תקשורת זו מבוססת על התוצאות שפורסמו קודם לכן וירולוגיה יומן17 במצב גישה פתוחה תחת תנאי Creative Commons רישיון (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) עם אחראית המרכזי בתור ברישיון. המחברים בהכרת תודה לאשר שיתוף פעולה פורה במסגרת של מטיס המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות" ("מחקר דרוק") עם מרקוס בארצות הברית, וו קאי, ג'אנג ו ר צימרמן של רוברט קוך-המכון (ברלין, גרמניה), הם אסירי תודה על Moyrer ס' עבור מצלם את התאספו איור 1 גם באשר ד פ Whybrew, ph. d., (גטינגן, גרמניה) לתיקון כתב היד. הם גם לבטא את ההערכה שלהם לקבלת סיוע טכני מיומן כדי ג'יי אקרמן, Bayrambasi א, U. Büttner, Dziubek ס', אני Jakobsche, B. Krellenberg, קרון ה, עמ' Kusimski, א מטקלף, ג'יי Piejek, סער ס', מסיה שרטר, ק' סיידל. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק של משרד הבריאות, הפניה למרכז הלאומי הגרמני עבור הפטיטיס c.

מאז הפרוטוקול מיועד לשימוש בתוכנית האבחון הרפואי, היישום שלה לציית לעקרונות הצהרת הלסינקי19. את החלק הראשון של התוצאות שהוצגו תקשורת זו, הן הסכם נפרד על ידי המטופלים והן אישור על-ידי ועדת האתיקה שנראה שניתן לוויתור משתי סיבות: (1) "עם הקבלה" לבית חולים אוניברסיטת אסן, "כל מטופל מספק הסכמה בכתב כל צורך לחקירות הביוכימי בקטריולוגית, virological." 17 (2) "כל דוגמאות בשימוש בכל רחבי הערכת DBS בדיקות נשלחו המכון של וירולוגיה בתהליך אבחון קליני שגרתי. לפיכך, אף אחת מהדוגמאות נאסף במיוחד לצורך המחקר, venipuncture נוספים לא בוצעה, אף אחד מהחומרים נבדקה עבור כל פרמטר מאלה הנדרש על-ידי הרופאים במהלך רגיל אבחון עבודה-up". 17 המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות" (דרוק ללמוד")18, בו DBS בדיקות סוף סוף שימש את הערים הגרמניות של ברלין, אסן להעריך אנשים אשר פעיל להזריק סמים, אושרה על ידי הנציב הפדראלי עבור נתונים הגנה וחופש המידע (ברלין, גרמניה), כמו גם על ידי ועדת האתיקה של צ'אריטה באוניברסיטה הרפואית, (ברלין, גרמניה).
1. אוסף של דם
<ol><li>Venipuncture14, 15, 20, 21<ol>
<li>ללבוש כפפות גומי לטקס חד פעמיות, ולנקות את האזור המיועד החדירה (רצוי את החציון cubital הווריד ב הפוסות antecubital) חומר חיטוי מתאים, למשל, אלכוהול איזופרופיל 70%.</li>
		<li>החל עורקים 4-6 ס מ מעל החדירה בשם כדי distend הורידים. להנחות את המחט לתוך הווריד החולה ולמלא, ברגע זה במקום, בעדינות את הצינור מחובר דם, המכילה EDTA בתור נוגדת קרישה.</li>
		<li>ברגע venipuncture תושלם, לשחרר את חוסם העורקים ולסגת את המחט. לאחר מכן, הקש כרית יבשה גאזה על החדירה, אשר לאחר מכן ניתן לקיים במקום על ידי תחבושת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניקוב עור (איור 1 א')13-15, 20, 22, 23<ol>
<li>לשים על זוג כפפות גומי לטקס חד פעמיות.</li>
		<li>לפני ניקוב עור, המטופל צריך לחמם את הידיים שלו. האצבע הוא המטופל anterogradely enrich לדם לזרום לכיוון ניקוב באתר.</li>
		<li>לנקות את העור של הצד פאלמאר של פלנקס דיסטלי הקצה של האצבע השלישית או הרביעית של היד סטן עם חומר חיטוי מתאים, למשל, אלכוהול איזופרופיל 70%. לנקב את העור על ידי מנתחים בטיחות לשימוש יחיד. האצבע יוחזקו במצב כזה כי כוח המשיכה מקלה על האוסף של דם על קצה האצבע.</li>
		<li>השלמת אוסף של נימי דם על ידי ניקוב עור, להניח תחבושת על קצה האצבע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת כתמי דם
<ol><li>הכנה של הדם הנאסף על-ידי venipuncture15<ol>
<li>במקום (EDTA) שנאספו התקרש נגד דם ורידי לגמרי על הקלפים מסנן בהקדם האפשרי. לא להכין כתמי דם יבשים יותר מ- 24 שעות לאחר venipuncture.</li>
		<li>את כל המידע הדרוש לצורך הזיהוי של המטופל על הכרטיס מסנן. כרטיס אחד צריך הבחין רק עם הדם של אדם יחיד.</li>
		<li>. תלבש כפפות חד פעמיות גומי לייטקס</li>
		<li>היפוך בעדינות את הצינור אוסף דם 2 – 4 פעמים, לאחר מכן לפתוח את הפקק בזהירות.</li>
		<li>האחות µl 50 של דם ורידי שלם באמצעות פיפטה עם טיפ חד פעמיות. להעביר את הדם במרכז מעגל אחד בלי לגעת נייר הסינון ישירות עם קצה פיפטה. מנסה באופן מלא להרוות את המעגל.</li>
		<li>חזור על הליך זה כדי למלא את כל הנדרש עיגולים של הכרטיס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של הדם הנאסף על ידי העור לנקב (דמויות 1B ו- 1 C)13-16, 23<ol>
<li>תנגב את טיפת הדם עם כרית גזה הראשון כי זה עשוי להכיל רקמת עודף נוזלים. עיסוי את האצבע שוב כדי להגביר את זרימת הדם החדירה. העברת הטיפה הבאה לאחד החוגים של כרטיס מסנן מבלי לגעת במשטח ישירות עם קצה האצבע. לאפשר לדם להיות שנספג לתוך המרקם של המסנן על-ידי כוחות נימי בלבד.</li>
		<li>תן משלוח גדול הבאה של נימי דם טופס בקצה האצבע ולאסוף אותו במעגל הבא. המשך הליך זה עד כל החוגים הדרושים מלאים או מפסיקה זרימת הדם.</li>
		<li>אל תלחץ או "לחלוב" את האצבע יתר על המידה אם זרימת הדם אינה מספיקה כדי למלא את כל העיגולים הנדרש של הכרטיס מסנן. אם זרימת הדם נפסק להניח תחבושת על קצה האצבע. לבצע ניקוב העור השני על אצבע נוספת אם עוד דם יש צורך בבדיקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ייבוש של כתמי דם
<ol><li>כדי לייבש את כתמי דם, לשים את המסנן כרטיסים על נייר נקי המגבת בארון הבטיחות הביולוגי ולתת להם יבשה, רצוי O/N (אבל לפחות 4 שעות), ב- RT, בהעדר כל מקור חיצוני של חום. כאשר תהליך הייבוש, כתמי דם יש צבע חום כהה אחיד אין אזורים אדומים גלויים יותר (איור 1D)13, 15, 16.</li>
</ol>4. אחסון והובלה של כתמי דם מיובשים (DBS)
הערה: עיבוד של הדם יכול להיות מופרע לאחר הייבוש. הקלפים מסנן עכשיו יכול להיות מאוחסנת13-16, 23.
<ol><li>לאחסון, לשים את כרטיס נייר סינון בשקית רוכסן גז-אטום בודד, המכיל 1-2 שקיות סופג לחות כדי להגן על דגימות מפני לחות (איור 1E). לחלופין, הוסף כרטיס אינדיקטור לחות.</li>
	<li>להעביר את התיק הזה מקפיא עם טמפרטורת-20 ° C או נמוך ככל האפשר. אם מקפיאים אינם זמינים תחת תנאי המגרש, אחסון ב-4 ° C או אפילו בטמפרטורת החדר הוא ריאלי עד 14 ימים.</li>
	<li>תחבורה דגימות DBS קפוא בקרח יבש. עבור כרטיסי מסנן בתחילה לשמור בטמפרטורת החדר, השתמש מערכת אריזה משולשת, אשר מורכב של רוכסן bag(s) את container(s) הפנימית, וכן הפנימית של מעטפה החיצוני. ללא סימונים תוכן נדרש על המעטפה החיצונית למשלוח בדואר רגיל, אבל חייב להיות מוצמדת הסמל הבינלאומי הביולוגי המיכל הפנימי הראשי16.</li>
	<li>אל תכלול את הקלפים מסנן עיבוד נוסף אם את ערכות סופג לחות ו/או את הכרטיס אינדיקטור לחות נוספים משתנה צבע ורוד.</li>
</ol>5. • תנאי של דם יבש יבחין13, 15, 16, 23
<ol><li>אגרוף החוצה במקום אחד עם התקן לשימוש יחיד 6 מ מ מ כל מעגל צמאת דם של הכרטיס מסנן 903 כיתה (איור 1F). העברת כל אגרוף כתמי דם מיובשים מחולה בודד כדי באר אחת של צלחת 12-. טוב.</li>
	<li>למלא את הבאר עם תמיסת מלח באגירה פוספט המכילה 0.05% Tween 20 ו- 0.08% אזיד הנתרן (איור 1 ג'י). להתאים את עוצמת הקול של מאגר נוסף לדרישות המתאימות מינימלי של וזמינותו משמש לאחר מכן ניתוח של eluates נקודות דם יבש.</li>
	<li>חזור על שלבים אלה כדי לקבל סדרה שניה של eluates ספוט דם יבש על מנת לבצע ניתוח מולקולרית.</li>
	<li>לשים את הצלחת תרבות תא מטרף מעבדה ולתת את כתמי דם מיובשים מנוקב בעדינות elute לקבוצות של 4 שעה או, עדיף, O/N (איור 1 H).</li>
	<li>למחרת, המקומות הם כמעט ללא דם, supernatants היילוד יצרו (איור 1I). להעביר את eluates האלה microcentrifuge צינורות. לאחר מכן, מעמיד אותם בפני צנטריפוגה למשך 2 דקות ב g 10,500 x (איור 1J) כדי לשחרר את supernatants מפני כל פסולת שנפער במהלך • תנאי (איור 1 K).</li>
</ol>6. ניתוח של Eluates
<ol><li>Centrifuged eluates מוכנים כעת לשמש עבור הניתוחים המיועד. לחקור את eluates עבור סמנים של וירוס הפטיטיס B, הפטיטיס C וירוס הידבקות ב- HIV באמצעות ערכות זמינים מסחרית ובצע את ההוראות היצרנים המתאימים היטב (איור 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> איור 1. סיכום גרפי של הפרוטוקול המוצע תקשורת זו הכנה ועיבוד של כתמי דם מיובשים לשמש immunoassays ועל ידי טכניקות מולקולריות. דם כל ורידים, נימי דם מתקבל על-ידי venipuncture או ניקוב של העור על ידי מנתחים (א) עשויה לשמש דגימות לבדיקה ספוט דם יבש. לאחר העברת הדם החוגים של כרטיס מסנן 903 כיתה (B, C), הדגימות צריך להיות מיובש רצוי O/N בטמפרטורת הסביבה בבטיחות הביולוגי בארון כדי טופס כתמים של צבע חום אחיד ללא כל interspersion של אדום אזורים (D). בעת הייבוש של הדם מציע, אחסון הצורך, הקלפים מסנן יכול להיות ארוז בתוך שקיות רוכסן גז-אטום המכיל 1-2 שקיות סופג לחות (E). עיבוד מעבדה נוספות DBS מהווים את הדור של אגרופים על ידי מכשיר אחד 6 מ מ מן המרכז של העיגולים (F, G), • תנאי של העקיצות ב מאגר מבוסס-PBS לקבוצות של 4 שעה או, עדיף, O/N במטרף (H ), ההתאוששות של eluates (אני), ולבסוף צנטריפוגה גביעים מעבדה (J) כדי לשחרר את eluates DBS מפני כל פסולת שמקורה עלול במהלך התהליך • תנאי (K). לאחר מכן, eluates DBS מוכנים עבור ניתוחים, אשר נערכו על ידי פלטפורמה אוטומטית לחלוטין (L) על מנת לזהות סמנים סרולוגית של HBV, בזכות ו- HIV זיהומים, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

בעבר, RSR קיבל מענק כבוד להעברת הרצאות, תמיכה כספית עבור עבודתו המדעית של אבוט אבחון. NG ואום מצהירים שאין להם שום אינטרסים סותרים.

DBS שימשו במשך 100 שנים2 , אבל, למרבה ההפתעה, יש עדיין אין הסכמה כללית לגבי הכנה ועיבוד שלהם. עד כה, האחדה מספיקות של שלב טרום אנליטי חשוב זה רק הושגה בתחום של היילוד ההקרנה14, ואילו במגוון של פרוטוקולים שונים קיימת עבור כל היישומים האחרים של DBS בדיקה5, 16, 23. כדי להתגבר על הטרוגניות המדהימה הזו, הוא הוראה צעד אחר צעד מקיפים להכנה של עיבוד DBS כדי להיות מנוצל immunoassays ועל ידי טכניקות מולקולריות שהוצגו בתקשורת זו, ביחס יעילותו זיהוי סמנים של HBV, בזכות דלקות HIV. מוקד הדיון הבא מושם בעיקר על השלבים השונים של הפרוטוקול המוצע.
בהיסטוריה של DBS בדיקות רבות נייר סינון שונות כרטיסי היו בשימוש2 אבל רק היום שני מקורות מסחריים אושרו על ידי ה-FDA כמו class II ומכשור רפואי עבור הדם אוסף5, 16. מערכות אלו כרטיס מסנן מאוד אחידה, יש מאפיינים דומים מאוד הקליטה כך התוצאות האנליטיות המתקבל נימי דם שהוכנו על אף אחד מהם לא שונות על ידי יותר מ- 4% – 5%28. באופן לא מפתיע, Masciotra ועמיתים29 ולכן זוהה RNA HIV-1 מידה עם assay איכותי לאחר • תנאי מן הדם אוסף קלפים ממקורות שונים. לאור נתונים אלה, זה יכול להיות כמעט לא נכלל כי כל אחד הסתירות הקיימות בעת בדיקות בשילוב סרום/DBS זוגות של סמני של HBV, בזכות, HIV זיהומים17 נגרם על ידי הבחירה של הכרטיס מסנן לבד. עם זאת, כאשר כימות מדויק של analyte הכרחי, וריאציית המקור-כדי-מקור עשויים להיות לא זניח וניקב טכניקות מתוחכמות יותר, למשל, DBS (PDBS) כשיטה microsampling30 או הכנה המקומות סרום מיובשים (DSS)31 ייתכן שתחול במקום DBS הקונבנציונלית בדיקות10.
מאז רק כמויות קטנות של דם משמשים DBS בדיקות (טיפה אחת של דם קפילרי מורכב µl כ-50)5, 16, וריאציות באמצעי האחסון מדגם מכריעים ובבית, אמנם, לפחות לחלק בין תוצאות סרולוגית של המשתתף דיווח עצמי HBV ומצב בזכות שנרשם במהלך הטיס "המחקר דרוק" הם לייחס משתנה זה. הגורם החשוב ביותר יחיד עבור מזעור "תנודות" של אמצעי האחסון מדגם הוא ללא ספק טכניקה נכונה של אוסף נימי דם, אשר יכולה להיות מושגת רק על ידי הכשרה זהיר ומתמשכת של הסגל הטכני22. יתרה מזאת, כאמצעי של בקרת איכות, כל המעבדות עובד עם DBS צריך כבר יזמו הנהלים לזיהוי, לאחר מכן למעט דגימות DBS צריך להיחשב חוקיים משביע רצון או16.
מחקרים שנערכו בעיקר בהקשר של HIV32 ו ההקרנה היילוד33 הראו כי לחות גבוהה עלולה להוביל הפירוק של analytes, אבל עד כה אין הסכמה הושגה לגבי שאלת כמה זמן DBS צריך להיות אוויר יבש . מרווח זמן לפחות 4 שעה או רצוי O/N מוצע זה תקשורת, שאימצו לכן את התנאים שבהם נהגו ברוב המכריע של כל הפרסומים רלוונטית32, 34 נתונים על אחסון של DBS, לאחר מכן ניתן להשתמש עבור HBV ו בזכות בדיקות מתנגשים. בשנת 1981, וילה ועמיתים35, מי שנרשם עכשוויים בשיטות אנליטיות, דיווחו כי אחסון ב- RT לא השפיע על התוצאות של HBV ניתוחים במהלך כל תצפית של 180 ימים אם היו נוגדנים titers > 1/1000, אבל זה DBS הפכה גבולי-חיובית או שלילית אפילו לאחר 15 ימים כאשר titers בנסיוב היו רק 1/100. אחסון-20 ° C או 4 ° C לא לגרום לשיפור משמעותי. לעומת זאת, במחקר שנערך שלושים שנה מאוחר יותר36 נבדק ושכפול של מדגם HBV חיובי, ומצא המחברים את anti-HBc כמו גם נוגדנים anti-HBs היו יציבים עד 183 ימים ב- RT, ואילו HBsAg מתחת לאותם התנאים הפך false-שלילי כבר אחרי 63 ימים. לגבי זיהוי HBV DNA מ- DBS eluates, ריכוז חומצות גרעין נגיפיות הייתה יציבה לפחות שבעה ימים ב- 37 ° C37 או הוכיח להיות "עמיד" אחסון ב- RT עד שלושה שבועות38. בדיקת נוגדנים בזכות באמצעות שני דור שלישי זמינים מסחרית immunoassays39 סיפק תוצאות מדויקות עבור תקופה של 117 ימים באמצעות דגימות DBS המאוחסנים ב-20 ° C, 2-8 ° C ו- 20 – 25 ° C, בהתאמה. אחסון ב-20 ° C, עם זאת, הביא הווריאציה הנמוך של צפיפות אופטית. החלת אנטי-בזכות של הדור הרביעי, אליסה, קרי, Monolisa בזכות-Ag-Ab-ULTRA, בהקשר של DBS בדיקות, Larrat. et al. 40 נצפתה ירידה חדה בירידה לפרטים אנליטי לאחר אחסון דגימות DBS במשך יותר משלושה ימים-RT. מצד שני, התקבלו תוצאות בדיקה מדויקת עם ערכת אותו ניצול דגימות שהופקדו למשך 60 ימים בתנאים שונים (-20 ° C, 2-8 ° C ו- 22 – 26 ° C) על ידי Brandao ועמיתים41. תצפיות על הירידה של RNA בזכות ריכוזים ב DBS בתנאים אחסון שונים בטווח של אין שינוי משמעותי ב RT עבור שנה אחת עד42 עד שינוי tenfold לאחר ארבעה שבועות-טמפרטורת הסביבה43. לוקחים את הנתונים הסותרים מעדיף על היציבות של HBV ו אנטיגנים בזכות, חומצות גרעין, נוגדנים בחשבון, נראה סביר לסגת בפרוטוקול המוצע להחלטה, אשר הוגדרה קודם לכן עבור האחסון של דגימות DBS שישמש עבור HIV בדיקות15, 30: עבור התצהיר לטווח קצר (עד שבועיים) אנטיגנים, חומצת גרעין נגיפיות, נוגדנים הם נחשבים יציבה-RT, ואילו האופטימלי אחסון לתקופות ארוכות על התנאים קפוא.
ככלל, שלושה פרמטרים שיש לשקול בעת תכנון פרוטוקול • תנאי: (1) המאגר • תנאי; (2) משך זמן וטמפרטורה של • תנאי; (3) • תנאי האחסון23. ברוב המכריע של כל הפרסומים רלוונטית באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) שימש eluting DBS, והוסיף הסופרים חלבון, למשל, אלבומין שור (BSA) או Tween 20, חומרים פעילי, שטח-על מנת לשפר את האות assay על-ידי ייצוב חלבונים, כמו שהם הולכים לתוך פתרון, מחייב שאינם ספציפיים בו זמנית חסימת אתרים23. רק כמה דוחות, אשר ישירות להשוות מאגרים שונים • תנאי בהקשר של בדיקות DBS, הינם זמינים. Villar. et al. 36, למשל, נרשם כמעט שוות ערך • תנאי קיבולות למאגרי כל שימוש, אלא PBS/BSA 0.5%, גרמו ברמה הנמוכה ביותר של תגובתיות שאינם ספציפיים. אבחנה דומה מאוד נעשתה על ידי כרום ועמיתים44 בשעת החלת את diluent הדגימה של rLAV גנטיקה מערכות EIA עבור • תנאי של נוגדנים בזכות מ- DBS. מאז הסיכון של מדגם השפלה היא מאוד נמוכה בשעות הראשונות לאחר הכנת DBS (ראה לעיל), הוחלט דגירה המקומות O/N בטמפרטורת החדר, כדי לתמוך בתהליך • תנאי על ידי ערבוב מעל קצה-עדין. גישה זו יש יתרון כי דגימות אגרוף הקודם יום ישירות יועברו שגרתית אבחון מוקדם הבא בבוקר23. צריך להיות מותאם היקף המאגר • תנאי הדרישות המתאימות מינימלי של מבחני המשמש ניתוחים הבאים על מנת לשמור את הגורם לדילול נמוך ככל האפשר. עם זאת, אופטימיזציה זהירה של התנאים • תנאי עבור כל analyte יחיד איננה אפשרית בהערכה הקודמת כי תפוקה גבוהה לדוגמה היה צריך להיות מובטחות תוך זמן קצר יחסית במהלך ה "דרוק לימוד"17. כתוצאה מכך, נפח שלילי למדי של 1,000 µl של מאגר מבוסס-PBS שימש כדי להשלים את התהליך כולו • תנאי עבור כל הפרמטרים של שתי פעולות נפרדות.
גישה זו אחד מצד אחד נכשל "לחלוטין במערכת anti-HBc/anti-HBs עבור אותם אנשים נגועים בנגיף ה-HIV עקב ריכוז נוגדן נמוכה; . זה נדרש הליכים ביולוגית מולקולרית עם רגישות אנליטי אופטימלי ביחס HBV DNA ו RNA בזכות בדיקות. " 17 מצד שני, אמצעי האחסון גבוה • תנאי הוכיחה להיות בשום אופן חסרון מצפני HBsAg בזכות, נגד HIV על ידי ערכות בשימוש בכל רחבי ההערכה. "זיהוי HBsAg חומרים חיוביים של דם מלא eluates הצליח עם רגישות של 98.6% במידה גבוהה באופן דומה כמו מחקרים קודמים, אשר השתמשה באופן חלקי נפח • תנאי קטן בהרבה של 100 µl, 250 µl, או 600 µl או 500 µl"17 ,36, 45, 46. הרגישות של 97.8% נקבע בחקירת זוגות סרום/DBS 179 עבור בזכות נוגדנים תאמו התוצאות שכבר קיימים דוחות24, 44, 47, 48, 49, אשר עבד עם אמצעי אחסון • תנאי זה היה נמוך פי 5 עד 10. "בנוסף, הפרוטוקולים לגילוי בזכות היה כבר כראוי ממוטב. מאת הקובעת נקודות ניתוק משלהם"17, 24, 48, 49 "או על-ידי הגברת אמצעי האחסון מדגם של 20 µl כדי 100 µl" בן 17, 49 . סוף סוף, ירידה לפרטים אנליטי רגישות (100% כל אחת) הוקמה לגילוי HIV אנטי היו שווה או גבוהה ממנו מאפייני ביצועים של אחרים immunoassays המותאמים במיוחד DBS בדיקות50, 51 "או של stepwise נוהל עם השימוש בשילוב של מספר בדיקות האיידס"17,52. "הם, אכן, גם חריגה תיעוד ביצועים assay זה היה מיוחד פותחה, ממוטב עבור זיהוי נוגדנים נגד HIV ב DBS eluates (Q-למנוע HIV 1 + 2 מקיט DBS)." 17, 53  
יחדיו, את הפרוטוקול צעד אחר צעד מקיף שהוצגו בתקשורת זו התבררה כלי ידידותי למשתמש ריאלי הכנה ועיבוד DBS ואת, לכן, ניתן להשתמש בצורה אמינה וירולוגיה אבחון. זה מאפשר גישות באמצעות אוטומציה 54 , בשל מאפייניו ביצועים מצוינים יש פוטנציאל לשמש סוג של אבן-היסוד עבור פרוטוקול בעתיד הסכמה כללית מקובלת בתחום הגלובלי DBS בדיקות מעבדה הרפואה.

הרעיון של שימוש בדם הנאסף על כרטיס נייר המיוצר מצלולוזה המיוחס איוור הנוצרית באנג (1869 – 1918), אביו של microanalysis קליניים מודרניים1, 2. בשנת 1913, באנג נקבע גלוקוז מן eluates של דם יבש כתמים (DBS)3 , ולאחר מכן גם לבצע מדידות חנקן בשיטת סטריליזציה עם טכניקה זו נייר סינון2. כתוצאה מכך, מספר חוקרים דיווחו על שימוש DBS בדיקה סרולוגית לאבחון עגבת2. כפי מוקדם כמו 1924, צ'פמן לסכם את היתרונות של בדיקות DBS כאשר הוא במיוחד הדגיש ארבעה פריטים, אשר עדיין תקפות היום: (1) venipuncture בהשוואה לקונבנציונלי, פחות נפח הדם נדרש, עובדה זו היה חשוב ביותר ברפואת ילדים אבחון; (2) איסוף דם הוא פשוט, שאינו פולשני, וזולה; (3) את הסיכון של זיהום חיידקי או המוליזה הוא מינימלי; DBS (4) יכול להישמר במשך תקופות ארוכות עם כמעט ללא התדרדרות של analytes2, 4. מלבד השימוש בו בדיקות לסיפיליס, יישומים מוקדם נוסף של הטכניקה DBS כלול, למשל, זיהוי נוגדנים נגד חצבת, חזרת, poliovirus, parainfluenza וירוס, וירוס נשימתי syncytial (RSV) 19532, זיהוי שיגלה בצואה יבש על גבי נייר סינון ונשלח בדואר רגיל מאינדונזיה ליידן בהולנד, כמו גם את הזיהוי של נוגדנים עלקת הבילהרציה ב DBS שצולמו באזורים אנדמיים וניתח יותר משלושה חודשים מאוחר יותר5 . בשנת 1963, כחמישים שנה לאחר באנג של המקורי תקשורת2, 6, גאת'רי סוף סוף לאור השיטה המפורסמת שלו לאבחון של פנילקטונוריה מ- DBS מתקבל על ידי שמוק העקב ילודים7, 8.
אמנם מאותו זמן ואילך, DBS נחשבו כמו שיטה ישימה כלל איסוף, אחסון, שינוע, וניתוח מגוון של נוזלי הגוף האנושי5, השימוש בתוכנית האבחון עדיין נותרה התמקדו בעיקר האבחנה של דלקות במיוחד הגדרות משאב מוגבל של ההקרנה שיטתית של ילודים עבור הפרעות מטבוליות תורשתיות במשך עשרות שנים9, 10. מאז 2005, עם זאת, מגוון יישומים DBS חדשים וחדשניים החלו להסתמן. כתוצאה מכך גידול מעריכי כמעט מספר בהתאמה פרסומים מדעיים-DBS מ כ-50 450-כמעט מדי שנה בזמן הנוכחי. בין היישומים המתעוררים הם בתחומים מגוונים כגון: toxico - ו לימודי פרמוקוקינטיים, פרופיל מטבולי, סמים טיפולית ניטור, טוקסיקולוגיה משפטית או זיהום סביבתי שליטה10, 11.
DBS בדיקות, ובכך, הפך מצעד הניצחון דרך לאבחון קליני מעבדתי במהלך 100 שנים2. כמו כימיה קלינית, רפואית12, עם זאת, במהלך חודש מרץ הזה משתנים מראש אנליטית לא שלמאחה נחשבו במשך שנים רבות. אכן, אפילו היום, לאחר פעילויות כגון הנודע של ה-CDC נייר סינון הערכת פרויקט13 או ניסוח ברמה הלאומית לאיסוף דם על נייר סינון במסגרת של היילוד הקרנת14, שלב טרום אנליטית הוא עדיין במידה רבה שאינטליגנציה רוב השדות האחרים, בהם בדיקות DBS הוא יישומית5, 10.
לאור רקע זה, פרוטוקולים מקיפה שלב אחר שלב14-16 עבור שימוש ב- immunoassays וב -טכניקות מולקולריות, אשר מכסה את כל השלבים החיוניים, הוא הציע הכנה ועיבוד DBS בתקשורת הבאות: (1) אוסף של דם; (2) הכנת כתמי דם; (3) ייבוש של כתמי דם; (4) אחסון והובלה (5) • תנאי של DBS; סוף סוף (6) ניתוחים של DBS eluates. היעילות של הפרוטוקול הוערך קודם עם זוגות 1,762 בשילוב סרום/DBS לזיהוי צהבת B וירוס (HBV) האנטיגנים (HBsAg), נוגדנים ל- HBV core אנטיגן (anti-HBc) נוגדנים אנטיגן פני השטח HBV (anti-HBs), HBV DNA, נוגדנים לנגיף הפטיטיס C (בזכות) (בזכות), בזכות RNA, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) 1-p24-אנטיגן/אנטי-HIV 1/2 באמצעות פלטפורמה אוטומטית לחלוטין או חומצת גרעין איכותי רגיש בדיקות. 17. בשלב השני, הפרוטוקול היה מנוצל מחקר פיילוט "סמים, כרונית המחלות הזיהומיות" ("מחקר דרוק") אשר נערך על ידי רוברט קוך-המכון בשיתוף פעולה הדוק עם המרכז הארצי בהפניה הפטיטיס c על פעיל משתמשי סמים בערים גרמניות של ברלין, אסן18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

הרעיון של איסוף דם על כרטיס נייר ולאחר מכן באמצעות נקודות דם יבש (DBS) למטרות אבחון מקורו לפני מאה שנה. מאז, DBS בדיקות במשך עשרות שנים התאפיין בעיקר ממוקדת על האבחון של מחלות זיהומיות במיוחד בהגדרות משאב מוגבל או שיטתית ההקרנה של ילודים עבור הפרעות מטבוליות תורשתיות ורק לאחרונה יש מגוון רחב של חדשים וחדשניים DBS יישומים החלה להסתמן. במשך שנים רבות, משתנים מראש אנליטי נחשבו רק באופן בלתי הולם בתחום של בדיקות DBS, אפילו היום, למעט היילוד הקרנה, שלב טרום אנליטי כולו, אשר כוללת ההכנה ועיבוד של DBS עבור שלהם ניתוח סופי אינה אחידה. לאור רקע זה, פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, אשר מכסה al השלבים החיוניים, הוא הציע, קרי, אוסף של דם; הכנת כתמי דם; ייבוש של כתמי דם; אחסון והובלה של DBS; • תנאי של DBS, ולבסוף ניתוח של DBS eluates. היעילות של פרוטוקול זה הוערך קודם עם זוגות 1,762 בשילוב סרום/DBS לזיהוי סמנים של וירוס הפטיטיס B, הפטיטיס C וירוס זיהומים וירוס הכשל החיסוני האנושי על פלטפורמת אנליטי אוטומטית. בשלב השני, הפרוטוקול היה מנוצל במהלך מחקר פיילוט, אשר נערך על המשתמשים פעילים בערים הגרמנית ברלין, אסן.

היעילות של הפרוטוקול הציע הכנה, עיבוד של DBS הוערך לראשונה על-ידי ניתוח 1,762 בשילוב סרום/DBS זוגות עבור סמני דלקת HBV, בזכות ו- HIV. 17. למטרה זו, DBS הוכנו מ 100 µl דם מהוורידים לגמרי (cf. נקודות 2.1.1 – 2.1.6 בפרוטוקול הקודם), היו eluted עם 1,000 µl של PBS מבוססי מאגר, כל אחד, (cf. נקודות 5.1 – 5.5 לפרוטוקול הנ ל) כדי להשלים את התהליך עבור כל הפרמטרים שבע שתי פעולות נפרדות. גישה כזו בלי אופטימיזציה זהירה של התנאים • תנאי עבור כל analyte יחיד נראה בלתי נמנע כי תפוקה גבוהה למדי מדגם היה צפוי תוך זמן קצר יחסית במהלך המחקר השדה הקרובה "סמים, כרונית מחלות זיהומיות"("מחקר דרוק").
כל המדידות דבקה המלצות היצרן במהלך ניתוח DBS, אבל היה צריך להיות שונה ביחס האישושים HBsAg ו- anti-HBs לפצות גם את ההשפעה של המוליזה או התוצאה של דילול. עם ערך ניתוק של 0.05 IU/ml, HBsAg בדיקה של eluates DBS להוביל בשיעור של false-תוצאות חיוביות של 14.7% (52 מתוך 354) בהשוואה ל הסרום דגימות (איור 2 א). מקלט ההפעלה אופיינית (ROC) ניתוח25, 26 של הנתונים ציינו כי גידול של הסף כדי 0.15 IU/ml כתוצאה פרידה אידיאלי של תוצאות חיוביות-HBsAg HBsAg שלילי (פרטית 0.986 [רגישות], 0.000 [1-ירידה לפרטים], איור 2B). מצד שני, עם ניתוק של 10 IU/l על כימות של anti-HBs נוגדנים שיעור של מדידות שווא-שלילי של 14.2% (47 מתוך 331) היה מוקלט (איור 2C). לפיכך, בעקבות ניתוח ROC שוב, זה ניתוק הונמך אל 1.5 IU/l כדי להשיג על אפליה אופטימלית של ערכים (0.917 [רגישות], 0.007 [1-ירידה לפרטים], איור דו-ממדי).
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> איור 2- HBsAg ו anti-HBs בדיקות eluates DBS (שונה מ-17). העלייה מונחה ROC של הערך ניתוק על כימות HBsAg מ 0.05 IU/ml (א) כדי 0.15 IU/ml (ב) מופחת הקצב של תוצאות חיוביות שגויות של 14.7% ל- 0%. באופן דומה, ROC ניתוח של anti-HBs ריכוזים הציע ירידה של סף בהתאמה מ 10 IU/l (C) ל 1.5 IU/l (D), ובכך לחלוטין סילוק חסימות יתר, אשר היוו בתחילה 14.2% האישושים כל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
התוצאות של הבדיקות בשילוב סרום/DBS מסוכמים בטבלה 117. אין ללא ירידה לפרטים הוקלט במהלך DBS בדיקה עבור כל אחד analytes 7.
כאשר DBS eluates נחקרו לנוכחות של HBsAg, א א הפרמטר מפתח סרולוגית לזיהום אקוטי וכרוני עם HBV, רגישות אנליטית של 98.6% נקבע. HBsAg ריכוזים ב sera שקרית-שלילי שני היו 749 IU/ml ו 6 IU/ml, בהתאמה. נוגדנים anti-HBc אותרו בהצלחה 176 מתוך 204 (א e 86.3%) DBS eluates. . עשרים ושתיים מתוך 28 דגימות אשר לא אותרו על ידי המדידות שמקורם יחידים שיתוף נגועים בנגיף ה-HIV לפיכך, אם אנשים HIV חיובי לא נכללו בחישוב, רגישות של 97.1% הושג לאחזור נוגדנים anti-HBc מדם ורידי לגמרי יבש eluted. דומות תצפיות שנערך לגבי הקביעה של נוגדנים anti-HBs. אפילו לאחר השינוי של הערך ניתוק של וזמינותו כדי 1.5 IU/l, 9 תוצאות DBS סרום discrepant אירעה. החולים לא שותף נגוע ב- HIV, נמצאו ריכוזים anti-HBs סרום של 11-26 IU/l אשר היו נמוך מדי כדי לאפשר זיהוי לאחר • תנאי של הדם היבש.
בזכות נוגדנים מעידים על או זיהום אקוטי או כרוני או נפתרה. רק ארבע תוצאות בזכות התחזות-שלילי (א א 2.2%) נקבעו מ- DBS eluates והפגינו עוד ניתוחים סרולוגית ומולקולרית בבירור sera המתאימים מאוד בטח צולמו מחולים, זיהומים אשר היה מזמן נפתר.
זיהוי נוגדנים נגד HIV ב DBS eluates עם מערכת אוטומטית לחלוטין היה תהליך חלקים לחלוטין אשר הניב של רגישות אנליטית של 100%.
"רשע HBV DNA ריכוז של דם מלא eluates בוצעה 100 דגימות (כלומר DNA ריכוז: 1,573,898 IU/ml, טווח: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) ונכנעתי ערך של 93.0%. לפיכך, שבע דגימות עם סרום נמוך ריכוזים HBV DNA בין 409 3,643 IU/ml לא זוהו ע DBS בדיקות. של sera 100 אשר הוכיחה להיות בזכות RNA חיוביות (כלומר RNA בזכות ריכוז: 1,415,944 IU/ml, טווח: 2,479 - > 7,692,000 IU/ml), המקביל aliquots דם היו זמינות. החקירה השוואתי כתוצאה רגישות אנליטית של 100% עבור בזכות RNA האישושים מ- DBS eluates." 17
כדי לבדוק פרוטוקול מחולקת לרמות עבור הכנת ועיבוד DBS בתנאי שדה, היא שימשה בשיתוף פעולה הדוק עם רוברט קוך-המכון (ברלין, גרמניה) במהלך שלב פיילוט של המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות", אשר היה ניצח על המשתמשים פעילים בערים גרמניות של ברלין, אסן18. כל 534 המשתתפים נרשם (433 גברים ונשים 101) עברה נימי דם הדגימה כמתואר בפירוט בסעיפים 2.2.1 – 2.2.3 של פרוטוקול הקודמים, ו DBS היו, eluted שוב, על ידי תוספת של 1,000 µl של מאגר מבוסס-PBS.
שני אנשים אובחנו באופן כרוני נגוע HBV, 39 הראה את התבנית סרולוגית לזיהום HBV נפתרה. יתר על כן, משתתפים 15 היו חיוביים עבור anti-HBs (מעמד לאחר החיסון), שמונה נמצאו חיוביים עבור anti-HBc לבד. בזכות השכיחות בין המשתתפים היה 57.3% (N = 193) בברלין וב 73.0% (N = 144) ב Essen. מ. יבויחה הנוגדן דגימות 65% (N = 125), 62% (N = 89) היו גם viremic. עשרים וחמש אנשים 534 חיובית ל- HIV אנטי. 19 של דלקות כבר היו ידועות, 24 אנשים אלה היו שיתוף נגועים בזכות.
התוצאות המתקבלות על-ידי בדיקת DBS הושוו בזהירות עם נתונים anamnestic של המשתתפים במחקר לגבי המצב HBV ו בזכות דיווח עצמי. השוואה זו בשילוב עם תוצאות בדיקות בשילוב סרום/DBS זוגות הוביל שינויים מזעריים של אלגוריתם הבדיקה עבור השלב העיקרי של "דרוק המחקר", אשר יכולים? להכליל את משתמשי סמים פעילים שש ערים גרמניות גדולות נוספות: "יחידים נגוע ב- HIV ייבדק תמיד נוכחות של HBV DNA. המשתתפים אשר eluates DBS הן חיוביות anti-HBc או anti-HBs צריך יהיה נתון venipuncture בפגישת ייעוץ השני להבהרת בהחלט מצב anti-HBc/anti-HBs שלהם, בסופו של דבר, כל eluates DBS יוקרן עבור בזכות RNA משנה התוצאות של בדיקות בזכות". 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>פרמטרים</td>
			<td>סרה בשילוב/DBS eluates (N)</td>
			<td>תוצאות discrepant (N)</td>
			<td>סיבת אי-ההתאמות בין בדיקת סרום ו DBS eluates</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>שני חולים עם דלקת כרונית של HBV. שניהם היו תחת טיפול אנטי-ויראלי, אחד מהם היה שיתוף נגועים ב- HIV. ריכוזי HBsAg בסרום: 749 IU/ml ו- 6 IU/ml, בהתאמה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>בנסיוב, עשרים ושתיים חולים היה זיהום HBV נפתרה. שישה הוכיחו את מציאת סרולוגית "anti-HBc לבד". עשרים ושתיים של המטופלים היו שיתוף נגועים ב- HIV. מ- "מפענחים HBV," עשרים היו העריך כמו "anti-HBs חיובי לבד' על-ידי בדיקת DBS ו, לכן, באופן כוזב סווגו"מצב לאחר החיסון".</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBs.</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>ארבעת המטופלים לא שותף נגוע ב- HIV היה סרום anti-HBs ריכוזי אלקטרוני 11 26 IU/l, אשר היו נמוך מדי כדי לאפשר זיהוי נוגדנים לאחר • תנאי נקודות דם יבש.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>שרה בהתאמה היה הושגו מן שבעה חולים עם ריכוזים HBV DNA בסרום נמוכה ועד 409 IU/ml 3,643 IU/ml.</td>
		</tr>
<tr>
<td>בזכות</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>בזכות</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>אלה ארבעה סרה שנלקח חולים, עם זמן מאז נפתרה בזכות זיהומים.</td>
		</tr>
<tr>
<td>בזכות ה-RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/HIV נגד 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: התוצאות המתקבלות מ- DBS 1,762, אשר היו מוכנים ומעובדים מפני הבאות דם ורידי כל הפרוטוקול המוצע תקשורת זו, לעומת הממצאים בדגימות בשילוב סרום כנקודת התייחסות.

Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

הכנת ועיבוד של כתמי דם מיובשים (DBS) לניתוח הסופי שלהם מתוקננים עדיין גרוע עבור מרבית היישומים אבחון. כדי להתגבר על זה חסרון, פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף הציע, לאחר מכן הערכה לגבי יעילותו לזיהוי סמנים של זיהומים וירליים.

כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- Immunoassays וב -טכניקות מולקולריות

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

dried-blood-spots-preparing-processing-for-use-immunoassays-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

39.4K Views.  University of Duisburg-Essen. הכנת ועיבוד של כתמי דם מיובשים (DBS) לניתוח הסופי שלהם מתוקננים עדיין גרוע עבור מרבית היישומים אבחון. כדי להתגבר על זה חסרון, פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף הציע, לאחר מכן הערכה לגבי יעילותו לזיהוי סמנים של זיהומים וירליים.

Video: Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

בדיקה Microfluidic: מבצע ושימוש לעיבוד Surface לוקליזציה

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

טכניקות דגימת דם ללא מסוף בגינאה חזירים

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

האסיפה והיישום של &#39;טבעות Shear&#39;: מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...