This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

<ol>
	<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration.</a> Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+is+activated+in+degenerating+photoreceptors+in+the+rd1+mouse.">Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse.</a> Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+cyclic+nucleotide+gated+(CNG)+channels+in+cGMP-related+retinitis+pigmentosa.">A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa.</a> Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).</li><li>Frasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rod+photoreceptor+rescue+by+a+calcium-channel+blocker+in+the+rd+mouse.">Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse.</a> Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).</li><li>Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+calcium+channel+blocker+diltiazem+on+photoreceptor+degeneration+in+the+rhodopsin+Pro213His+rat.">The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).</li><li>Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+photoreceptor+rescue+with+D-cis-diltiazem+in+the+rd+mouse.">Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+changes+in+outer+segment+free-Ca2++concentration+in+salamander+cone+photoreceptors.">Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors.</a> The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+light+intensity+by+the+cone+photoreceptor+synapse.">Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 48, 555-562 (2005).</li><li>Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+stores+in+vertebrate+photoreceptors.">Calcium stores in vertebrate photoreceptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+calcium+signals+in+mouse+cone+photoreceptors.">Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).</li><li>Johnson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2++dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses.">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells.">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290, 527-528 (1981).</li><li>Hendel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+reporter+of+synaptic+activity+in+vivo.">A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo.</a> Nature Methods. 6, 883-889 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+locus+control+region+adjacent+to+the+human+red+and+green+visual+pigment+genes.">A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes.</a> Neuron. 9, 429-440 (1992).</li><li>Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).</li><li>Baden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+retinal+domains:+near-optimal+sampling+of+achromatic+contrasts+in+natural+scenes+through+asymmetric+photoreceptor+distribution.">A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution.</a> Neuron. 80, 1206-1217 (2013).</li><li>Kemmler, R., Schultz, k., Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+cone+calcium+signals+by+different+horizontal+cell+feedback+mechanisms+in+the+mouse+retina.">Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).</li><li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.+Pflugers+Archive.">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive.</a> European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spikes+in+mammalian+bipolar+cells+support+temporal+layering+of+the+inner+retina.">Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina.</a> Current Biology. 23, 48-52 (2013).</li><li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina.">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+interactions+in+the+outer+retina.">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e488 (2013).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function.">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495 (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקולים קיימים מראש באמצעות הקלטות מתא בודד אלקטרו או Ca 2 + הדמיה עם אינדיקטורים ניאון סינטטיים להיאבק כדי להקליט את 2 + Ca הדינמיקה בקולטני אור קונוס עכבר למספר הסיבות טכניות (ראה מבוא). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר המדידה של Ca 2 + אותות ואפילו Ca 2 + רמות מוחלטות במסופים בודדים שנוצר על קונוס העכבר בדרך יעילה ופשוטה יחסית. פרוטוקול זה כבר שימש בהצלחה בשלושה מחקרים העוסקים בהיבטים שונים של תפקוד חרוט ברשתית עכבר בריאה. במחקר הראשון 10, HR2.1: עכבר TN-XL התאפיין באמצעות אימונוהיסטוכימיה, הקלטות ERG, שני פוטונים הדמיה Ca 2 +, ופרמקולוגיה, מראה כי ביטוי קונוס הספציפי של biosensor Ca 2 + לא להפריע האנטומיה חרוט ותפקוד. במחקר השני 21, כרומטיתומאפייני תגובה אכרומטית של קונוסים עכבר מופו על פני הרשתית, מדגימים הבדלים בולטים בתפקוד קונוס בין הגב-נשלט opsin &quot;הירוק&quot; והרשתית &quot;הכחולה&quot; הנשלט opsin הגחון העכבר. הבדלים האזוריים אלה בנכסי קונוס תאמו את חלוקת ניגוד ההפרש בסביבה הטבעית (כלומר, שמים לעומת קרקע), המצביעים על כך הסוגים השונים של קונוסים הרפאים עכבר לספק ל( ליד) דגימה אופטימלית של ניגודים אכרומטית ו, ובכך, עשויה להציע יתרון אבולוציוני. במחקר השלישי 22 המשוב ההדדי שסופי האקסון חרוט מקבלים מהתאים אופקיים נחקר. כפי שכל מנגנוני משוב תא אופקי הציעו לפעול במתח מגודרת 2 + ערוצי Ca בסופי האקסון קונוס 28, מסוף חרוט Ca 2 + יכול לשמש כמדד לאינטראקציות תא אל החרוט אופקיים. המחקר על ידי Kemmler ועמיתים לעבודת 22 תומכיםההשקפה שתאים אופקיים להשתמש במערכת משוב מורכבת הכוללת מספר מנגנונים לשלוט שחרור גלוטמט קולטי האור. מחקרים אלה ממחישים את הרבגוניות של הפרוטוקול המתואר ולהראות שזה יכול להיות מותאם למגוון רחב של שאלות הנוגעות פונקצית חרוט ומעגלים הסינפטי. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר ללמוד Ca 2 + איתות מקומית בתאי קונוס השונים, להבנה טובה יותר של הפיסיולוגיה קונוס. ידע כזה חשוב להבין תהליכי pathophysiological בקונוסים מנוונים, כדי לאפשר סופו של דבר לפיתוח רציונלים של גישות טיפוליות פוטנציאליות, במיוחד למחלות ניווניות המשפיעות על קונוסים. בHR2.1: קו עכבר TN-XL, biosensor Ca 2 + בא לידי ביטוי בכל חרוט, למעט הקטע החיצוני. זה מספק הזדמנות להערכה ישירה וratiometric של Ca 2 + דינמייםים בתאי קונוס שונים. מאז שינויים בCa 2 + זרמים במגזר החיצוני משתקפים במסופים באמצעות פוטנציאל הממברנה וההפעלה של ערוצי Ca 2 + מתח מגודרת וכתוצאה מכך, תהליכים בקטע החיצוני ניתן להבחין באופן עקיף. בעיות פוטנציאליות: הנתיחה של הרשתית היא שלב קריטי: בעכבר, הרשתית נפרדת מעיינית בדרך כלל בין מגזרים חיצוניים קולטי האור ואפיתל הפיגמנט. לכן, המגזרים החיצוניים קולטי האור רגיש לאור של הרשתית המבודדת חשופים ורגישים מאוד לפגיעות מכאניות. יש לנקוט בזהירות רבה שלא לפגוע על ידי נגיעה בצד קולטי האור עם כלים או על ידי הזזת הרקמות הצידה על משטח דבק (למשל, קרום מסנן). יכולות להיות מוכרות פרוסות רשתית באיכות גבוהה מתחת למיקרוסקופ על ידי משטח החיתוך הנקי שלהם ובשכבת קולטי האור מאורגנת היטב עם מגזרים חיצוניים ברורים. הערכה תפקודית של איכות פרוסה יכולה להיעשות במהירות על ידי מהבהב גירויי אור בהירים וקביעת אחוז קונוסים תגובה (לדוגמא, בשדה ראייה עם 10 - 20 קונוסים). הנה, איכות תגובה צריכה להיות מוערכת על ידי חישוב יחס אות לרעש (S / N) (משרעת של רעש בסיס לפני גירוי האור לעומת משרעת של תגובת האור); S / N של 2 - 3 צריך להיחשב כסף המינימאלי. בדרך כלל, אנחנו זורקים פרוסות עם קונוסים מגיבים פחות מ -50%. פרוס גם עם קונוסים המציגים מוגזמת התנהגות spiking הספונטני (ראה איור 4 ב 10) אמור להיות מושלכת. פרוסות בחדר ההקלטה שעומדות בקריטריונים אנטומיים ותפקודיים האמורים להראות תגובות עקביות ל1 - שעה 2 (לפרטים על עקביות תגובה, ראה 10). בגלל פרוסות לשרוד במשך שעותשלנו בתא מחזיק, ניסוי מוצלח יכול להימשך עד 6 שעות. ראוי לציין כי יש כמה הגבלות ביחס לחקר אינטראקציות מרחבי ארוכים הנעות בין קונוסים ותאים אופקיים, כמו חיתוך בהכרח מנתקת קשרי רוחב ברשתות רשתית. עם זאת, הגדלת העובי של פרוסות רשתית 300 מיקרומטר קילה נושא זה 22. השימוש בפרוסות רשתית אנכיות מונעת סריקה של מגזרים חיצוניים קונוס רגיש לאור על ידי לייזר העירור, ולכן, במידה רבה, מונעת הלבנת opsin (לדיון נרחב, לראות 10,21). עם זאת, Ca 2 + האותות נרשמו תלויים לא רק בגירויי האור, אלא גם לקבל מושפע רכיב תאורת רקע שנוצר על ידי לייזר עירור סריקה. למעשה, תאורת הרקע היעילה בניסויי הדמיה שני פוטונים כזה הוא שילוב של אור הלייזר מפוזר, אור הניאון הנפלט על ידי CE נרשםLLS, וכל רכיב רקע גירוי LED. לכן, יש לאפשר קונוסים להתאים לפחות 20 - 30 של לסריקת לייזר (עם רכיב הרקע של גירוי האור מופעלים) לפני ההקלטה. יתרונות ויישומים: בעוד כמה בקשות לקונוס זה Ca 2 + פרוטוקול -imaging תוארו לעיל 10,21,22, ניתן חזו יישומים אחרים: מחקרים פרמקולוגיים בשילוב עם חרוט הדמיה Ca 2 + עשוי לאמת Ca 2 + מסלולי איתות בקונוסים ויכולים להיות משמש לבדיקת יעילות ועצמה של תרופות המכוונות לשחקנים שונים בCa 2 + -signaling 10. עם זאת, יישום עשוי להיות מפתח ללמוד מחלות המשפיעות על תפקוד קונוס. מודלים עכבר ניוון רשתית רבים מחקה מחלות אנושיות זמינים. לדוגמא, העכבר (1 cpfl) הפסד קולטי האור חרוט 1 הוא סבל מודל ניוון חרוט עיקריממוטציה Pde6c 29. לעומת זאת, עכבר ניוון מוט 1 (RD 1) סובל ממוטציה Pde6b. אמנם זה גורם לניוון מוט העיקרי קולטי האור 30, ברגע שאובדן מוט RD 1 הושלם, ערכות ניוון חרוט המשניות ב 1. הכלאת החיות האלה עם HR2.1: קו TN-XL יאפשר לימוד והשוואת 2 + Ca דינמיקה בשני הניוון החרוט הראשוני והמשני ועשוי לספק תובנות רבות ערך לתפקיד של Ca 2 + במוות של תאים חרוט. כמו כן, פרמקולוגית מושרה ניוון קונוס - למשל באמצעות מעכבי PDE6 סלקטיבית - יכול לשמש כדי לזהות את המנגנונים במורד הזרם של 10,29,31 ניוון חרוט. לסיכום, הפרוטוקול מתואר כאן מאפשר מדידת Ca 2 + בתאי subcellular של קולטני האור קונוס העכבר ומציגה הזדמנויות גדולות לחשוף פיזיולוגיה קונוס תחת מגוון רחבתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש להקרנה של סוכנים תרופתיים שנועדו להפריע ל-signaling קונוס Ca 2 + ובכך לסייע להקמת טיפולים חדשים למחלות קונוס.

חזון מתחיל בהפעלה מושרה האור של מפל phototransduction בקולטני אור ברשתית. קולטני אור רוד מאפשר ראייה ברמות אור נמוכות, ואילו קולטני אור קונוס לתווך חזון אור צבע ורזולוציה גבוהה. גני קולטי האור ספציפי רבים רגישים למוטציות המובילות לניוון של תאים אלה. מספר הסמנים מולקולריים הקשורים באובדן קולטי האור זוהה 1, אך עד כה המנגנונים מולקולריים מפורטים ורצף אירועים לא ברורים. הומאוסטזיס שינה Ca 2 + היה העריך להיות הדק של מוות של תאי קולטי האור, השערה נתמכת על ידי עד-הסדרת הפעילות של Ca 2 + פרוטאזות -dependent calpain-הסוג במהלך 2,3 תהליך הניוון. עם זאת, נכון להיום, השערה זו אינה מגובה במדידות פיסיולוגיות של Ca 2 +. חוסר עקביות במספר מחקרים על ההשפעה של חוסמי הערוץ 2 + Ca מחדשמחלות tinal תיגר נוספת על המעורבות של Ca 2 + בתא המוות 4-6, קורא לשיטות להעריך ישירות Ca 2 + בקולטני אור קונוס יונקים. בעבר, רוב ההקלטה החשמלית ובדיקות ההדמיה Ca 2 + בוצעו בדגמים דו-חיים וזוחלים בגלל הגישה קלה יותר לקונוסים 7-9. עם זאת, פיזיולוגיה קולטי האור יונקים עשויה להיות שונה מזה של הלא-יונקים 10 ובמיוחד, בהקשר של ניוון רשתית תורשתי אנושי, הבנה טובה יותר של פיזיולוגיה קולטי האור יונקים היא מפתח לפיתוח טיפולים חדשניים. מודלים של עכברים רבים מחקה מחלות רשתית אנושיות זמינים אך מעט מאוד ידוע על 2 + Ca דינמיקה בקונוסים עכבר 11. טכניקות חשמל אינן מתאימות להקלטות תפוקה גבוהה מאצטרובלים, בפרט לא בעכברים, שבו מוטות (~ 97%) במספרם באופן משמעותי קונוסים (~ 3%) 12 </sעד&gt;. יתר על כן, טכניקות אלקטרו רגישות כגון הקלטות תיקון מהדק כל התא להפריע הסביבה תאית ולספק נתונים על Ca 2 + זרמים אבל לא על Ca 2 + ריכוזים תאיים מוחלטים. לפיכך, על אף ההחלטה הזמנית הנמוכה, הדמיה היא שיטת הבחירה כאשר פונים שאלות על קונוס דינמיקת Ca 2 +. הנושא המרכזי בהדמיה הוא איך לתייג באופן סלקטיבי את הקונוסים עם צבע מחוון ניאון Ca 2 +. מידור מתאים וספציפיות תא הוא קשה להשגה על ידי &quot;בתפזורת טעינה&quot; סינטטי Ca 2 + צבעי מחוון לתוך הרקמה. כתוצאה מכך, קונוסים שכותרת, מוטות 13,14, ותאי גליה מולר לא יכולים להיות מהימן מכובדים. כמו כן, צבעים סינטטיים נוטים לדלוף החוצה של התאים, מונעים הקלטות ממושכות בתנאים עקביים. יתר על כן, טוענים Ca 2 + אינדיקטורים סינטטיים בצורת AM-אסתר הוא בעייתי, כפי שהוא דורש דהtergents (למשל, DMSO), ויוצר פורמלדהיד 15. לCa 2 + מדידות מוחלטות, מדדי ratiometric הם חובה. עם זאת, מדד ratiometric הסינתטי זמין כרגע הטוב ביותר הפורע-2 דורשים עירור אור בטווח של 700-760 ננומטר (עירור שני פוטונים), אשר, בהתאם לעוצמתה, יכולה בעצמו לעורר את הקונוסים, ובכך לעכב את הלימודים של קונוס Ca 2 + דינמיקה בתנאי תאורה פיסיולוגיות. בניגוד לצבעים סינטטיים, יכולים לבוא לידי ביטוי Ca 2 + אינדיקטורים גנטי מקודדים באופן סלקטיבי סוג תא. הם לא ידלפו החוצה של תאים, ולכן, אם ההלבנה הוא נמנע, מדידות ratiometric ממושכות ואמינות הן אפשריות. תא סוג סלקטיבי ביטוי של 2 + חיישני Ca, בשילוב עם שני פוטונים במיקרוסקופ, מייצג כלי רב עוצמה כדי להעריך וללמוד subcellular Ca 2 + במידה רבה בתנאים פיסיולוגיים 13,16,17 </sup&gt;. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ללמוד חרוט עורר גירוי אור Ca 2 + דינמיקה בקו מהונדס Ca 2 + עכבר biosensor (HR2.1: TN-XL), המבטא את בסיס סריג Ca 2 + biosensor TN-XL 18 באופן סלקטיבי בקונוסים, תחת HR2.1 אמרגן opsin האדום האנושי 19. כדי לגשת למסופי קונוס, הכנת פרוסה לשעבר vivo 20 הועסקה. הפרוטוקול כבר בהצלחה בשימוש בשלושה מחקרים על תפקוד חרוט בעכברים בריאים 10,21,22. יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר לימוד Ca קונוס 2 + איתות תנאים גנטיים ספציפיים, למשל, על ידי הכלאת עכברי מודל לניוון רשתית תורשתי עם HR2.1: עכברי TN-XL.

<table><tbody><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/&quot;&gt;http://www.dowcorning.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>24 x 60 mm; 

&lt;a href=&quot;http://www.langenbrinck.com&quot;&gt;http://www.langenbrinck.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>76 x 26 mm; 
&lt;a href=&quot;http://www.langenbrinck.com&quot;&gt;http://www.langenbrinck.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Blades for tissue chopper</td><td>MARTOR KG</td><td>ARGENTAX No. 1044</td><td>0.25 mm; 

&lt;a href=&quot;http://www.martor.de&quot;&gt;http://www.martor.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tissue chopper</td><td>Custom-build</td><td></td><td>Based on a design by F. Werblin&lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt;, adapted by T. Schubert</td></tr><tr><td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td><td>Merck Millipore</td><td>AABG01300</td><td>Filter type: 0.8 &amp;micro;m;

&lt;a href=&quot;http://www.emdmillipore.com&quot;&gt;http://www.emdmillipore.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isoflurane CP</td><td>CP pharma</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cp-pharma.de/&quot;&gt;http://www.cp-pharma.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>UV/green LED-based full-field stimulator</td><td>Custom-build</td><td></td><td>for details, see&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Open source microprocessor board</td><td>Arduino</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.arduino.cc/&quot;&gt;http://www.arduino.cc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Imaging software CfNT</td><td>Custom-written</td><td></td><td>developed by Michael M&amp;uuml;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td></tr><tr><td>IgorPro</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wavemetrics.com/&quot;&gt;http://www.wavemetrics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>VC3-4 System focal perfusion system</td><td>ALA Scientific Instrument</td><td></td><td>with 100 &amp;mu;m-diameter tip manifold; 

&lt;a href=&quot;http://www.alascience.com/&quot;&gt;http://www.alascience.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.spectra-physics.com/&quot;&gt;http://www.spectra-physics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Movable objective microscope (MOM),&lt;br/&gt; Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html&quot;&gt;http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>XLUMPlanFL 20X/0.95w objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.olympusamerica.com/&quot;&gt;http://www.olympusamerica.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Vaporizer 100 series</td><td>Surgivet</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.surgivet.com/&quot;&gt;http://www.surgivet.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ionomycin, Calcium salt</td><td>Life technologies</td><td>I24222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;https://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101191250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Leica MZ95</td><td>leica microsystems</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.leica-microsystems.com/&quot;&gt;http://www.leica-microsystems.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

קולטני אור ברשתית קונוס (קונוסים) משרת חזון אור יום והם הבסיס של אפליית צבע. הם כפופים לניוון, לעתים קרובות מובילים לעיוורון בהרבה מחלות רשתית. סידן (Ca 2 +), שליח שני מפתח באיתות קולטי האור וחילוף חומרים, הוצע להיות מקושר באופן עקיף עם ניוון קולטי האור במודלים של בעלי חיים שונים. באופן שיטתי לומד היבטים של הפיסיולוגיה קונוס אלה והפתופיזיולוגיה כבר הקשתה על ידי הקשיים של חשמל הקלטה מהתאים הקטנים אלה, בפרט בעכבר שבו הרשתית הוא נשלט על ידי קולטני אור מוט. כדי לעקוף בעיה זו, הקמנו Ca 2 + פרוטוקול הדמיה שני פוטונים באמצעות קו עכבר מהונדס המבטא את Ca 2 + biosensor TN-XL מקודדים גנטי באופן בלעדי בקונוסים וניתן כלאים עם מודלים עכבר לניוון קולטי האור. הפרוטוקול המתואר כאן כרוך בהכנת חלקים אנכיים (R20; פרוסות &quot;) של רשתית מעכברים והדמיה אופטית של שינויים עוררי גירוי אור ברמת 2 + Ca קונוס. הפרוטוקול מאפשר גם &quot;מדידה ב- פרוסה&quot; של Ca 2 + ריכוזים מוחלטים; כפי שניתן אחרי ההקלטות של כיול. פרוטוקול זה מאפשר לימודים למאפייני קונוס פונקציונליים וצפוי לתרום להבנה של חרוט Ca 2 + איתות כמו גם המעורבות האפשרית של Ca 2 + במוות קולטי האור וניוון רשתית.

על ידי שילוב של פרוסות אנכיות (איור 1) שהוכן מHR2.1: רשתית עכבר TN-XL עם הדמיה שני פוטונים (איור 2), שהיינו מסוגל לבצע מדידות ratiometric של 2 + אותות Ca-עורר גירוי אור בסופי האקסון קולטי האור קונוס . גישה זו מהווה שיפור משמעותי בגישה חזותי קונוסים עכבר מעל שיטות הדמיה אופטיות קיימות מראש עם Ca 2 + אינדיקטורים סינטטיים. לדוגמא, ביטוי קונוס הספציפי של Ca ratiometric גנטית המקודד 2 + biosensor TN-XL הקל באופן משמעותי את זיהוי של מסופי האקסון קונוס (ראה ROIs באיור 3 א). לכן, הפרוטוקול שלנו מבטל את הסיכון של אותות הקלטה ממקור לא ברור, כלאותות דוגמא &quot;מעורבים&quot; עם תרומות משני מסופי חרוט והאקסון המוט. הגישה שלנו מאפשרת פתרון תגובות חד-משפט ברמה של indiviמסוף האקסון חרוט כפול. חול אור עורר של Ca 2 + ממסוף חרוט מסומן על ידי עלייה וירידה בתורם acceptor הקרינה, בהתאמה (איור 3). ירידה בשיעור הקרינה (R) תואמת את החול של Ca 2 + ממסוף קונוס (איור 3 ג), הנגרם על ידי hyperpolarization מושרה האור של קונוס והסגירה הבאה של ערוצי Ca 2 + מתח מגודרת. מאחר שניתן לנטר כמה סופי האקסון חרוט בו-זמנית (איור 3 א), רכישת נתונים היא יעילה מאוד ומאות התגובות 2 + קונוס Ca ניתן לאסוף בניסוי יחיד. על ידי הערכת תגובות אלה כמותית (איור 4), ניתן להשוות קונוס אותות Ca 2 + ומוערך בטווח של תנאים (ראה דיון). זה הוא לעתים קרובות מספיק כדי להשתמש ביחס בין סריג-acceptor (סיטרין) ו-donor הקרינה (ECFP)(F / F D; לפרטים, ראה 3.4) כאמצעי יחסי של Ca 2 + הרמה תאית. ובכל זאת, בכל פעם שיש צורך, היחס יכול להיות מכויל כדי להשיג Ca 2 + ריכוזים תאיים מוחלטים ([Ca 2 +]) (איור 5). בתאורת רקע שימוש בפרוטוקול זה (לפרטים, ראה 10 ואיור 3 אגדה), כיול הניב אומדן למוחלט נח בHR2.1 [Ca 2 +] &quot;wild-type&quot;: מסופי TN-XL קונוס העכבר של 243 ± 159 ננומטר (ממוצע ± סטיית תקן), שנמצא בטווח שדווח לעכברים בספרות 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> איור 1. הכנת פרוסות רשתית אנכית. () מבודד ושטח רשתית מוכנה לחיתוך. (ב) חתיכה מלבנית של רשתית (יםEE תיבה אדומה ב) רכוב על קרום נייר סינון (אפור כהה) לאחר חיתוך. (ג) צפה לראש של פרוסת רשתית רכוב קרום הקבוע על coverslip זכוכית באמצעות גריז. (ד) ציור סכמטי של חלק מפרוסת רשתית (ראה תיבה אדומה בC). קולטני אור חרוט מצוין בירוק. V הגחון,; D, גב; N, האף; T, זמני; מערכת הפעלה, קטע חיצוני; ONL, שכבה חיצונית גרעינית; OPL, שכבה חיצונית plexiform; INL, שכבת גרעין פנימית; IPL, שכבת plexiform פנימית; GCL, שכבת תא גנגליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> איור 2. שני פוטונים הדמיה של פרוסות רשתית: איור של תצורת ההקלטה למעלה:. עדשה אובייקטיבית מים טבילה התמקדות להיותבבוקר של לייזר הסריקה (חץ כלפי מטה אדום) לתוך הרשתית, ואיסוף הקרינה הנפלטת (חיצים כלפי מעלה). העדשה גם אוספת מועברת אור אינפרא אדום מLED תאורה רכוב מתחת למעבה כאשר הדמיה הפרוסה באמצעות מצלמת CCD מרכז:.. פרוסת רשתית רכובה בחדר ההקלטה וperfused עם פתרון תאי תחתונה: עדשת הקבל התמקדות האור מנוריות הגירוי (וLED אינפרא אדום עבור הדמיה מצלמת CCD) באמצעות התחתית השקופה של חדר ההקלטה לתוך רקמת הרשתית. IR LED, אינפרא אדום אור דיודה; CCD, מכשיר תשלום מצמידים; BP, להקה עוברת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> איור 3. אור-להעלות זכרונותתגובות 2 + D Ca במסופי האקסון של קולטני האור קונוס העכבר. (א) משמאל: הקלטות התמקדו במסופים הסינפטי (תיבה אדומה) של קולטני האור קונוס (ירוקה) בפרוסות רשתית ימנית:. דוגמא לאזור שהוקלט עם 7 מסופים בודדים. הקרינה נרשמה באמצעות שני ערוצים:. אחד לסיטרין סריג-acceptor (למעלה; 535 BP 50) ואחד לסריג-תורם ECFP (התחתון; 480 BP 32) (ב) שינויי אור עורר בסיטרין (F) וECFP הקרינה (F D) שנרשמה בהחזר על השקעה בודדת. התגובות (C) Ca 2 + (כיחס F / F D) של מסוף חרוט לסדרה של הבזקי אור בהירים 1 שניות במרווחים של 5 שניות. החזר על השקעה, אזור של עניין; BP, מסנן להקה עוברת; F, עוצמת הקרינה; au, יחידות שרירותיות; סריג, העברת אנרגיית תהודת פורסטר; ECFP, משופר חלבון פלואורסצנטי ציאן. עוצמת גירוי (כמו pשיעור hoto-isomerization ב 10 3 · P -1 לקונוס) · s:. 13.0 ו -12.8 לM- ו- S-opsins, בהתאמה, והוסיפו על רמת רקע (= נוריות כבויות, סריקת לייזר עירור) של ~ 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח כמותי של מופת תגובות Ca 2 + קונוס האור עורר () Ca 2 + תגובות אור עורר (כΔR) ממסוף חרוט יחיד (ניסויים בודדים: עקבות אפורות, n = 16; ממוצע:. עקבות שחורות ) (פרמטרי B) שנקבעו לתגובה הממוצעת Ca 2 +:. מנוחה Ca (בסיס R רמת 2+) המייצג את הבסיס לפני גירוי אור, גודל התגובה כarEA-תחת-עקום (R) ומשרעת שיא (מגבר R), קינטיקה של תחילת תגובה (עליית t, מרווח זמן בין 20% ל 80% ממגבר R) וקיזז (ריקבון לא, מרווח זמן בין 80% 20% ממגבר R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> איור 5. הערכת ריכוז Ca 2 + מוחלט. ריכוז 2 + המנוחה Ca ([Ca 2 +], כיחס F / F D) נרשם במסופי האקסון 8 חרוט בעכבר TN-XL (חוגים, עם ממוצע ± סטיית תקן) לפתרונות שונים תאיים: פעמיים במדיום תאי סטנדרטי (Ctrl 1 ו -2), ולאחר מכן עם מינימאלי (&quot;אפס&quot;) [Ca 2 +] (10 מ&quot;מ EGTA)ד עם (מ&quot;מ 2.5) [Ca 2 +] גבוה, שני התנאים האחרונים בנוכחות 5 מיקרומטר ionomycin לאזן Ca התאי ו תאי 2 +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina at JoVE.com

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.6K Views.  University of Tübingen.  אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר. 

Video: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

הדמיית סידן דו-פוטונית ורחבת שדה בקוליקולוס העליון

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

מחבר זרקור: חשיפת קידוד עצבי ומנגנונים של עיבוד חזותי בקוליקולוס העליון 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

ההדמיה Ca

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה