשתית הוא נשלט על ידי קולטני אור מוט. כדי לעקוף בעיה זו, הקמנו Ca 2 + פרוטוקול הדמיה שני פוטונים באמצעות קו עכבר מהונדס המבטא את Ca 2 + biosensor TN-XL מקודדים גנטי באופן בלעדי בקונוסים וניתן כלאים עם מודלים עכבר לניוון קולטי האור. הפרוטוקול המתואר כאן כרוך בהכנת חלקים אנכיים (R20; פרוסות &quot;) של רשתית מעכברים והדמיה אופטית של שינויים עוררי גירוי אור ברמת 2 + Ca קונוס. הפרוטוקול מאפשר גם &quot;מדידה ב- פרוסה&quot; של Ca 2 + ריכוזים מוחלטים; כפי שניתן אחרי ההקלטות של כיול. פרוטוקול זה מאפשר לימודים למאפייני קונוס פונקציונליים וצפוי לתרום להבנה של חרוט Ca 2 + איתות כמו גם המעורבות האפשרית של Ca 2 + במוות קולטי האור וניוון רשתית.

על ידי שילוב של פרוסות אנכיות (איור 1) שהוכן מHR2.1: רשתית עכבר TN-XL עם הדמיה שני פוטונים (איור 2), שהיינו מסוגל לבצע מדידות ratiometric של 2 + אותות Ca-עורר גירוי אור בסופי האקסון קולטי האור קונוס . גישה זו מהווה שיפור משמעותי בגישה חזותי קונוסים עכבר מעל שיטות הדמיה אופטיות קיימות מראש עם Ca 2 + אינדיקטורים סינטטיים. לדוגמא, ביטוי קונוס הספציפי של Ca ratiometric גנטית המקודד 2 + biosensor TN-XL הקל באופן משמעותי את זיהוי של מסופי האקסון קונוס (ראה ROIs באיור 3 א). לכן, הפרוטוקול שלנו מבטל את הסיכון של אותות הקלטה ממקור לא ברור, כלאותות דוגמא &quot;מעורבים&quot; עם תרומות משני מסופי חרוט והאקסון המוט. הגישה שלנו מאפשרת פתרון תגובות חד-משפט ברמה של indiviמסוף האקסון חרוט כפול. חול אור עורר של Ca 2 + ממסוף חרוט מסומן על ידי עלייה וירידה בתורם acceptor הקרינה, בהתאמה (איור 3). ירידה בשיעור הקרינה (R) תואמת את החול של Ca 2 + ממסוף קונוס (איור 3 ג), הנגרם על ידי hyperpolarization מושרה האור של קונוס והסגירה הבאה של ערוצי Ca 2 + מתח מגודרת. מאחר שניתן לנטר כמה סופי האקסון חרוט בו-זמנית (איור 3 א), רכישת נתונים היא יעילה מאוד ומאות התגובות 2 + קונוס Ca ניתן לאסוף בניסוי יחיד. על ידי הערכת תגובות אלה כמותית (איור 4), ניתן להשוות קונוס אותות Ca 2 + ומוערך בטווח של תנאים (ראה דיון). זה הוא לעתים קרובות מספיק כדי להשתמש ביחס בין סריג-acceptor (סיטרין) ו-donor הקרינה (ECFP)(F / F D; לפרטים, ראה 3.4) כאמצעי יחסי של Ca 2 + הרמה תאית. ובכל זאת, בכל פעם שיש צורך, היחס יכול להיות מכויל כדי להשיג Ca 2 + ריכוזים תאיים מוחלטים ([Ca 2 +]) (איור 5). בתאורת רקע שימוש בפרוטוקול זה (לפרטים, ראה 10 ואיור 3 אגדה), כיול הניב אומדן למוחלט נח בHR2.1 [Ca 2 +] &quot;wild-type&quot;: מסופי TN-XL קונוס העכבר של 243 ± 159 ננומטר (ממוצע ± סטיית תקן), שנמצא בטווח שדווח לעכברים בספרות 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> איור 1. הכנת פרוסות רשתית אנכית. () מבודד ושטח רשתית מוכנה לחיתוך. (ב) חתיכה מלבנית של רשתית (יםEE תיבה אדומה ב) רכוב על קרום נייר סינון (אפור כהה) לאחר חיתוך. (ג) צפה לראש של פרוסת רשתית רכוב קרום הקבוע על coverslip זכוכית באמצעות גריז. (ד) ציור סכמטי של חלק מפרוסת רשתית (ראה תיבה אדומה בC). קולטני אור חרוט מצוין בירוק. V הגחון,; D, גב; N, האף; T, זמני; מערכת הפעלה, קטע חיצוני; ONL, שכבה חיצונית גרעינית; OPL, שכבה חיצונית plexiform; INL, שכבת גרעין פנימית; IPL, שכבת plexiform פנימית; GCL, שכבת תא גנגליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> איור 2. שני פוטונים הדמיה של פרוסות רשתית: איור של תצורת ההקלטה למעלה:. עדשה אובייקטיבית מים טבילה התמקדות להיותבבוקר של לייזר הסריקה (חץ כלפי מטה אדום) לתוך הרשתית, ואיסוף הקרינה הנפלטת (חיצים כלפי מעלה). העדשה גם אוספת מועברת אור אינפרא אדום מLED תאורה רכוב מתחת למעבה כאשר הדמיה הפרוסה באמצעות מצלמת CCD מרכז:.. פרוסת רשתית רכובה בחדר ההקלטה וperfused עם פתרון תאי תחתונה: עדשת הקבל התמקדות האור מנוריות הגירוי (וLED אינפרא אדום עבור הדמיה מצלמת CCD) באמצעות התחתית השקופה של חדר ההקלטה לתוך רקמת הרשתית. IR LED, אינפרא אדום אור דיודה; CCD, מכשיר תשלום מצמידים; BP, להקה עוברת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> איור 3. אור-להעלות זכרונותתגובות 2 + D Ca במסופי האקסון של קולטני האור קונוס העכבר. (א) משמאל: הקלטות התמקדו במסופים הסינפטי (תיבה אדומה) של קולטני האור קונוס (ירוקה) בפרוסות רשתית ימנית:. דוגמא לאזור שהוקלט עם 7 מסופים בודדים. הקרינה נרשמה באמצעות שני ערוצים:. אחד לסיטרין סריג-acceptor (למעלה; 535 BP 50) ואחד לסריג-תורם ECFP (התחתון; 480 BP 32) (ב) שינויי אור עורר בסיטרין (F) וECFP הקרינה (F D) שנרשמה בהחזר על השקעה בודדת. התגובות (C) Ca 2 + (כיחס F / F D) של מסוף חרוט לסדרה של הבזקי אור בהירים 1 שניות במרווחים של 5 שניות. החזר על השקעה, אזור של עניין; BP, מסנן להקה עוברת; F, עוצמת הקרינה; au, יחידות שרירותיות; סריג, העברת אנרגיית תהודת פורסטר; ECFP, משופר חלבון פלואורסצנטי ציאן. עוצמת גירוי (כמו pשיעור hoto-isomerization ב 10 3 · P -1 לקונוס) · s:. 13.0 ו -12.8 לM- ו- S-opsins, בהתאמה, והוסיפו על רמת רקע (= נוריות כבויות, סריקת לייזר עירור) של ~ 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח כמותי של מופת תגובות Ca 2 + קונוס האור עורר () Ca 2 + תגובות אור עורר (כΔR) ממסוף חרוט יחיד (ניסויים בודדים: עקבות אפורות, n = 16; ממוצע:. עקבות שחורות ) (פרמטרי B) שנקבעו לתגובה הממוצעת Ca 2 +:. מנוחה Ca (בסיס R רמת 2+) המייצג את הבסיס לפני גירוי אור, גודל התגובה כarEA-תחת-עקום (R) ומשרעת שיא (מגבר R), קינטיקה של תחילת תגובה (עליית t, מרווח זמן בין 20% ל 80% ממגבר R) וקיזז (ריקבון לא, מרווח זמן בין 80% 20% ממגבר R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> איור 5. הערכת ריכוז Ca 2 + מוחלט. ריכוז 2 + המנוחה Ca ([Ca 2 +], כיחס F / F D) נרשם במסופי האקסון 8 חרוט בעכבר TN-XL (חוגים, עם ממוצע ± סטיית תקן) לפתרונות שונים תאיים: פעמיים במדיום תאי סטנדרטי (Ctrl 1 ו -2), ולאחר מכן עם מינימאלי (&quot;אפס&quot;) [Ca 2 +] (10 מ&quot;מ EGTA)ד עם (מ&quot;מ 2.5) [Ca 2 +] גבוה, שני התנאים האחרונים בנוכחות 5 מיקרומטר ionomycin לאזן Ca התאי ו תאי 2 +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina at JoVE.com

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.5K Views.  University of Tübingen.  אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר. 

Video: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

שימוש pHluorin כדי להעריך את הדינמיקה של קולטני הדרכה אקסון בתרבות התא בעובר אפרוח

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...