هذا الاتصال هو استناداً إلى النتائج التي سبق نشرها في "مجلة علم الفيروسات"17 في وضع الوصول المفتوح بموجب "الإبداعي لجنة إسناد الترخيص" (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) مع "بيوميد المركزية" المرخص له. الاعتراف المؤلفين مع الامتنان بالتعاون المثمر في الإطار تجريب الدراسة "المخدرات والأمراض المزمنة المعدية" ("دراسة دراك") مع ماركوس U. ووكر تساي تشانغ جورج ر. زيمرمان من روبرت كوخ-المعهد (برلين، ألمانيا) و شاكرون ميرير س. لأخذ الصور الفوتوغرافية المجتمعة في الشكل 1 ، وكذلك فيما يتعلق بدال واو ويبرو "، دكتوراه"، (غوتنغن، ألمانيا) لتصحيح المخطوطة. كما يعربون عن تقديرهم للمساعدة التقنية الماهرة ل J. أكرمان، بايرامباسي هاء-، U. Büttner، س. دزيوبيك، جاكوبس أولاً، كريلينبيرج باء، كروهن H.، كوسيمسكي ص، ميتكالف ألف، بيك جيه، سار س. م. Schröter وسيدل ك. كان يؤيد هذه الدراسة جزئيا بمنحه من وزارة الصحة إلى "المركز المرجعي الوطني" الألماني لالتهاب الكبد جيم

منذ البروتوكول صمم للاستخدام في التشخيص الطبي، يجب أن تتبع تطبيق مبادئ "إعلان هلسنكي"19. في الجزء الأول من النتائج المعروضة في هذا البلاغ، كلا من اتفاق منفصل بالمرضى وموافقة لجنة أخلاقيات يبدو أن يمكن الاستغناء عنها لسببين: (1) "عند دخول" إلى مستشفى جامعة أسن، "يوفر كل مريض موافقة خطية لجميع التحقيقات اللازمة بالكيمياء الحيوية والبكتريولوجية والفيروسية. " 17 (2) "جميع العينات المستخدمة في تقييم الاختبار DBS أرسلت إلى معهد علم الفيروسات عملية التشخيص السريري الروتيني. وهكذا، أيا من العينات تم جمعها خصيصا لغرض الدراسة وأنجز لم فينيبونكتوري إضافية واحدة وأي من المواد التي تم اختبارها لأي معلمة غير تلك التي يطلبها الأطباء أثناء العادي عمل التشخيص إلى أعلى. " 17 تمت الموافقة على الدراسة "المخدرات والأمراض المزمنة المعدية" (دراسة دراك ")18، اختبار DBS أخيرا استخدمت فيها في المدن الألمانية في برلين واسن لتقييم الأشخاص الذين حقن المخدرات، بنشاط بالمفوض الاتحادي للبيانات حماية وحرية المعلومات (برلين، ألمانيا)، وكذلك كلجنة الأخلاقيات التابعة "مستشفى الشارتي الجامعة الطبية"، (برلين، ألمانيا).
1-جمع الدم
<ol><li>فينيبونكتوري14، 15، 20، 21<ol>
<li>وضع قفازات مطاطية مطاط يمكن التخلص منها، وتنظيف منطقة الموقع المقصود ثقب (يفضل أن يكون ذلك متوسط المرفقي الوريد في الحفرة المرفقية) مع مطهر مناسب، مثلاً، وكحول الأيزوبروبيل 70%.</li>
		<li>تطبيق عاصبة من 4 – 6 بوصات فوق موقع ثقب المفترضة انتفخ الأوردة. توجيه الإبرة الوريد المريض، ومرة واحدة في المكان، بلطف ملء أنبوب الدم متصلاً، الذي يحتوي على يدتا تخثر الدم.</li>
		<li>بمجرد اكتمال فينيبونكتوري، الإفراج عن عاصبة وسحب الإبرة. ثم، اضغط وسادة شاش جافة على موقع الثقب، وبعد ذلك يمكن أن يعقد في المكان قبل ضمادة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ثقب الجلد (الشكل 1A)13-15، 20، 22، 23<ol>
<li>وضع على زوج من القفازات المطاطية مطاط يمكن التخلص منها.</li>
		<li>قبل ثقب الجلد، وينبغي أن الحارة المريض صفحته/صفحتها اليدين. الإصبع هو تدليك أنتيروجراديلي إثراء تدفق الدم نحو لموقع الثقب.</li>
		<li>تنظيف جلد الجانب المار من الأنصار القاصي طرف الإصبع الثالثة أو الرابعة من الجهة غير الكتابة بمطهر مناسب، مثلاً، وكحول الأيزوبروبيل 70%. ثقب الجلد بمجلة لانسيت سلامة تستخدم مرة واحدة. تعقد في مثل هذا موقف أن خطورة ويسهل جمع الدم في الإصبع الإصبع.</li>
		<li>عند الانتهاء من جمع الدم الشعرية بثقب الجلد، ضع ضمادة على طرف أصبعك.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-إعداد بقع الدم
<ol><li>إعداد من الدم التي تجمعها فينيبونكتوري15<ol>
<li>بقعة الدم الوريدي كاملة مع (يدتا) تخثره مكافحة المجمعة على بطاقات تصفية أقرب. تعد بقع الدم المجفف أكثر من 24 ساعة بعد فينيبونكتوري.</li>
		<li>وضع كل المعلومات اللازمة للتعرف على المريض على بطاقة عامل التصفية. وينبغي أن رصدت بطاقة واحدة فقط مع دم شخص واحد.</li>
		<li>وضع قفازات مطاطية مطاط يمكن التخلص منها.</li>
		<li>برفق عكس أنابيب جمع الدم 2 – 4 مرات، وفي وقت لاحق فتح السدادة بعناية.</li>
		<li>نضح 50 ميليلتر من الدم الوريدي كله باستخدام ماصة مع تلميح المتاح. نقل الدم إلى مركز دائرة واحدة دون لمس الورقة عامل التصفية مباشرة مع تلميح الماصة. حاول أن تشبع تماما الدائرة.</li>
		<li>كرر هذا الإجراء لملء جميع الدوائر المطلوبة للبطاقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>جمع إعداد من الدم بالجلد ثقب (الأرقام 1 باء و جيم 1)13-16، 23<ol>
<li>تمحو أول قطره دم مع وسادة شاش لأنها قد تحتوي على سوائل الأنسجة الزائدة. تدليك الإصبع مرة أخرى لزيادة تدفق الدم في موقع الثقب. نقل القطرة التالية إلى إحدى دوائر بطاقة عامل التصفية دون ملامسة مباشرة مع الإصبع. السماح بالدم لتكون غارقة في نسيج التصفية قوات الشعرية فقط.</li>
		<li>واسمحوا الانخفاض الكبير القادم من شكل الدم الشعرية على طرف أصبعك وأنه جمع في الدائرة القادمة. متابعة هذا الإجراء حتى يتم ملء جميع الدوائر اللازمة أو توقف تدفق الدم.</li>
		<li>لا الضغط أو "الحليب" الإصبع مفرطة إذا كان تدفق الدم غير كافية لملء جميع دوائر بطاقة عامل التصفية المطلوب. إذا توقف تدفق الدم وضع ضمادة على طرف أصبعك. إجراء ثقب جلد ثاني على إصبع آخر إذا كان مطلوباً المزيد من الدم للفحص.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-تجفيف بقع الدم
<ol><li>لتجفيف بقع الدم، وضع تصفية بطاقات على ورقة نظيفة منشفة في خزانة سلامة واقية والسماح لهم الجافة، ويفضل أن يكون O/N (ولكن على الأقل 4 ساعات)، في الرايت نظراً لعدم وجود أي مصدر خارجي للحرارة. عند اكتمال عملية التجفيف وبقع الدم بشكل موحد داكنة لون البنى ولا توجد مناطق حمراء مرئية بعد الآن (الشكل 1)،13، 15، 16.</li>
</ol>4-التخزين والنقل من بقع الدم المجفف (DBS)
ملاحظة: يمكن أن توقف تجهيز بقع الدم بعد التجفيف. بطاقات التصفية يمكن الآن المخزن13-16، 23.
<ol><li>للتخزين، ووضع بطاقة ورق الترشيح في حقيبة السوستة وحيد والغاز كتيمة، التي تحتوي على 1 إلى 2 كيس المجففة لحماية العينات من الرطوبة (الشكل 1E). بشكل اختياري، أضف بطاقة مؤشر رطوبة.</li>
	<li>نقل هذه الحقيبة لثلاجة بدرجة حرارة-20 درجة مئوية أو أقل وقت ممكن. إذا لم تتوفر الثلاجات الظروف الميدانية، الممكن تخزين-4 درجة مئوية أو حتى في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 14 يوما.</li>
	<li>نقل العينات DBS المجمدة في الثلج الجاف. لتصفية بطاقات أبقى في البداية في درجة حرارة الغرفة، استخدم نظام تغليف ثلاثي، الذي يتكون من bag(s) سحاب container(s) الداخلية فضلا عن الداخلية ومغلف خارجي. لا تحمل علامات المحتوى مطلوبة في المحيط الخارجي للشحن بالبريد العادي ولكن يجب أن الملصقة رمز اقية الدولية ل الحاويات الداخلية الأولية16.</li>
	<li>استبعاد البطاقات مرشح من مزيد من المعالجة إذا كانت حزم المجففة و/أو بطاقة مؤشر الرطوبة إضافية يتغير إلى لون وردي.</li>
</ol>5-شطف الدم المجفف البقع13، 15، 16، 23
<ol><li>لكمه على بقعة واحدة مع جهاز 6 مم من استخدام واحد من كل دائرة الدماء بطاقة تصفية الصف 903 (الشكل 1F). نقل جميع لكمات بقع الدم المجفف من مريض واحد لواحد من لوحة 12-جيدا جيدا.</li>
	<li>سد البئر مع الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.05% 20 توين و 0.08 في المائة أزيد الصوديوم (الشكل 1). التكيف مع حجم المخزن المؤقت إضافة إلى الحد الأدنى من المتطلبات الخاصة بكل منها للمقايسة المستخدمة للتحليل اللاحق الواتيس بقع الدم المجفف.</li>
	<li>كرر هذه الخطوات للحصول على سلسلة ثانية من الواتس بقعة الدم المجفف من أجل إجراء التحليلات الجزيئية.</li>
	<li>وضع لوحة الثقافة الخلية على شاكر مختبر وترك بقع الدم المجفف لكمات الوتي برفق للحد أدنى من الموارد البشرية 4، أو يفضل، O/N (الشكل 1 ح).</li>
	<li>في اليوم التالي، البقع خالية تقريبا من الدم وقد شكلت supernatants الانحلالي (1I الشكل). نقل هذه الواتس لأنابيب ميكروسينتريفوجي. ثم إخضاعها للطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في س 10,500 ز (الشكل 1J) لتحرير سوبيرناتانتس من أي حطام قد شكلت خلال شطف (الشكل 1 K).</li>
</ol>6-تحليل الواتس
<ol><li>الواتس تثفيل الآن جاهزة للاستخدام للتحليلات المقصود. التحقيق في الواتيس لعلامات لفيروس التهاب الكبد باء وفيروس التهاب الكبد الوبائي وفيروس نقص المناعة البشرية باستخدام أدوات متوفرة تجارياً واتباع تعليمات الشركات المصنعة كل منها بعناية (الشكل 1 لتر).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> رقم 1- ملخص رسومي للبروتوكول المقترح في هذه الاتصالات من أجل إعداد وتجهيز بقع الدم المجفف استخدامها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية. الدم كله وريدي والشعرية التي تم الحصول عليها أما من فينيبونكتوري أو ثقب الجلد مجلة لانسيت (A) قد تخدم كعينات لتحليل بقعة الدم المجفف. بعد نقل الدم إلى دوائر بطاقة تصفية 903 الصف (ب، ج)، العينات يجب أن تجفف يفضل O/N في درجة الحرارة المحيطة بسلامة واقية مجلس الوزراء على شكل بقع اللون البنى بالتساوي دون أي إينتيرسبيرسيون الأحمر المناطق (د). عند تجفيف بقع الدم كاملة والتخزين ضروري، يمكن تعبئتها بطاقات التصفية في الزمام الغاز كتيمة حقائب تحتوي على 1 – 2 كيس المجففة (E). كذلك تجهيز مختبر DBS تشمل توليد اللكمات بجهاز واحد استخدام 6 مم من وسط الدوائر (و، ز)، شطف اللكمات في المخزن مؤقت المستندة إلى برنامج تلفزيوني للحد أدنى من الموارد البشرية 4، أو يفضل، س/ن على شاكر (ح )، استرداد الواتيس (أنا)، وأخيراً استخدام الطرد المركزي الكؤوس المختبرية (ي) لتحرير الواتيس DBS من أي حطام قد نشأت أثناء عملية شطف (K). وفي وقت لاحق، الواتس DBS مستعدون للتحليلات التي أجريت بمنصة مؤتمتة بالكامل (L) من أجل كشف علامات المصلية للالتهابات HBV، سي، وفيروس نقص المناعة البشرية، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

وفي الماضي، تلقت RSR أتعاب لإلقاء محاضرات وتقديم الدعم المالي لعمله العلمي من "تشخيصات أبوت". الحرس الوطني وأم تعلن أن لها لا مصالح متضاربة.

DBS قد استخدمت لسنوات 1002 ، لكن المثير للدهشة، لا يزال هناك لا توافق عام في الآراء حول إعداد وتجهيز. وحتى الآن، توحيد كافية في هذه المرحلة التحليلية السابقة الهامة فقط قد أحرز في مجال فحص حديثي الولادة14، بينما توجد مجموعة متنوعة من البروتوكولات المختلفة لكافة التطبيقات الأخرى من DBS الاختبار5، 16، 23. للتغلب على هذا التباين الملحوظ، المعروضة في هذا البلاغ تعليمة خطوة بخطوة شاملة لإعداد وتجهيز DBS أن تستخدمها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية وتقييمها فيما يتعلق بفعالية للكشف عن علامات الإصابة بالتهاب، سي، وفيروس نقص المناعة البشرية. المناقشة التالية هي أساسا التركيز على الخطوات المختلفة للبروتوكول المقترح.
في تاريخ DBS اختبار ورقة تصفية مختلفة العديد من بطاقات تستخدم2 ولكن اليوم سوى اثنين من مصادر تجارية تحظى بموافقة إدارة الأغذية والعقاقير كالفئة الثانية الأجهزة الطبية لجمع الدم5، 16. أنظمة بطاقة تصفية هذه الغاية موحدة ويكون استيعاب خصائص مشابهة جداً بحيث لا تختلف النتائج التحليلية التي تم الحصول عليها من الدم الشعرية التي أعدت في أي منهما بأكثر من 4%-5%28. وليس من المستغرب، ماسسيوترا وزملاء العمل29 ولذلك تم الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 "الجيش الملكي النيبالي" جيدا على قدم المساواة مع تحليل نوعي بعد شطف من بطاقات جمع الدم من مصادر مختلفة. نظراً لهذه البيانات، فإنه يمكن عمليا استبعاد أن أي من التناقضات ولاحظ عند اختبار اقتران أزواج المصل/DBS لعلامات من HBV، سي وكان سببه عدوى فيروس نقص المناعة البشرية17 اختيار بطاقة تصفية وحدها. ومع ذلك، عند دقة التحديد الكمي لأكثر أمر لا غنى عنه، يعد التباين المصدر للمصدر قد لا يعتد بها وتقنيات أكثر تطورا، مثلاً، مثقب DBS (بدبس) كأسلوب ميكروسامبلينج30 أو إعداد بقع المصل المجففة قد (DSS)31 لتطبيقها بدلاً من التقليدية DBS اختبار10.
حيث تستخدم كميات صغيرة فقط من الدم لاختبار DBS (قطره واحدة من الدم الشعرية تتكون من حوالي 50 ميليلتر)5، 16، الاختلافات في حجم العينة الحاسمة، ومن المسلم به أن على الأقل بعض الاختلافات بين النتائج المصلية وذكر مشارك الذاتي HBV وفيروس التهاب الكبد جيم حالة سجلت خلال تجريب "دراسة دراك" تعزى إلى هذا المتغير. أهم عامل للتقليل إلى أدنى حد "تقلبات" حجم العينة هو بلا شك أسلوب صحيح لجمع الدم الشعرية، التي يمكن أن يتحقق إلا بتدريب الموظفين التقنيين22دقيقة ومستمرة. وعلاوة على ذلك، كتدبير من تدابير مراقبة الجودة، وجميع المختبرات العاملة مع DBS ينبغي قد شرعت إجراءات لتحديد، وفي وقت لاحق باستثناء DBS العينات التي قد تعتبر غير مرضية أو غير صالح16.
دراسات تجري أساسا في سياق فيروس نقص المناعة البشرية32 وفحص الوليد33 أظهرت أن ارتفاع نسبة الرطوبة قد يؤدي إلى تدهور لتحليلها، ولكن حتى الآن تم التوصل إلى أي توافق في الآراء بشأن مسألة كم من الوقت ينبغي أن يكون DBS الهواء المجفف . فاصل على الأقل 4 ساعة أو يفضل أن يقترح O/N في هذه الرسالة، التي اعتمدت لذلك الشروط التي استخدمت في الغالبية العظمى من جميع المنشورات ذات الصلة32، 34 البيانات في التخزين DBS لاستخدامها في وقت لاحق HBV وفيروس التهاب الكبد جيم اختبار تكون متعارضة. في عام 1981، وفيلا وزملاء العمل35، الذي يطبق التقنيات التحليلية المعاصرة، أفادت أن التخزين في الرايت لا تؤثر نتائج التحاليل HBV أثناء فترة المراقبة كامل لمدة 180 يوما إذا كان جسم التتر > 1/1,000، ولكن ذلك DBS وأصبح الشريط الحدودي-الإيجابية أو السلبية حتى بعد 15 يوما عندما كان التتر في مصل الدم فقط 1/100. التخزين في-20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية لم تسفر عن تحسن كبير. وفي المقابل، إجراء دراسة ثلاثين عاماً يتطابق لاحقة36 اختبار عينة HBV-إيجابية، ووجد الباحثون أن مكافحة-HBc، فضلا عن الأجسام المضادة-ميزانيات كانت مستقرة ليصل إلى 183 يوما في الرايت، بينما أصبح HBsAg نفس الظروف السلبية الكاذبة فعلا بعد 63 يوما. وفيما يتعلق بالكشف عن الحمض النووي HBV من الواتس DBS، تركيز الحمض النووي الفيروسي مستقرة لمدة سبعة أيام على الأقل في37 من 37 درجة مئوية أو ثبت أن "مقاومة" لتخزين في RT لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع38. اختبار الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد جيم-مكافحة استخدام اثنين من الجيل الثالث المتاحة تجارياً تحديدكم39 تقدم نتائج دقيقة لفترة 117 يوما باستخدام عينات DBS المخزنة في-20 درجة مئوية، 2 – 8 درجة مئوية ومن 20-25 درجة مئوية، على التوالي. ومع ذلك، أدى التخزين في-20 درجة مئوية، أدنى اختلاف الكثافة البصرية. تطبيق مكافحة جيل الرابع-سي إليزا، أي، مونوليسا سي-جي-Ab-الترا، في سياق DBS اختبار، لارات et al. 40 لوحظ انخفاض حاد في الدقة التحليلية بعد تخزين العينات DBS لأكثر من ثلاثة أيام في الرايت من ناحية أخرى، تم الحصول على نتائج اختبار دقيقة مع هذه المجموعة نفسها استخدام العينات التي أودعتها برانداو وزملاء العمل41لمدة 60 يوما تحت ظروف مختلفة (-20 درجة مئوية، 2 – 8 درجة مئوية، و 22-26 درجة مئوية). ملاحظات بشأن الانخفاض تركيزات "سي الجيش الملكي النيبالي" في DBS تحت ظروف التخزين المختلفة تتراوح بين لا تغيير كبير في الرايت لتصل إلى واحد سنة42 إلى تغيير عشرة إضعاف بعد أربعة أسابيع في درجة الحرارة المحيطة43. أخذ هذه البيانات المتضاربة بدلاً من ذلك على الاستقرار في HBV ومولدات المضادات سي والأحماض النووية والأجسام المضادة في الاعتبار، يبدو من المعقول تتراجع في البروتوكول المقترح إلى توافق في آراء، التي تم تعريفها مسبقاً لتخزين العينات DBS ستستخدم فيروس نقص المناعة البشرية اختبار15، 30: لترسب قصيرة الأجل (تصل إلى أسبوعين) مولدات المضادات، والحمض النووي الفيروسي، والأجسام المضادة تعتبر مستقرة في الرايت، بينما يتم التخزين الأمثل لفترات أطول في ظروف المجمدة.
كقاعدة عامة، ينبغي النظر المعلمات الثلاث عند تصميم بروتوكولا شطف: (1) شطف المخزن المؤقت؛ (2) المدة ودرجة الحرارة من شطف؛ و (3) حجم شطف23. في الغالبية العظمى من جميع المنشورات ذات الصلة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) استخدمت التينج DBS، ومعظم المؤلفين بإضافة البروتين، مثلاً، ألبومين المصل البقري (BSA) أو توين 20، خافض للتوتر السطحي، بغية تحسين إشارة المقايسة باستقرار البروتينات، كما أنها تذهب إلى الحل، وفي نفس الوقت حظر مواقع غير محددة ملزمة23. فقط بعض التقارير، مقارنة مباشرة مخازن شطف مختلفة في سياق اختبار DBS، متاحة. فيلار et al. 36، مثلاً، سجلت قدرات شطف معادل تقريبا لكافة المخازن المؤقتة استخدامها، ولكن برنامج تلفزيوني/جيش صرب البوسنة أدت إلى 0.5% في أدنى مستوى من مفاعليه غير محددة. وأدلى ملاحظة مماثلة جداً مطعمة وزملاء العمل44 عند تطبيق مخفف عينة من "أنظمة الوراثة" رلاف تقييم الأثر البيئي شطف الأجسام المضادة-سي من DBS. نظراً لخطر تدهور العينة منخفض للغاية في الساعات الأولى بعد إعداد DBS (انظر أعلاه)، تقرر لاحتضان البقع O/N في درجة حرارة الغرفة ودعم عملية شطف بخلط النهاية أكثر لطيف. ويمتاز هذا النهج أن العينات اللكم خارج السابقة يوم يمكن مباشرة نقل للتشخيص الروتيني مبكرا صباح اليوم التالي23. وينبغي تكييف حجم المخزن المؤقت شطف للحد الأدنى من المتطلبات الخاصة بكل منها من الاختبارات المستخدمة للتحاليل اللاحقة بغية إبقاء عامل إضعاف منخفضة قدر الإمكان. ومع ذلك، تحسين عناية الشروط شطف لكل واحد من أكثر لم يكن ممكناً في التقييم السابق سبب عينة عالية إنتاجية يجب أن تكون مضمونة في وقت قصير نسبيا خلال "دروك دراسة"17. ونتيجة لذلك، كان استخدام وحدة التخزين غير مواتية بدلاً من 1,000 ميليلتر من المخزن المؤقت المستند إلى برنامج تلفزيوني بغية استكمال عملية شطف كامل لجميع المعلمات في عمليتين منفصلتين.
يفشل هذا النهج واحد، من الناحية "تماما في نظام مكافحة-HBc/مكافحة-ميزانيات لأولئك الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية نتيجة لتركيزات منخفضة من الأجسام المضادة؛ ... وأنها تتطلب إجراءات البيولوجية الجزيئية مع حساسية تحليلية الأمثل فيما يتعلق بالحمض النووي HBV واختبارات "الحمض النووي الريبي سي". " 17 ، من ناحية أخرى، حجم شطف عالية ثبت في أي شكل من الأشكال غير مؤات لتحديد HBsAg، سي المضادة، ومكافحة فيروس نقص المناعة البشرية بمجموعات المواد المستخدمة في التقييم. "الكشف عن مواد إيجابية من الواتس الدم كله نجح مع حساسية 98.6 في المائة إلى درجة عالية وبالمثل كما هو الحال في الدراسات السابقة، التي استخدمت في جزء وحدة تخزين شطف أصغر بكثير من 100 ميليلتر أو 250 ميليلتر، أو ميليلتر 600 أو 500 ميليلتر HBsAg"17 ،36، 45، 46. حساسية 97.8 في المائة تحدد في التحقيق في 179 المصل/DBS أزواج للأجسام المضادة-سي تتفق مع النتائج الموجودة بالفعل تقارير24، 44، 47، 48، 49، التي عملت مع وحدة تخزين شطف كان أقل بمقدار 5 إلى 10. "وباﻹضافة إلى ذلك، البروتوكولات للكشف عن فيروس التهاب الكبد جيم-مكافحة قد تم على النحو المناسب الأمثل... إذ ينص على نقاط وقف إنتاج المواد الانشطارية الخاصة بهم"،17، 24، 48، 49 "أو عن طريق زيادة حجم العينة من 20 ميكروليتر إلى 100 ميليلتر." 17، 49 وأخيراً، خصوصية التحليلية وحساسية (100% كل) المنشأة للكشف عن مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية كانت مساوية أو متفوقة على خصائص الأداء لتحديدكم الأخرى على وجه التحديد تتكيف DBS اختبار50، 51 "أو تدريجي الإجراء مع الاستخدام المشترك للعديد من الاختبارات لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية "17،52. "أنهم، في الواقع، كما تجاوز سجل الأداء المقايسة التي أعدت خصيصا والأمثل للكشف عن الأجسام المضادة فيروس نقص المناعة البشرية في الواتس DBS (س-منع فيروس نقص المناعة البشرية 1 + 2 طقم DBS)." 17, 53  
أخذت معا، البروتوكول خطوة بخطوة شامل المعروضة في هذا البلاغ أثبت أنه أداة مجدية وسهلة الاستخدام لإعداد وتجهيز DBS و، وهكذا، يمكن استخدام موثوق في علم الفيروسات التشخيصي. يسمح نهج استخدام أتمتة 54 ، ونظرا لخصائصها الأداء الممتاز وقد يمكن أن تكون بمثابة نوع من حجر الأساس لبروتوكول مستقبل توافق آراء مقبولة عموما في ميدان العالمية DBS التجارب في المختبرات الطب.

أن فكرة استخدام الدم التي تم جمعها في بطاقة ورق مصنوع من السليولوز يعزى إلى إيفار المسيحية بانج (1869-1918)، الأب سليكية السريرية الحديثة1، 2. في عام 1913، بانج القياسات النيتروجين الجلوكوز العزم من الواتس من الدم المجفف البقع (DBS)3 ، وفي وقت لاحق، يقوم أيضا باستخدام الأسلوب كيلدهل مع هذا الأسلوب تصفية ورقة2. وفي وقت لاحق، أفادت العديد من المحققين على استخدام DBS للاختبارات المصلية لتشخيص مرض الزهري2. كما مبكرا كما هو الحال في عام 1924، تشابمان تلخيص مزايا الاختبار DBS عندما شدد بخاصة البنود الأربعة، التي لا تزال صالحة اليوم: (1) فينيبونكتوري مقارنة بالتقليدية، أقل حجم الدم مطلوب وهذه الحقيقة الأكثر أهمية في طب الأطفال التشخيص؛ (2) جمع الدم بسيط وغير الغازية، وغير مكلفة؛ (3) أن خطر التلوث البكتيري أو انحلال الدم الحد الأدنى؛ ويمكن الحفاظ على DBS (4) لفترات طويلة مع تقريبا لا تدهور لتحليلها2، 4. بالإضافة إلى استخدامه في اختبار للزهري، شملت كذلك من أوائل تطبيقات تقنية DBS، مثلاً، الكشف عن الأجسام المضادة ضد الحصبة والنكاف، وفيروس شلل الأطفال، والفيروسات باراينفلوينزا، والفيروس المخلوي التنفسي (RSV) في عام 19532، تحديد دوسنتاريا في البراز المجفف على ورق الترشيح وشحنها بالبريد العادي من إندونيسيا ليدن في هولندا، فضلا عن الكشف عن الأجسام المضادة إلى بلهارسيه في DBS المتخذة في المناطق الموبوءة وتحليلها بعد أكثر من ثلاثة أشهر5 . في عام 1963، خمسون سنة بعد الانفجار في الأصل الاتصال2، 6، وأخيراً غوثري نشر طريقته الشهيرة لتشخيص كيتون من DBS التي حصل عليها وخز كعب من حديثي الولادة7، 8.
على الرغم من أن من ذلك الوقت فصاعدا، اعتبرت DBS أسلوب المطبقة عادة لجمع، تخزين، ونقل، وتحليل مجموعة متنوعة من سوائل الجسم البشري5، استخدامها في تشخيص لا تزال تركز أساسا على تشخيص التهابات خاصة في الأماكن المحدودة الموارد والفحص المنهجي للأطفال حديثي الولادة للاضطرابات الأيضية الموروثة لعقود9، 10. منذ عام 2005، ومع ذلك، مجموعة متنوعة من التطبيقات الجديدة والمبتكرة DBS بدأت تظهر. وادي ذلك إلى زيادة عدد المنشورات العلمية الخاصة بكل منها على DBS من حوالي 50 إلى ما يقرب من 450 أسي تقريبا سنوياً في الوقت الحاضر. من بين التطبيقات المستجدة، مجالات متنوعة مثل توكسيكو-ودراسات الحرائك الدوائية التنميط الأيضية، ورصد العقاقير العلاجية، وعلم السموم الشرعي أو مراقبة التلوث البيئي10، 11.
اختبار DBS، وهكذا، جعلت مسيرة النصر من خلال التشخيص المختبري السريري في الماضي 100 سنة2. كما هو الحال في الكيمياء السريرية12، ومع ذلك، خلال هذه المسيرة المتغيرات قبل التحليلية لم على نحو كاف تعتبر لسنوات عديدة. وفي الواقع، حتى اليوم، بعد هذه الأنشطة البارزة لمركز السيطرة على الأمراض ورقة تصفية تقييم المشروع13 أو صياغة معيار وطني لجمع الدم على ورق الترشيح في الإطار الوليد فرز14، بالمرحلة التحليلية السابقة لا تزال إلى حد كبير مقومة في معظم ميادين أخرى، فيها اختبار DBS التطبيقية5، 10.
في ضوء هذه الخلفية، يقترح بروتوكول خطوة بخطوة شامل14-16 للاستخدام في تحديدكم والتقنيات الجزيئية، الذي يغطي كافة الخطوات الضرورية، لإعداد وتجهيز DBS في الرسالة التالية: (1) جمع الدم؛ (2) إعداد بقع الدم؛ (3) تجفيف بقع الدم؛ '4' تكاليف التخزين والنقل؛ (5) شطف DBS؛ وأخيراً (6) تحليل DBS الواتس. وكان تقييم فعالية البروتوكول أولاً مع أزواج يزوج 1,762 المصل/DBS للكشف عن التهاب الكبد الوبائي فيروس (HBV) للمستضد السطحي (HBsAg)، أجسام مضادة للأجسام المضادة لالتهاب للمستضد السطحي (مكافحة-HBs)، الحمض النووي HBV، HBV الأساسية مستضد (مكافحة-HBc)، الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد الوبائي (سي) (مكافحة--سي)، اختبارات "سي الجيش الملكي النيبالي"، وفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز) 1-p24-مستضد/مكافحة-فيروس نقص المناعة البشرية 1/2 باستخدام منصة مؤتمتة بالكامل أو حساسية الحمض النووي النوعي. 17-في خطوة ثانية، واستخدم البروتوكول في الدراسة التجريبية "المخدرات والمعدية الأمراض المزمنة" ("دراسة دراك") الذي أجرى بمعهد روبرت كوخ-بالتعاون الوثيق مع "المركز الوطني للإشارة" لالتهاب الكبد الوبائي في نشطة متعاطي المخدرات في المدن الألمانية في برلين واسن18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

وفكرة جمع الدم على بطاقة ورقة، وفي وقت لاحق باستخدام بقع الدم المجفف (DBS) لأغراض التشخيص التي نشأت منذ قرن من الزمان. ومنذ ذلك الحين، اختبار DBS لعقود ظلت في الغالب تركز على تشخيص الأمراض المعدية وبخاصة في الأماكن المحدودة الموارد أو منهجية فحص المواليد الجدد للاضطرابات الأيضية الموروثة وإلا يكون مؤخرا مجموعة متنوعة من تطبيقات DBS مبتكرة وجديدة بدأت في الظهور. لسنوات عديدة، اعتبرت المتغيرات قبل التحليلية فقط غير لائق في ميدان اختبار DBS، وحتى اليوم، باستثناء الفحص، في المرحلة التحليلية قبل أسرة، الذي يشمل الإعداد وتجهيز DBS لحديثي الولادة على قد لا تم توحيد التحليل النهائي. في ضوء هذه الخلفية، بروتوكول شامل خطوة بخطوة، الذي يغطي ال مراحل أساسية، من المقترح، أي جمع الدم؛ إعداد بقع الدم؛ تجفيف بقع الدم؛ تخزين ونقل DBS؛ شطف DBS، وأخيراً تحليل DBS الواتيس. وكان تقييم فعالية هذا البروتوكول أولاً مع أزواج يزوج 1,762 المصل/DBS للكشف عن علامات لفيروس التهاب الكبد باء وفيروس التهاب الكبد الوبائي، وعدوى فيروس نقص المناعة البشرية على منصة التحليل الآلي. في خطوة ثانية، استخدم البروتوكول أثناء دراسة، التي أجريت على متعاطي المخدرات النشطة في المدن الألمانية في برلين واسن.

فعالية البروتوكول المقترح لإعداد وتجهيز DBS قيمت أولاً بتحليل 1,762 المصل/DBS يزوج أزواج لعلامات الإصابة بالتهاب، سي، وفيروس نقص المناعة البشرية. 17-لهذا الغرض، أعدت من 100 ميليلتر كله وريدي الدم (انظر النقاط 2.1.1 – 2.1.6 البروتوكول السابق) DBS وكانت الوتيد مع ميليلتر 1,000 على أساس برنامج تلفزيوني للمخزن المؤقت، كل منها (انظر النقاط 5.1 – 5.5 من البروتوكول المذكور أعلاه) لإتمام العملية لكل المعلمات السبعة في عمليتين منفصلتين. هذا نهج دون الأمثل عناية الشروط شطف لكل واحد من أكثر يبدو أمرا لا مفر منه لأنه كان يتوقع إنتاجية عالية بدلاً من نموذج في وقت قصير نسبيا أثناء الدراسة الميدانية القادمة "المخدرات والمزمنة الأمراض المعدية "(" دراسة دروك ").
جميع القياسات التقيد بتوصيات الشركة المصنعة خلال التحليلات DBS، لكنه اضطر إلى تعديل فيما يتعلق بقرارات HBsAg وميزانيات المناهضة لتعويض أثر انحلال الدم أو نتيجة لتمييع. بوقف إنتاج المواد الانشطارية قيمة 0.05 وحدة دولية/مل، عينات اختبار HBsAg DBS الواتس يؤدي إلى معدل إيجابيات كاذبة من 14.7% (52 من أصل 354) عند مقارنتها بالمصل (الشكل 2A). جهاز استقبال يعمل المميزة (ROC) تحليل25، 26 من البيانات أشارت إلى أن زيادة الحد الأدنى إلى 0.15 وحدة دولية/مل سيؤدي فصل HBsAg من إيجابيات مثالية من السلبيات HBsAg (0.986 [حساسية]، 0.000 [1-خصوصية]، الشكل 2). من ناحية أخرى، مع إنتاج 10 وحدات دولية/لتر للتحديد الكمي لميزانيات مكافحة تسجيل الأجسام المضادة كان معدل السلبية الكاذبة القياسات من 14.2 في المائة (47 من أصل 331) (الشكل 2). ومن ثم، بعد تحليل ROC مرة أخرى، خفضت هذا الوقف إلى 1.5 وحدة دولية/لتر تحقيقا تمييز أمثل للقيم (0.917 [حساسية]، 0.007 [1-خصوصية], الشكل 2D).
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> الشكل 2- HBsAg ومكافحة-ميزانيات اختبار في الواتيس DBS (معدلة من17)- زيادة قيمة الوقف للقياس الكمي HBsAg من 0.05 وحدة دولية/مل (A) إلى 0.15 وحدة دولية/مل الإرشادية ROC (ب) تخفيض معدل نتائج إيجابية كاذبة من 14.7 في المائة إلى 0%. وبالمثل، اقترح ROC تحليل ميزانيات مكافحة تركيزات انخفاض عتبة كل منهما من 10 وحدات دولية/لتر (ج) إلى 1.5 وحدة دولية/لتر (د) تماما وبالتالي القضاء على السلبيات الكاذبة، التي شكلت في البداية 14.2 في المائة من جميع القرارات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a> 
ويرد في الجدول 117نتائج التحاليل إلى جانب المصل/DBS. لم يسجل أي غير خصوصية أثناء DBS الاختبار لأي من التحاليل سبعة.
عندما جرى التحقيق DBS الواتيس لوجود HBsAg، أولاً هاء المعلمة الرئيسية المصلية للإصابة الحادة والمزمنة مع HBV، عازمة حساسية تحليلية 98.6 في المائة. وكانت تركيزات HBsAg في الأمصال السلبية زورا اثنين 749 وحدة دولية/مل و 6 وحدة دولية/مل، على التوالي. تم بنجاح الكشف عن الأجسام المضادة-HBc في 176 من أصل 204 (أولاً ه 86.3 ٪) DBS الواتس. اثنان وعشرون من أصل 28 العينات التي تم الكشف عنها لا بالقياسات نشأت من الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. وهكذا، إذا تم استبعاد الأفراد المصابين من الحساب، تحقق حساسية 97.1 في المائة لاسترجاع الأجسام المضادة-HBc من التيد الدم الوريدي كله المجففة. ملاحظات مماثلة عقد صحيح لتحديد الأجسام المضادة HBs. حتى بعد تعديل قيمة إنتاج الإنزيم إلى 1.5 وحدة دولية/لتر، وقع النتائج DBS المصل discrepant تسعة. في المرضى غير المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وجدت تركيزات المضادة HBs المصل من 11 – 26 وحدة دولية/لتر، التي كانت منخفضة للغاية للسماح للكشف بعد شطف الدم المجفف.
الأجسام المضادة-سي تعتبر مؤشرا أما العدوى الحادة أو المزمنة أو حلها. وحددت نتائج زورا السلبية-مكافحة فيروس التهاب الكبد جيم (أولاً هاء 2.2 في المائة) فقط أربعة من الواتس DBS وكذلك أثبتت التحاليل المصلية والجزيئية بوضوح جداً ربما اتخاذ سيرا كل من المرضى، والإصابات التي كانت منذ فترة طويلة حل.
تم الكشف عن الأجسام المضادة فيروس نقص المناعة البشرية في الواتس DBS مع النظام الآلي بالكامل عملية سلسة تماما التي أسفرت عن حساسية تحليلية 100%.
"تركيز الحمض النووي HBV يعني من الواتس الدم كله أجرى على عينات من 100 (يعني تركيز الحمض النووي: 1,573,898 وحدة دولية/مل، ومجموعة: < 357--> 17,860,000 وحدة دولية/مل) وأسفرت عن قيمة 93.0%. وهكذا، لم الكشف عن العينات السبعة مع تركيزات المصل منخفضا الحمض النووي HBV بين 409 و 3,643 وحدة دولية/مل قبل DBS اختبار. 100 سيرا الذي ثبت أنه "سي الجيش الملكي النيبالي" إيجابية (يعني تركيز "سي الجيش الملكي النيبالي": 1,415,944 وحدة دولية/مل، ومجموعة: 2,479--> 7,692,000 وحدة دولية/مل)، المقابلة الدم كله مختبرين كانت متاحة. التحقيق المقارن أسفر عن حساسية تحليلية 100% لقرارات "سي الجيش الملكي النيبالي" من الواتس DBS. " 17
استخدامه لاختبار البروتوكول المحدد لإعداد وتجهيز DBS الظروف الميدانية، بالتعاون الوثيق مع روبرت كوخ-المعهد (برلين، ألمانيا) خلال المرحلة التجريبية لدراسة "المخدرات والأمراض المزمنة المعدية"، الذي كان أجريت على متعاطي المخدرات النشطة في المدن الألمانية في برلين واسن18. خضع جميع المشاركين 534 المسجلين (433 الرجال والنساء 101) أخذ عينات الدم الشعرية كما هو موضح بالتفصيل في الأقسام 2.2.1 – 2.2.3 البروتوكول السابق، و DBS، مرة أخرى، الوتيد بإضافة ميليلتر 1,000 المخزن المؤقت المستند إلى برنامج تلفزيوني.
تم تشخيص اثنين من الأفراد أنهم مصابون بأمراض مزمنة HBV، و 39 وأظهرت المصلية عدوى التهاب حلها. وعلاوة على ذلك، خمسة عشر مشاركاً بإيجابية لمكافحة--هكسابايت (المركز بعد التلقيح) وثمانية تم العثور على أن تكون إيجابية لمكافحة--HBc وحدها. انتشار فيروس التهاب الكبد جيم-مكافحة بين المشاركين كان 57.3% (N = 193) في برلين و 73.0% (N = 144) في إيسن. عينات من الجسم-الإيجابية 65% (N = 125) و 62% (N = 89) كما كانت فيريميك. خمسة وعشرون من أصل الأفراد 534 اختبار إيجابية لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. تسعة عشر من الإصابات كانت معروفة بالفعل وشاركت المصابة بفيروس التهاب الكبد جيم 24 من هؤلاء الأفراد.
وقورنت النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق اختبار DBS بعناية مع بيانات المشاركين في الدراسة أنامنيستيك فيما يتعلق بالحالة المبلغ عنها ذاتيا HBV وفيروس التهاب الكبد جيم. هذه المقارنة بالاقتران مع نتائج الاختبار إلى جانب أزواج المصل/DBS أدت إلى إجراء تعديلات طفيفة من خوارزمية الاختبار للمرحلة الرئيسية من "الدراسة دراك" التي ستلتحق متعاطي المخدرات النشطة في ست مدن ألمانية كبيرة إضافية: "الأفراد المصابين سيتم اختبار فيروس نقص المناعة البشرية دائماً لوجود الحمض النووي HBV. المشاركين الذين الواتس DBS إيجابية بالنسبة HBc المضادة أو مكافحة ميزانيات ينبغي أن تتعرض فينيبونكتوري خلال مشاورة ثانية من أجل توضيح وضعهم المضادة-HBc/مكافحة-ميزانيات بالتأكيد، وأخيراً، سيعرض جميع DBS الواتس "الجيش الملكي النيبالي سي" بغض النظر عن نتائج اختبار سي المضادة ". 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>معلمات</td>
			<td>يقترن سيرا/DBS الواتيس (N)</td>
			<td>نتائج discrepant (N)</td>
			<td>أسباب التباين بين اختبار المصل والواتس DBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>اثنين من المرضى بعدوى مزمنة HBV. سواء كانت تحت العلاج المضاد للفيروسات، وواحد منهم كان يشترك المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. HBsAg التركيزات في مصل الدم: 749 وحدة دولية/مل و 6 وحدة دولية/مل، على التوالي.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBc المضادة</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>في مصل الدم، كان المرضى اثنان وعشرون من عدوى HBV حلها. وأظهرت ستة أفراد إيجاد المصلية "مكافحة-HBc وحدها". اثنان وعشرون من المرضى قد شارك المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. قيمت عشرين من "resolvers HBV"، كما "المضادة HBs الإيجابية وحدها" عن طريق اختبار DBS، وهكذا، زورا صنفت على أنها "حالة بعد التطعيم".</td>
		</tr>
<tr>
<td>مكافحة--هكسابايت</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>أربعة المرضى غير المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية قد تركيزات مصل المضادة HBs 11 ‑ 26 وحدة دولية/لتر، التي كانت منخفضة للغاية للسماح للكشف عن الأجسام المضادة بعد شطف بقع الدم المجفف.</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحمض النووي HBV</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>قد تم الحصول على الأمصال الخاصة بكل منها من سبعة مرضى مع تركيزات الحمض النووي HBV المصل منخفضة تتراوح بين 409 وحدة دولية/مل 3,643 وحدة دولية/مل.</td>
		</tr>
<tr>
<td>فيروس التهاب الكبد جيم</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مكافحة--سي</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>لقد اتخذت هذه الأمصال أربعة من المرضى، مع فترة طويلة منذ حل سي التهابات.</td>
		</tr>
<tr>
<td>سي الجيش الملكي النيبالي</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>فيروس نقص المناعة البشرية</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>فيروس نقص المناعة البشرية 1-p24/مكافحة-فيروس نقص المناعة البشرية 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: النتائج التي تم الحصول عليها من 1,762 دي بي إس، التي أعدت ومعالجتها من الدم الوريدي كلياً بعد البروتوكول المقترح في هذه الاتصالات، مقارنة بالنتائج التي توصل إليها في عينات المصل إلى جانب كمرجع.

Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

لا تزال ضعيفة هي موحدة بإعداد وتجهيز بقع الدم المجفف (DBS) لتحليلها النهائي لمعظم التطبيقات التشخيصية. للتغلب على هذا القصور، اقترح بروتوكول شامل خطوة بخطوة وتقييمها فيما بعد فيما يتعلق بفعالية للكشف عن علامات للعدوى الفيروسية.

بقع الدم المجفف-إعداد وتجهيز لاستخدامها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

dried-blood-spots-preparing-processing-for-use-immunoassays-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

39.4K Views.  University of Duisburg-Essen. لا تزال ضعيفة هي موحدة بإعداد وتجهيز بقع الدم المجفف (DBS) لتحليلها النهائي لمعظم التطبيقات التشخيصية. للتغلب على هذا القصور، اقترح بروتوكول شامل خطوة بخطوة وتقييمها فيما بعد فيما يتعلق بفعالية للكشف عن علامات للعدوى الفيروسية.

Video: Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

ودقق ميكروفلويديك : تشغيل واستخدام لتصنيع السطحي المترجمة

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

غير الطرفية تقنيات أخذ العينات الدم في غينيا الخنازير

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

الجمعية وتطبيق &quot;خواتم القص &#39;: رواية غشائي نموذج لالمداري، أحادي الاتجاه والدوري السائل تدفق وإجهاد القص

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

إدارة بسيطة وفعالة والتصور من المجهرية الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة باستخدام الحقن الكلي

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

تقنيات Phenotyping ميكرون-مقياس الذرة حزم وعائية استناداً إلى التصوير المقطعي بالأشعة السينية ميكروكومبوتيد

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...