Name: imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina
Uploaded: 2015-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina at JoVE.com

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

Tutte le procedure di animali sono state effettuate rispettando le linee guida e le leggi per la protezione degli animali determinate dal governo federale tedesco e approvato dal comitato istituzionale il benessere degli animali dell&#39;Università di Tubinga. 1. Modelli animali <ol><li> HR2.1: TN-XL Ca 2+ topo biosensore <ol><li> Utilizzare il HR2.1 transgenico: linea di topi TN-XL che esprime il Ca 2+ biosensore TN-XL selettivamente nei fotorecettori cono 10. Utilizzare 3-6 settimane i topi di entrambi i sessi in rilievo con una 12 ore giorno / notte di ritmo normale. </li></ol></li></ol> 2. retina Dissection <ol><li> Soluzione fisiologica <ol><li> Preparare freschi 2 L di soluzione extracellulare, contenente 125 mM NaCl, KCl 2,5 mm, 1 mM MgCl 2, da 1,25 mm NaH 2 PO 4, NaHCO 26 mm 3, 0,5 mM L-glutammina, e 20 mm (+) glucosio. Mescolare fino a quando tutti gli ingredienti si dissolvono. </li><li> Soluzione extracellulare &quot;Bubble&quot;con carboxygen (95% O 2, 5% di CO 2) per 5 - 10 minuti. Aggiungere CaCl 2 per raggiungere una concentrazione di 2 mM. </li><li> Dopo gorgogliare la soluzione extracellulare, misurare il pH. Il pH deve essere 7,4, altrimenti è probabile che gli errori sono stati fatti durante la preparazione della soluzione. Mantenere spumeggiante votare e soluzione temperatura costante per tutto esperimento per garantire costante il pH. </li><li> Separare il brodo in 2 palloni, uno per la dissezione retina e uno per la messa a punto di registrazione (perfusione). </li></ol></li><li> Enucleazione dell&#39;occhio e l&#39;isolamento di retina (5 - 10 min) <ol><li> Mantenere una illuminazione rossa fioca nell&#39;area di lavoro per l&#39;enucleazione. Utilizzare LED con una lunghezza d&#39;onda di picco di 650 nm (o più) per evitare sbiancamento dei coni durante la dissezione. </li><li> Dark-adattare il mouse per 2 ore, mettendo la sua gabbia in un ben ventilata, scatola a tenuta di luce per garantire che i coni siano completamente sensibilizzati al momento della registrazione. </li><li> Anestetizzare il topo sotto un laboratocappa ry con isoflurano (5%) usando un vaporizzatore e un contenitore a tenuta di gas che contiene una gabbia mouse standard. Seguire attentamente le istruzioni del fabbricante quando si maneggia il vaporizzatore. Utilizzare guanti e maschera di protezione per ridurre l&#39;esposizione agli allergeni. </li><li> Utilizzare un microscopio binoculare con un 10 - ingrandimenti 40X per la dissezione. </li><li> Sacrifica il mouse anestetizzata per decapitazione. </li><li> Per l&#39;orientamento, segnare la parte superiore di ogni occhio (= dorsale) con una penna impermeabile. Tieni traccia di se con l&#39;occhio a sinistra oa destra. </li><li> Rimuovere l&#39;occhio con attenzione forbici curve tagliando il nervo ottico dietro il bulbo oculare. Per la dissezione, trasferire il bulbo oculare di una capsula di Petri contenente soluzione extracellulare appena carboxygenated. Per il trasferimento del bulbo oculare, tenerlo dal moncone del nervo ottico. </li><li> Perforare dell&#39;occhio in qualsiasi punto lungo il confine tra la cornea e la sclera (cioè, al serrata) con un ago per iniezione tagliente. </li><li> Tenere la postavoi alla sclera con un paio di pinze e delicatamente inserire uno Forbici nel foro praticato nel passaggio precedente. Tagliare lungo serrata per separare la parte anteriore dell&#39;occhio (cornea, cristallino, vitreo) dalla parte posteriore (oculare). Tagliare l&#39;oculare radialmente (verso il disco ottico) nella posizione del marchio penna per indicare la posizione supina sulla retina. Nota: Preparato in questo modo, le conchiglie oculari possono essere tenuti in soluzione continua carboxygenated per un uso successivo. </li><li> Girare l&#39;oculare nella scatola di Petri in modo tale che la dorsale tagliato punti di distanza da se stessi. Afferra la sclera sul lato destro della conchiglia oculare con un paio di pinze ogni sinistra e inserendo le punte pinze tra retina e sclera. </li><li> Staccare la retina invertendo delicatamente la parte sclerale della conchiglia oculare. Infine, tagliare il nervo ottico utilizzando micro sezionare forbici per liberare la retina dalla sclera. Nota: Questo è un passo fondamentale. Evitare danni alla retina (ad esempio,toccante e stringendolo con una pinza). </li><li> Tenere uno dei bordi della retina con un paio di pinze e delicatamente rimuovere i detriti e corpo vitreo dalla superficie retinica utilizzando un secondo paio di pinze. Quando la superficie della retina è pulita, utilizzare micro dissezione forbici per fare altre tre brevi, tagli radiali (circa ogni 90 °). Questi tagli permettono di appiattire accuratamente la retina con il lato rivolto verso il basso fotorecettori nella scatola di Petri (Figura 1A). </li></ol></li><li> Preparazione Slice (10 - 15 min) <ol><li> Preparare membrane filtranti di nitrocellulosa in anticipo per la retina di affettamento e vetro coperture scivola per il montaggio fette e trasferirli alla camera di registrazione. Tagliare membrana filtrante di nitrocellulosa in circa 10 x 5 millimetri di dimensioni pezzi rettangolari con le forbici. Tagliare coprioggetto in pezzi rettangolari di circa 10 x 5 mm di dimensioni con un tagliavetro. </li><li> Lentamente immergere un vetrino nella soluzione extracellulare vicino atissue. Delicatamente, tirare la retina sul vetrino con il lato di cellule gangliari da afferrandolo al limite con un paio di pinze. Questo processo riduce danni meccanici e la piegatura del tessuto. </li><li> Scegli la regione della retina che è legato alla rispettiva domanda di ricerca (si veda anche la discussione). Ricordate, il lungo taglio fatto nella fase 2.2.9 segna la metà della retina dorsale (Figura 1A). Tagliare a, circa 1 x 2 mm pezzo rettangolare di dimensioni fuori della regione retinica selezionato utilizzando un bisturi curvo. Rimuovere la soluzione in eccesso intorno al tessuto. </li><li> Posizionare la membrana del filtro sulla parte superiore del pezzo di retina tale che il lato cellule gangliari aderisce alla membrana. Immediatamente, aggiungere una goccia di mezzo extracellulare sulla membrana per fissare saldamente il tessuto alla membrana. </li><li> Trasferire il tessuto retinico montato membrana alla camera affettatura contenente soluzione fresca extracellulare. </li><li> Tagliate a fette retina verticali di 200 micronspessore (Figura 1B) usando una lama di rasoio fresco attaccato ad un chopper tessuti 23. Cambia lama per ogni pezzo della retina. Nota: La lama di rasoio deve essere perfettamente allineata con la superficie del fondo della camera di affettatura tale che tutta la membrana divide simultaneamente, come indicato da un &quot;clic&quot; suono durante il taglio - altrimenti la lama può piegare e danneggiare la fetta. </li><li> Incollare una sola fetta montato a membrana su un vetro di copertura antiscivolo applicando grasso alto vuoto alla membrana termina solo (Figura 1C). Mantenere la superficie del vetro sotto la retina privo di grasso. </li><li> Mantenere fette montato coprioggetto rivestiti da una goccia di soluzione extracellulare nella camera di tenuta - un contenitore chiuso a tenuta di luce e, ad esempio, una piastra di Petri con coperchio coperto con un foglio di alluminio - in atmosfera carboxygen a RT. Introdurre carboxygen facendo gorgogliare un piccolo serbatoio d&#39;acqua per mantenere l&#39;atmosfera nell&#39;aziendacamera umidificata; questo impedisce le fette si secchi. </li><li> Lasciare fette di riposare nella camera di tenuta per 10 - 15 minuti prima di loro (uno per uno) di passare alla camera di registrazione. Fette possono essere mantenuti fino a 4-5 ore in possesso camera alla RT (~ 21 ° C). </li></ol></li></ol> 3. a due fotoni Ca 2+ Imaging <ol><li> Microscopia a due fotoni <ol><li> Utilizzare un microscopio obiettivo mobile (MOM) tipo microscopio a due fotoni. Sono stati descritti sia nel design che di imaging procedure MOM in precedenza 24, per i dettagli vedere anche 10,21,25 (per le fonti e le imprese, vedi tabella 1). Nota: Ogni montante microscopio a due fotoni che soddisfi i seguenti requisiti minimi possono essere utilizzati: Deve essere dotato di (a) un laser pulsato sintonizzabile a ~ 860 nm, (b) almeno due canali di fluorescenza acquisiti contemporaneamente, (c ) Filtri per ECFP e citrino fluorescenza, (d)uno stimolatore di luce (per eventuali disegni, vedi 24,26), e (e) un software che consente di registrare le sequenze di immagini in tempo trascorso in un frame rate sufficiente a risolvere il Ca 2 + segnali di interesse. </li><li> Avviare il sistema di imaging due fotoni come indicato dal produttore. Rigorosamente seguire le linee guida di sicurezza del laser della struttura. Avviare il laser e sintonizzare a ~ 860 nm. </li><li> Trasferire una fetta da camera di tenuta alla camera di registrazione e iniziare immediatamente perfusione con soluzione extracellulare carboxygenated. Mantenere un flusso di perfusione di 2 ml / min e una temperatura di 37 ° C nella camera di registrazione. </li><li> Utilizzare un NA obiettivo 20X 0,95 immersione in acqua. Se disponibile, utilizzare una telecamera CCD in combinazione con un infrarossi LED sotto camera di registrazione per localizzare la fetta della retina (Figura 2). In caso contrario, individuare fetta con due fotoni di imaging (vedi 3.1.5). </li><li> Passare a due fotoni di imaging per visualizzare espressione biosensore. Accendii due canali di rilevazione per imaging di fluorescenza di ECFP e citrino. </li><li> Utilizzare il software di acquisizione di immagini che controlla il microscopio a due fotoni per la scansione e selezionare una riga di terminali conici per la registrazione (Figura 3A). Impostare l&#39;acquisizione di immagini a 128 x 16 pixel immagini (31.25 Hz) o una configurazione simile. Restringere area acquisita ai terminali conici per evitare lo sbiancamento di fotopigmenti in segmenti esterni. Nota: Per il sensore TN-XL calcio (τ = ~ 0,6 sec per Ca 2+ vincolante, τ = ~ 0,2 sec per Ca 2+ non vincolante; vedi 16) un frame rate minimo di ~ 8 Hz è raccomandato. </li></ol></li><li> Stimolazione della luce e la registrazione <ol><li> Utilizzare un sub-stage full-campo di luce stimolatore come descritto altrove 10,21,26 per eseguire le seguenti operazioni. Nota: una soluzione semplice per uno stimolatore di luce a tutto campo è quello di utilizzare due LED passa-banda-filtrati (per esempio, &quot;blu&quot;: 360 BP 12, &quot;verde&quot;: 578 BP 10)che corrispondono alle sensibilità di lunghezza d&#39;onda di coni di topo, ma allo stesso tempo non si sovrappongono con i filtri utilizzati per il rilevamento della fluorescenza (cfr. 3.2.4). La luce dei LED è focalizzata dal condensatore attraverso il fondo della camera di registrazione (Figura 2). Per i dettagli su questo disegno stimolatore, la taratura, le intensità di luce utilizzate e le tariffe cono foto-isomerizzazione evocati, vedere 10,21,26. </li><li> Accendere il laser e permettono coni di adattarsi al scansione laser e la luce dello stimolo di fondo (20 - 30 secondi, puoi anche potenziali insidie) prima di presentare stimoli luminosi (vedi 3.2.3) o l&#39;applicazione di agenti farmacologici. </li><li> Inizia presentazione di stimoli arbitrarie (es lampi di luce, come mostrato nella Figura 3B, C). Nel caso dello stimolatore descritto nel passaggio 3.2.1, generare gli stimoli modulando l&#39;intensità dei due LED nel tempo utilizzando una scheda a microprocessore controllato da software personalizzato (perdettagli, vedere 10,21,26). </li><li> Avviare la registrazione dei due canali di fluorescenza (ad esempio, a 483 nm per &quot;blue&quot; FRET-donatore ECFP e a 535 nm per &quot;giallo&quot; FRET-accettore,. Per specifiche vedi Tabella 1) contemporaneamente utilizzando il relativo software di acquisizione di immagini (vedi anche 3.1 .6). Ad esempio, nel caso di lampi di luce (Figura 3B, C), registrare almeno 8 - 10 presentazioni stimolo (prove). </li></ol></li><li> Ca 2+ calibrazione &quot;In-slice&quot; <ol><li> Record di Ca 2+ segnali nei terminali a cono (come descritto in 3.1.6 e 3.2.4) ed estrarre la linea di base Ca 2+ livello in una serie di coni (come descritto in 3.4). </li><li> Passare a &quot;Ca 2+ libero&quot; mezzo extracellulare con 5 micron ionomicina (sciolto in DMSO) e 10 mM EGTA (o, in alternativa, BAPTA) ha aggiunto. Terminali Record cono di nuovo ogni 5 minuti per determinare il rapporto di fluorescenza minima (R min), &lt;em&gt; cioè, il rapporto in (vicino) assenza di Ca2 + intracellulare. Questo può richiedere tra i 15 - 30 min. Nota: un sistema di perfusione è richiesto che consente il passaggio tra i diversi serbatoi. </li><li> Passare a mezzo extracellulare con 5 micron ionomicina (sciolto in DMSO) e Ca 2,5 mm 2 +. Dopo un tempo di incubazione di 5 minuti, coni registrare nuovamente ogni 5 min per misurare il rapporto di fluorescenza massima (R max), cioè il rapporto in presenza di saturare concentrazioni di Ca2 + intracellulare. Dopo l&#39;applicazione ionomicina, si può prendere tra 3-15 min per il rapporto Ca 2+ a diventare stabile. Nota: Esponendo le fette di alta Ca 2+ e ionomicina per un periodo più lungo finirà per danneggiare le cellule. Includere solo le cellule per l&#39;analisi che mantengono la loro morfologia normale. Concentrazioni (cioè, EGTA, ionomicina) potrebbero dover essere adattati. Per maggiori dettagli sulla calibrazione Ca 2+protocollo, vedere 13,17. </li></ol></li><li> Analisi dei dati Nota: utilizzare un software di elaborazione delle immagini e l&#39;analisi dei dati compatibile con il rispettivo software microscopio e in grado di eseguire script di analisi personalizzate. <ol><li> Caricare un file di dati di imaging e disegnare regioni di interesse (ROI) intorno ad ogni terminale cono (Figura 3A). Per ogni frame, intensità media di fluorescenza ai ROI e sottrarre fluorescenza di fondo, prima di calcolare il rapporto (R) tra FRET-accettore (citrino) e donatore (ECFP) fluorescenza (R = F A / F D; la figura 3B, C). Questo rapporto viene in genere utilizzato come proxy per il parente concentrazione intracellulare di Ca 2+, ma dopo la calibrazione (vedi 3.3), anche le concentrazioni assolute può essere stimato (vedi 3.4.3). Nota: I peduncoli sono riconoscibili dalla loro posizione nello strato plessiforme esterno e la loro morfologia (un po &#39;appiattito &quot;blob&quot; più piccolo rispetto al conosomata, situato all&#39;estremità dell&#39;assone cono). </li><li> Prove di stimolo medio (Figura 4A). Estrarre parametri di risposta da tracce medi (Figura 4B), come Ca 2+ livello di base (base R) prima stimolazione luminosa, ampiezza di picco (R amp), e l&#39;area sotto la curva (R A) le misure per la taglia risposta. Inoltre, estrarre la cinetica di reazione da tracce mediate, come aumento di risposta (t aumento) e tempo di decadimento (t decadimento) (= rispettivi intervalli di tempo tra il 20% e il 80% di R amp; vedi illustrazione nella Figura 4B). Per maggiori dettagli su come determinare questi parametri, vedere 10. </li><li> Calcola una stima del cono assoluto Ca 2+ concentrazione sulla base delle misurazioni da passaggi 3.3.1-3.3.3. Utilizzare i rapporti di minima e massima concentrazione Ca 2+, R e R max min, rispettivamente, la fluorescenza del donatore nel Ca 2+ </sup&gt; -bound (F D, Ca-bound) e -unbound (F D, Ca-libera) dello stato, nonché l&#39;in-vivo costante di dissociazione (K d = 0,77, vedere 16) per TN-XL con il seguente equazione (da analogico a 27): </li></ol></li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" />

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Protocolli pre-esistenti utilizzando registrazioni unicellulari elettrofisiologiche o Ca 2+ immagini con indicatori fluorescenti sintetici lottano per registrare i Ca 2+ dinamiche in fotorecettori coni del mouse per una serie di ragioni tecniche (vedi introduzione). Il protocollo qui descritto consente la misurazione di Ca 2+ segnali e persino assoluti Ca 2+ nei singoli livelli, terminali cono topo individuate in modo efficiente e relativamente semplice. Questo protocollo è già stato utilizzato con successo in tre studi affrontando diversi aspetti della funzione cono nel sano retina di topo. Nel primo studio 10, la HR2.1: Mouse TN-XL è stato caratterizzato con immunoistochimica, registrazioni ERG, a due fotoni Ca 2+ di imaging, e farmacologia, mostrando che la specifica espressione-cono del Ca 2+ biosensore non ostacola cono anatomia e la funzione. Nel secondo studio 21, cromaticae proprietà di risposta acromatici di coni di topo sono state mappate in tutta la retina, dimostrando notevoli differenze nella funzione cono tra dorsale opsina dominato &quot;verde&quot; e il &quot;blu&quot; ventrale del mouse retina opsina-dominato. Queste differenze regionali nelle proprietà cono abbinati alla distribuzione di contrasto differenziale in ambiente naturale (ad esempio, cielo contro terra), il che suggerisce che i diversi tipi spettrali di coni di topo prevedono (vicino) campionamento ottimale di contrasti acromatici e, quindi, può offrire un vantaggio evolutivo. Nel terzo studio 22 le valutazioni reciproche che i terminali cono assoni ricevono dalle cellule orizzontali è stata studiata. Come tutti i meccanismi di feedback cellula orizzontale proposte agiscono sul voltaggio-dipendenti Ca 2+ canali nei terminali cono assoni 28, terminale cono Ca 2+ può servire come un proxy per le interazioni orizzontali cellula-cono. Lo studio di Kemmler e collaboratori 22 supportil&#39;idea che cellule orizzontali utilizzano un sistema di feedback complesso composto da diversi meccanismi per controllare il rilascio di glutammato fotorecettori. Questi studi dimostrano la versatilità del protocollo descritto e mostrano che può essere adattato ad una vasta gamma di questioni relative al funzionamento cono e suoi circuiti sinaptici. Inoltre, il protocollo consente studiare locale Ca 2+ segnalazione nei vari compartimenti cono, ad una migliore comprensione della fisiologia cono. Tale conoscenza è importante per comprendere i processi fisiopatologici in coni degenerazione, per consentire eventualmente per lo sviluppo razionale di potenziali approcci terapeutici, in particolare per le malattie degenerative che colpiscono i coni. Nella HR2.1: linea di topi TN-XL, il Ca 2+ biosensore è espresso tutto il cono, con l&#39;eccezione del segmento esterno. Questo offre l&#39;opportunità per una valutazione diretta e raziometrica di Ca 2+ dinamicos in diversi scomparti cono. Poiché l&#39;evoluzione Ca 2+ correnti nel segmento esterno si riflettono in terminali con il potenziale di membrana e l&#39;attivazione risultante di Ca 2+ canali voltaggio-dipendenti, processi nel segmento esterno possono essere osservati indirettamente. Potenziali insidie: La dissezione della retina è un passaggio fondamentale: Nel topo, la retina si separa dalla oculare di solito tra i segmenti esterni dei fotorecettori e dell&#39;epitelio pigmentato. Pertanto, i segmenti esterni fotorecettori fotosensibile della retina isolata sono esposti ed estremamente resistenti ai danni meccanici. Grande attenzione deve essere presa non danneggiare toccando il lato fotorecettore con strumenti o spostando il tessuto lateralmente su una superficie adesiva (ad esempio, una membrana filtro). Fette retina di alta qualità può essere riconosciuto al microscopio per la loro superficie di taglio pulito eda uno strato fotorecettore ben organizzata con segmenti esterni chiaramente definiti. Valutazione funzionale di qualità fetta può essere rapidamente fatto lampeggiare stimoli luminosi luminosi e la determinazione della percentuale di coni sensibili (ad esempio, in un campo visivo con 10-20 coni). Qui, la qualità risposta dovrebbe essere valutata calcolando il rapporto segnale-rumore (S / N) (ampiezza del rumore di fondo prima della luce stimolo vs. ampiezza della risposta luce); un S / N di 2 - 3 dovrebbe essere considerato come la soglia minima. Tipicamente, scartiamo fette con meno del 50% coni sensibili. Seziona Anche con i coni che mostrano eccessivo comportamento chiodare spontanea (si veda la Figura 4 a 10) deve essere eliminata. Fette nella camera di registrazione che soddisfano i criteri anatomici e funzionali di cui sopra mostrano risposte coerenti per 1-2 ore (per i dettagli su consistenza di risposta, vedi 10). Perché fette sopravvivere per orela nostra in camera di tenuta, un esperimento riuscito può durare fino a 6 ore. È interessante notare che ci sono alcune restrizioni rispetto al studiando a lungo vanno interazioni spaziali tra coni e cellule orizzontali, come affettare separa inevitabilmente connessioni laterali nelle reti della retina. Tuttavia, aumentando lo spessore delle fette retina a 300 micron migliora questo problema 22. L&#39;uso di sezioni retiniche verticali evita la scansione di segmenti esterni cono fotosensibile dal laser di eccitazione e, pertanto, impedisce sostanzialmente opsin sbianca (per un&#39;ampia discussione, vedi 10,21). Tuttavia, le registrate Ca 2+ segnali non dipendono solo stimoli luminosi, ma anche ottenere colpite da un componente di illuminazione di fondo generato dal laser a scansione di eccitazione. Infatti, l&#39;efficace retroilluminazione in tali esperimenti di imaging a due fotoni è una combinazione di luce laser diffusa, luce fluorescente emessa dal ce registratalls, e qualsiasi componente di fondo stimolo LED. Pertanto, coni dovrebbero poter adattare per almeno 20 - 30 s a scansione laser (con la componente dello stimolo luce di sfondo accesa) prima della registrazione. Vantaggi e applicazioni: Mentre alcune applicazioni per questo cono Ca 2+ protocollo -Imaging sono state descritte in precedenza 10,21,22, altre applicazioni possono essere immaginato: Studi farmacologici in combinazione con cono Ca 2+ immagini possono convalidare Ca 2+ segnalazione percorsi in coni e potrebbe essere usato per testare l&#39;efficacia e la potenza di farmaci destinati diversi giocatori Ca 2+ -Segnalazione 10. Tuttavia, un&#39;applicazione chiave potrebbe essere quella di studiare le malattie che colpiscono la funzione cono. Molti modelli murini di degenerazione retinica che mimano malattie umane sono disponibili. Per esempio, la perdita di cono fotorecettore 1 (CPFL 1) mouse è un cono primario modello di degenerazione sofferenzada una mutazione Pde6c 29. Viceversa, l&#39;asta degenerazione 1 (rd 1) topo affetto da una mutazione Pde6b. Anche se questo fa sì che l&#39;asta principale fotorecettori degenerazione 30, una volta rd 1 sconfitta asta è completato, secondarie set cono degenerazione in 1. Incroci questi animali con la HR2.1: Linea TN-XL permetterà lo studio e il confronto Ca 2+ dinamica sia degenerazione cono primaria e secondaria e rischia di fornire preziose informazioni sul ruolo di Ca 2+ durante la morte delle cellule cono. Inoltre, farmacologicamente indotto cone degenerazione - ad esempio con gli inibitori selettivi della PDE6 - può servire a identificare i meccanismi a valle di cono degenerazione 10,29,31. In sintesi, il protocollo qui descritto permette di misurare Ca 2+ in compartimenti subcellulari di fotorecettori coni mouse e presenta grandi opportunità per scoprire cono fisiologia in una vasta gammadelle condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di agenti farmacologici volti a interferire con il cono di Ca 2+ -Segnalazione e quindi aiutare a stabilire nuove terapie per le malattie del cono.

Vision inizia con l&#39;attivazione-indotta luce della cascata fototrasduzione nei fotorecettori retinici. Bastoncelli consentono la visione a bassi livelli di luce, mentre fotorecettori cono mediano a colori e ad alta risoluzione visione diurna. Molti geni specifici fotorecettori sono suscettibili di mutazioni che portano alla degenerazione di queste cellule. Un certo numero di marcatori molecolari associati alla perdita dei fotorecettori sono stati identificati 1, ma finora i meccanismi molecolari dettagliate e la sequenza degli eventi rimangono poco chiari. Altered Ca 2+ omeostasi stato ipotizzato essere un trigger di morte cellulare dei fotorecettori, ipotesi sostenuta dalla up-regolazione dell&#39;attività di Ca 2+ -dipendente proteasi calpaina tipo durante il processo di degenerazione 2,3. Tuttavia, ad oggi, questa ipotesi non è sostenuta da misure fisiologiche di Ca 2+. Incongruenze in diversi studi sugli effetti di Ca 2+ bloccanti dei canali in remalattie fonodale sfidato ulteriormente il coinvolgimento di Ca 2+ nella morte cellulare 4-6, chiedendo metodi per valutare direttamente Ca 2+ nei fotorecettori cono mammiferi. In precedenza, la maggior parte registrazione elettrica e studi di imaging Ca 2+ sono stati condotti in modelli di anfibi e rettili a causa del più facile accesso ai coni 7-9. Tuttavia, mammiferi fotorecettori fisiologia può essere diversa da quella dei non mammiferi 10 e in particolare, nel contesto di degenerazione retinica ereditaria umana, una migliore comprensione della fisiologia dei mammiferi fotorecettore è una chiave per lo sviluppo di terapie innovative. Molti modelli murini che mimano malattie retiniche umane sono disponibili, ma poco si sa su Ca 2+ dinamiche nei coni di topo 11. Tecniche elettrici non sono adatti per le registrazioni ad alto rendimento da coni, in particolare, non nei topi, dove aste (~ 97%) superano significativamente coni (~ 3%) 12 </sup&gt;. Inoltre, tecniche elettrofisiologiche sensibili come whole-cell patch-clamp disturbano l&#39;ambiente intracellulare e di fornire i dati relativi Ca 2+ correnti, ma non in assoluto intracellulare Ca 2 + concentrazioni. Quindi, nonostante la risoluzione temporale inferiore, l&#39;imaging è il metodo di scelta nel trattamento delle problematiche circa cono Ca 2+ dinamiche. La questione chiave con imaging è come etichettare in modo selettivo i coni con un Ca 2+ colorante indicatore fluorescente. Compartimentazione corretta e la specificità delle cellule è difficile da raggiungere entro il &quot;bulk-loading&quot; sintetico Ca 2+ indicatore coloranti nel tessuto. Di conseguenza, coni etichettati, aste 13,14, e le cellule gliali Müller non possono essere distinti in modo affidabile. Inoltre, coloranti sintetici tendono a fuoriuscire delle cellule, impedendo registrazioni prolungato in condizioni costanti. Inoltre, il caricamento sintetiche Ca 2+ indicatori nella loro forma AM-estere è problematico, in quanto richiede detergents (ad esempio, DMSO) e genera formaldeide 15. Per assoluti Ca 2+ misurazioni, indicatori raziometrico sono obbligatori. Tuttavia, il miglior indicatore raziometrica sintetico disponibile Fura-2 richiede luce di eccitazione nell&#39;intervallo da 700 a 760 nm (per eccitazione a due fotoni), che, a seconda della sua intensità, può di per sé stimolare i coni, e quindi impediscono studi cono di Ca 2+ dinamica in condizioni di illuminazione fisiologiche. A differenza di coloranti sintetici, geneticamente codificati Ca 2+ indicatori possono essere espressi in un tipo selettivo cellule maniera. Essi non fuoriuscire di cellule, e quindi, se si evita candeggio, misurazioni raziometrico prolungate e affidabili sono possibili. Tipo selettivo cellulare espressione di Ca 2+ biosensori, in combinazione con la microscopia a due fotoni, rappresenta un potente strumento per valutare e studiare subcellulare Ca 2+ in condizioni in gran parte fisiologiche 13,16,17 </sup&gt;. Qui, descriviamo un protocollo per studiare la luce stimolo-evocato cono di Ca 2+ dinamiche in un transgenico Ca 2+ topo biosensore linea (HR2.1: TN-XL), che esprime la base FRET-Ca 2+ biosensore TN-XL 18 selettivamente in coni, sotto l&#39;umano opsina rosso promotore HR2.1 19. Per accedere ai morsetti del cono, una preparazione fetta ex-vivo 20 è stato impiegato. Il protocollo è stato già utilizzato con successo in tre studi sulla funzione cono in topi sani 10,21,22. Inoltre, il protocollo consente di studiare cono Ca 2 + Segnalazione di condizioni genetiche specifiche, ad esempio, incrociando modelli murini di degenerazione retinica ereditaria con HR2.1: topi TN-XL.

<table><tbody><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/&quot;&gt;http://www.dowcorning.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>24 x 60 mm; 

&lt;a href=&quot;http://www.langenbrinck.com&quot;&gt;http://www.langenbrinck.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>76 x 26 mm; 
&lt;a href=&quot;http://www.langenbrinck.com&quot;&gt;http://www.langenbrinck.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Blades for tissue chopper</td><td>MARTOR KG</td><td>ARGENTAX No. 1044</td><td>0.25 mm; 

&lt;a href=&quot;http://www.martor.de&quot;&gt;http://www.martor.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tissue chopper</td><td>Custom-build</td><td></td><td>Based on a design by F. Werblin&lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt;, adapted by T. Schubert</td></tr><tr><td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td><td>Merck Millipore</td><td>AABG01300</td><td>Filter type: 0.8 &amp;micro;m;

&lt;a href=&quot;http://www.emdmillipore.com&quot;&gt;http://www.emdmillipore.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isoflurane CP</td><td>CP pharma</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cp-pharma.de/&quot;&gt;http://www.cp-pharma.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>UV/green LED-based full-field stimulator</td><td>Custom-build</td><td></td><td>for details, see&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Open source microprocessor board</td><td>Arduino</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.arduino.cc/&quot;&gt;http://www.arduino.cc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Imaging software CfNT</td><td>Custom-written</td><td></td><td>developed by Michael M&amp;uuml;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td></tr><tr><td>IgorPro</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wavemetrics.com/&quot;&gt;http://www.wavemetrics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>VC3-4 System focal perfusion system</td><td>ALA Scientific Instrument</td><td></td><td>with 100 &amp;mu;m-diameter tip manifold; 

&lt;a href=&quot;http://www.alascience.com/&quot;&gt;http://www.alascience.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.spectra-physics.com/&quot;&gt;http://www.spectra-physics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Movable objective microscope (MOM),&lt;br/&gt; Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html&quot;&gt;http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>XLUMPlanFL 20X/0.95w objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.olympusamerica.com/&quot;&gt;http://www.olympusamerica.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Vaporizer 100 series</td><td>Surgivet</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.surgivet.com/&quot;&gt;http://www.surgivet.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ionomycin, Calcium salt</td><td>Life technologies</td><td>I24222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;https://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101191250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Leica MZ95</td><td>leica microsystems</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.leica-microsystems.com/&quot;&gt;http://www.leica-microsystems.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

Fotorecettori cono della retina (coni) servono visione diurna e sono alla base della discriminazione dei colori. Le tariffe sono soggette alla degenerazione, spesso porta alla cecità in molte malattie della retina. Il calcio (Ca 2+), una chiave secondo messaggero nella segnalazione fotorecettori e il metabolismo, è stato proposto di essere indirettamente collegata con fotorecettori degenerazione in vari modelli animali. Sistematicamente studiare questi aspetti del cono fisiologia e fisiopatologia è stata ostacolata dalla difficoltà di registrazione elettricamente da queste piccole cellule, in particolare nel topo in cui la retina è dominato da bastoncelli. Per aggirare questo problema, abbiamo stabilito un Ca 2 + protocollo di imaging a due fotoni con una linea di topo transgenico che esprime il geneticamente codificato Ca 2+ biosensore TN-XL esclusivamente in coni e possono essere incrociati con modelli murini per fotorecettori degenerazione. Il protocollo qui descritto prevede la preparazione di sezioni verticali (R20; fette &quot;) di retine di topi e imaging ottico dei cambiamenti di stimolo-evocati leggeri nel cono Ca 2+ livello. Il protocollo consente inoltre &quot;misurare nel fetta&quot; di assoluto Ca 2 + concentrazioni; come le registrazioni possono essere seguiti mediante calibrazione. Questo protocollo consente studi in proprietà cono funzionali e dovrebbe contribuire alla comprensione del cono Ca 2+ segnalazione nonché il potenziale coinvolgimento di Ca 2+ in fotorecettori morte e degenerazione retinica.

Combinando fette verticali (Figura 1) preparato da HR2.1: TN-XL retina di topo con due fotoni di imaging (figura 2), siamo stati in grado di effettuare misurazioni raziometriche di luce Ca 2+ segnali di stimolo-evocati in terminali degli assoni cono fotorecettori . Questo approccio rappresenta un significativo miglioramento per l&#39;accesso e la visualizzazione di coni del mouse rispetto ai metodi di imaging ottico preesistenti con sintetici di Ca 2+ indicatori. Per esempio, l&#39;espressione specifica cono del Ca raziometrico geneticamente codificato 2+ biosensore TN-XL notevolmente facilitato l&#39;individuazione dei terminali cono assoni (vedi ROI in Figura 3A). Pertanto, il nostro protocollo elimina il rischio di segnali di registrazione di origine poco chiara, come ad esempio segnali &quot;misti&quot; con il contributo di entrambi i terminali di cono e rod assoni. Il nostro approccio permette risolvere risposte singola prova a livello della indiviterminali di doppio cono assoni. Light-evocato estrusione di Ca 2+ dal terminale cono è caratterizzato da un aumento e una diminuzione del donatore e accettore di fluorescenza, rispettivamente (Figura 3B). Diminuzione rapporto di fluorescenza (R) corrisponde alla estrusione di Ca 2+ dal terminale cono (Figura 3C), causata dalla iperpolarizzazione indotta dalla luce del cono e successiva chiusura di Ca 2+ canali voltaggio-dipendenti. Poiché diversi terminali cono assoni possono essere monitorati contemporaneamente (figura 3A), l&#39;acquisizione dei dati è molto efficiente e centinaia di cono Ca 2+ risposte possono essere raccolte in un singolo esperimento. Valutando queste risposte quantitativamente (figura 4), ​​cono Ca 2 + segnali possono essere confrontati e valutati in una serie di condizioni (vedi la discussione). Spesso è sufficiente utilizzare il rapporto tra FRET-accettore (citrino) e -donor (ECFP) fluorescenza(F A / F D; per i dettagli, vedi 3.4) come una misura relativa della intracellulare Ca 2 + livello. Tuttavia, se necessario, il rapporto può essere calibrato per ottenere assoluti intracellulare Ca 2+ concentrazioni ([Ca 2+]) (Figura 5). Al retroilluminazione utilizzata in questo protocollo (per i dettagli, vedere la 10 e la figura 3 leggenda), calibrazione ha prodotto una stima di assoluto riposo [Ca 2+] nel &quot;wild-type&quot; HR2.1: TN-XL terminali cono del mouse su 243 ± 159 nM (media ± SD), che è entro il range riportato per topi in letteratura 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione di fette retina verticali. (A) isolato e appiattito retina preparato per affettare. (B) pezzo rettangolare di retina (see riquadro rosso in A) montato su membrana di carta da filtro (grigio scuro) dopo il taglio. (C) Vista dall&#39;alto della fetta della retina montato membrana fissato su un vetrino di vetro con grasso. (D) Schema di una parte di una fetta della retina (vedi riquadro rosso in C). Fotorecettori cono sono indicate in verde. V, ventrale; D, dorsale; N, nasale; T, temporali; OS, segmento esterno; ONL, strato nucleare esterno; OPL strato plessiforme esterno; INL, strato nucleare interno; IPL, strato plessiforme interno; GCL, strato di cellule gangliari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> Figura 2. due fotoni di imaging di fette della retina: Illustrazione della configurazione di registrazione Top:. L&#39;acqua-immersion lente dell&#39;obiettivo focalizzando l&#39;esseream del laser a scansione (freccia rossa verso il basso) nella retina, e raccogliendo la fluorescenza emessa (frecce verso l&#39;alto). L&#39;obiettivo raccoglie anche trasmessa luce infrarossa da un LED di illuminazione montato sotto il condensatore quando l&#39;imaging la fetta con una camera CCD Center.. Fetta della retina montato nella camera di registrazione e perfusi con soluzione extracellulare basso: condensatore ottico focalizzare la luce dei LED di stimolazione (e il LED a infrarossi per l&#39;imaging CCD) attraverso il fondo trasparente della camera di registrazione nel tessuto retinico. IR LED, infrarossi diodi emettitori di luce; CCD, dispositivo ad accoppiamento di carica; BP, passa-banda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> Figura 3. Light-EVOKEd Ca 2+ risposte in terminali degli assoni dei fotorecettori cono del mouse. (A) a sinistra: Recordings focalizzata sui terminali sinaptici (box rosso) di fotorecettori cono (verde) in fettine di retina. A destra: Esempio per una regione registrato con 7 terminali individuali. La fluorescenza è stato registrato utilizzando due canali:. Uno per il citrino FRET-accettore (top; 535 BP 50) e una per il FRET-donatore ECFP (in basso; 480 BP 32) (B) cambiamenti luminosi evocati in citrino (F A) e ECFP (F D) fluorescenza registrata in un unico ROI. (C) Ca 2+ risposte (come rapporto F A / F D) di un terminale cono ad una serie di 1 sec brillanti lampi di luce in intervalli di 5 sec. ROI, regione di interesse; BP, filtro passa-banda; F, intensità di fluorescenza; au, unità arbitrarie; FRET, Förster trasferimento di energia di risonanza; ECFP, migliorato proteina fluorescente ciano. Intensità dello stimolo (come ptasso hoto-isomerizzazione in 10 3 · P · s -1 per cono):. 13.0 e 12.8 per M- e S-opsine, rispettivamente, aggiungendo su un livello di fondo (= LED spenti, scansione laser eccitazione) di ~ 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi analisi quantitativa del cono di luce evocata Ca 2+ risposte (A) Luce-evocato Ca 2+ risposte (come ΔR) da un unico terminale cono (prove singole: tracce grigie, n = 16; media:. Traccia nera ) (b) i parametri stabiliti per la media di Ca 2+ risposta:. riposo Ca 2+ livello (base R), che rappresenta la linea di base prima di stimolazione luminosa, dimensioni della risposta come area-under-the-curva (R A) e ampiezza di picco (R amp), cinetica della risposta insorgenza (t luogo, intervallo di tempo dal 20% al 80% di R amp) e offset (t decadimento, l&#39;intervallo di tempo da 80% al 20% di R amp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> Figura 5. Stima assoluta concentrazione di Ca 2+. Riposo Ca 2+ concentrazione ([Ca 2+], come rapporto F A / F D) registrato nel terminali degli assoni 8 cono in un mouse TN-XL (cerchi, con media ± DS) per diverse soluzioni extracellulari: due volte in mezzo extracellulare normale (Ctrl 1 e 2), quindi con il minimo (&quot;zero&quot;) [Ca 2+] (EGTA 10 mM) und con alta [Ca 2+] (2,5 mm), le ultime due condizioni in presenza di 5 micron ionomicina per equilibrare extracellulare e intracellulare di Ca 2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Descriviamo un protocollo per il monitoraggio Ca 2+ dinamiche nei terminali degli assoni dei fotorecettori cono con un ex-vivo la preparazione fetta della retina del mouse. Questo protocollo permette studi completi di cono Ca 2 + Segnalazione di un importante sistema modello mammiferi, il mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.7K Views.  University of Tübingen.  Descriviamo un protocollo per il monitoraggio Ca 2+ dinamiche nei terminali degli assoni dei fotorecettori cono con un ex-vivo la preparazione fetta della retina del mouse. Questo protocollo permette studi completi di cono Ca 2 + Segnalazione di un importante sistema modello mammiferi, il mouse. 

Video: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Ricerca

Neuroscienze

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Imaging a due fotoni e calcio ad ampio campo nel collicolo superiore

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autore in primo piano: Svelare la codifica neurale e i meccanismi di elaborazione visiva nel collicolo superiore 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Imaging Ca

Riepilogo

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Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo