Bu iletişim Viroloji günlük17 Creative Commons Attribution License (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) BioMed Central ile şartları altında açık erişim modunda daha önce yayınlanan sonuçlarına dayanarak bir Lisans Alan. Yazarlar minnetle "Uyuşturucu ve kronik enfeksiyon hastalıkları" ("DRUCK çalışma") U. Marcus, W. Cai, W. Zhang ve R. Zimmermann üzerinden Robert Koch-Enstitüsü (Berlin, Almanya) çalışma pilot verimli işbirliği çerçevesinde kabul ve düzeltme için monte şekil 1 de ö. F. Whybrew, doktora, (Göttingen, Almanya) olarak fotoğraf çekmek için S. Moyrer için müteşekkir olan el yazması. Ayrıca J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. yüksek, ı. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, becerikli teknik yardım için takdirlerini ifade M. Schröter ve K. Seidel. Bu çalışmada kısmen hepatit c için vermek için sağlık Ulusal başvuru merkezine Alman Bakanlığı tarafından desteklenmiştir

Protokol tıbbi teşhis kullanılmak üzere tasarlanmış olduğundan, uygulama Helsinki Bildirgesi19ilkeleri takip gerekir. Sonuçları bu iletişimde sunulan ilk bölümü için hem hastalar tarafından ayrı bir anlaşma ve bir Etik Komitesi tarafından onaylandıktan iki nedenden dolayı gereksiz gibi görünüyordu: (1) "üzerine kabul" Essen Üniversitesi Hastanesi, "sağlar her hasta için yazılı izni tüm gerekli biyokimyasal, bakteriyolojik ve virolojik İncelemeler için." 17 (2) "DBS test değerlendirme kullanılan tüm örneklerini Enstitüsü Viroloji rutin klinik tanı sürecinde gönderildi. Böylece, özellikle çalışma amacıyla toplanan örneklerin hiçbiri değil tek bir ek iz gerçekleştirilmiş ve malzemelerin hiçbiri normal sırasında hekimler tarafından gerekli olanlar dışında herhangi bir parametre için test edildi Tanılama iş-up." 17 "Uyuşturucu ve kronik enfeksiyon hastalıkları" (çalışma DRUCK")18DBS test sonunda Alman şehirleri Berlin ve Essen aktif uyuşturucu enjekte insanlar değerlendirmek için kullanıldığı, çalışma tarafından veri Federal Komiseri kabul edildi Koruma ve özgürlük bilgi (Berlin, Almanya) ve de Tıp Üniversitesi Charité (Berlin, Almanya) Etik Komitesi gibi.
1. kan toplanması
<ol><li>İz14, 15, 20, 21<ol>
<li>Tek kullanımlık lateks lastik eldiven takmışım ve bir uygun dezenfektan, örneğin, % 70 izopropil alkol ile amaçlanan ponksiyon sitenin (tercihen medyan kübital ven kolundaki fossa) alan temiz.</li>
		<li>Sargı bezi 4-6 santim üzerinden sözde ponksiyon damarları distend siteye uygulanır. Hastanın damar içine iğne rehberlik ve bir kez o yerde, bir antikoagülan olarak EDTA içeren bağlı kan tüpü yavaşça doldurun.</li>
		<li>İz tam olduğu gibi Turnikeyi serbest bırakmak ve iğne çekilme. Sonra bir kuru gazlı bez yastık yerde bir bandaj tarafından daha sonra yapılacak ponksiyon sitede tuşuna basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cilt ponksiyon (şekil 1A)13-15, 20, 22, 23<ol>
<li>Bir çift tek kullanımlık lateks lastik eldiven koymak.</li>
		<li>Cilt delik önce hasta seçtiğin bu kullanıcı eller sıcak. Parmak masaj anterogradely kan akımı doğru site kestiği zenginleştirin var.</li>
		<li>İpucu distal falanks üçüncü veya dördüncü parmak bir uygun dezenfektan, örneğin, % 70 izopropil alkol sigara yazma el palmar tarafında deri temiz. Cilt tarafından tek kullanımlık Emanet lanset delik. Parmak yerçekimi parmak ucu kan toplanmasını kolaylaştırır böyle bir konumda tutulmalıdır.</li>
		<li>Cilt ponksiyon tarafından kapiller kan toplama işleminiz bittiğinde, bir bandaj parmak ucu yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kan lekeleri hazırlanması
<ol><li>İz15 tarafından toplanan kan gelen hazırlık<ol>
<li>Toplanan anti-pıhtılaşmış (EDTA) bütün Venöz kan filtre kartlarında en kısa zamanda nokta. Kurumuş kan lekeleri 24 saat daha fazla iz sonra hazırlamak değil.</li>
		<li>Tüm bilgileri gerekli hasta tanımlanması için filtre karttan. Bir kart sadece tek bir kişinin kanı ile görmüş gerekirdi.</li>
		<li>Tek kullanımlık lateks lastik eldiven takmışım.</li>
		<li>Kan toplama tüp 2-4 kez yavaşça tersine çevirin ve daha sonra tıpa dikkatlice açın.</li>
		<li>Bütün Venöz kan bir pipet ile tek kullanımlık bir ucu kullanarak 50 µl Aspire edin. Kan filtre kağıt pipet ucu ile doğrudan temas etmeden bir dairenin Center'a aktarın. Tam daire emdirmek çalışın.</li>
		<li>Kartın tüm gerekli Çemberleri doldurmak için bu yordamı yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazırlık kandan cilt tarafından toplanan (rakamlar 1B ve 1 C)13-16, 23 ponksiyon<ol>
<li>Aşırı doku sıvılarının içerebileceğinden ilk damla kan ile bir gazlı bez yastık yok etmek. Tekrar ponksiyon sitesinde kan akışını arttırmak için parmak masaj. Aşağıdaki açılan bir filtre kartı dairelerin birine parmak ucu doğrudan yüzeyle temas etmeden aktarın. Kan kılcal kuvvetler tarafından filtre doku batırılmış izin.</li>
		<li>Kılcal kan form üzerinde parmak ucu sonraki büyük damla izin ve sonraki çemberde toplamak. Bu yordam tüm gerekli Çemberleri dolu veya kan akışını durdurur kadar devam.</li>
		<li>Sıkmak veya "parmak aşırı kan akımı filtre kartı tüm gerekli Çemberleri doldurmak için yeterli değilse sağ" değil. Kan akışını durdurur, parmak ucunda bir bandaj koyun. Daha fazla kan sınav için gerekirse ikinci bir cilt ponksiyon başka bir parmağında gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kan lekeleri kurutma
<ol><li>Kan lekeleri kuru için tercihen O/N kartları temiz bir kağıt havlu bir biohazard güvenlik kabini ve onlara kuru, filtre koymak (en az 4 için gönderilen), RT ısı herhangi bir dış kaynak yokluğu. Kurutma işlemi tamamlandığında, düzgün koyu kahverengimsi renk kan lekeleri var ve hiç kırmızı alanı görülebilir (şekil 1 d)13, 15, 16.</li>
</ol>4. depolama ve nakliye için-kurumuş kan lekeleri (DBS)
Not: Kan lekeleri işlenmesi kuruduktan sonra durdurulabilir. Filtre kartları-ebilmek şimdi var olmak saklı13-16, 23.
<ol><li>Muhafazası için filtre kağıdı kartı örnekler (şekil 1E) nemden korumak için 1-2 nem alıcı paketler içeren bir tek, gaz geçirmez fermuarlı torbaya koyun. İsteğe bağlı olarak, bir nem göstergesi kartı ekleyin.</li>
	<li>Bu çanta bir dondurucu bir sıcaklığı-20 ° c ile transfer veya en kısa zamanda azaltmak. Dondurucular alan koşullar altında kullanılabilir değilse, depolama-4 ° C'de veya ortam sıcaklığında bile 14 gün için mümkün olabilir.</li>
	<li>Kuru buz dondurulmuş DBS numune taşıma. Başlangıçta ortam sıcaklığında muhafaza filtre kartları için fermuar bag(s) iç container(s) yanı sıra bir iç ve bir dış zarf oluşan bir üçlü paket yönetim sistemi kullanın. Hiçbir içerik işaretler normal posta yoluyla sevk irsaliyesi için dış zarfta gereklidir ama uluslararası biyolojik tehlike sembolü için birincil iç kapsayıcı16yapıştırılmış olmalıdır.</li>
	<li>Nem alıcı paketleri ve/veya ek nem göstergesi kartı için pembe bir renk değişirse daha fazla işleme filtre kartları hariç.</li>
</ol>5. elüsyon kurumuş kan,13, 15, 16, 23 Spotlar
<ol><li>Bir noktaya her kan içindeki daire sınıf 903 filtre kartı (şekil 1F) tek kullanımlık 6 mm aygıtıyla yumruk at. Transfer tüm 12-şey plaka bir kuyu kurumuş kan noktalar tek bir hastadan yumruk attı.</li>
	<li>Kuyu % 0.05 arası 20 ve %0,08 sodyum azid (şekil 1G) içeren serum fosfat tamponlu doldurun. Kurumuş kan lekeleri eluates daha sonraki analiz için kullanılan testin en az ilgili gereksinimleri için eklenen arabellek hacmi uyum.</li>
	<li>Kurumuş kan spot eluates ikinci bir dizi moleküler analizleri gerçekleştirmek için elde etmek için bu adımları yineleyin.</li>
	<li>Bir laboratuvar shaker hücre kültür plaka koymak ve yavaşça en az 4 saat boyunca elute delikli kurumuş kan lekeleri izin veya tercihen, O/N (şekil 1 H).</li>
	<li>Ertesi gün, noktalar kandan neredeyse ücretsiz ve hemolitik supernatants (şekil 1I) oluşturdular. Bu eluates microcentrifuge tüpler için transfer. O zaman, onları Santrifüjü 10.500 x g (şekil 1J) supernatants (şekil 1 K) elüsyon sırasında oluşmuş herhangi bir enkaz üzerinden ücretsiz için de 2 min için tabi.</li>
</ol>6. Eluates analizi
<ol><li>Centrifuged eluates şimdi amaçlanan çözümlemeler için kullanılmak üzere hazır. Eluates Hepatit B virüsü, hepatit C virüsü ve piyasada Kitleri kullanarak HIV enfeksiyonu işaretçileri için araştırmak ve ilgili üreticilerin yönergeleri dikkatle izleyin (şekil 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> Şekil 1. Protokolü'nün grafik Özet teklif hazırlama ve işleme kurumuş kan noktalar uzun ve moleküler teknikleri tarafından kullanılmak üzere bu iletişimde. Bütün Venöz kan ve kapiller kan iz ya da deri ponksiyon lanset(a)tarafından elde edilen kurumuş kan spot analiz için numune olarak hizmet verebilir. Kan bir sınıf 903 filtre kartı (B, C) daireler için aktarımdan sonra örnekleri tercihen O/N, ortam sıcaklığında bir biohazard güvenlik formu noktalar eşit olarak kahverengi bir renk kırmızı herhangi bir interspersion olmadan kabine kurutulmuş alanları (D). Ne zaman, kurutma kan lekeleri tamamlandığında ve depolama gereklidir filtre kartları 1 – 2 nem alıcı paketler (E) içeren gaz geçirmez fermuarlı torbalarda paketlenmiş olabilir. DBS, laboratuvar işleme daha fazla Daire (F, G), elüsyon PBS tabanlı arabellekte bir shaker (H üzerinde yumruklar en az 4 sa veya tercihen, O/N Merkezi'nden 6 mm tek aygıt tarafından yumruklar nesil oluşturan ), eluates (Ben) ve nihayet Santrifüjü laboratuvar bardak (DBS eluates (K) elüsyon işlemi sırasında ortaya çıkmış herhangi bir enkaz üzerinden ücretsiz için,J) kurtarma. Daha sonra DBS eluates HBV, HCV ve HIV enfeksiyonları, serolojik işaretleri sırasıyla algılamak için bir tam otomatik platformu (L) tarafından gerçekleştirilen analizleri için hazırsınız demektir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Geçmişte, konferanslar ve bilimsel çalışmaları için finansal destek Abbott tanılama teslim etmek için bir huzur RSR alınan. NG ve OM çakışan hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

DBS 100 yıl2 için kullanılmıştır ama şaşırtıcı bir şekilde, hala onların hazırlama ve işleme hakkında genel bir fikir birliği yoktur. Tüm diğer uygulamaları DBS5, 16, 23test için farklı protokolleri çeşitli var ise bugüne kadar bu önemli önceden analitik faz yeterli bir standardizasyon sadece yenidoğan tarama14, alanında elde edilmiştir. Bu dikkat çekici heterojenite üstesinden gelmek için uzun ve moleküler teknikleri tarafından kullanılmak üzere hazırlama ve DBS işlemek için kullanılan bir kapsamlı adım adım talimat bu iletişimde sunulan ve etkinliği ile ilgili olarak değerlendirildi işaretleyicileri HBV, HCV ve HIV enfeksiyonları algılamak için. Aşağıdaki tartışma odağı öncelikle önerilen protokol farklı basamaklarında yer alıyor.
Birçok farklı filtre kağıdı test DBS tarihinde kartları kullanılan2 olmuştur ama bugün sadece iki ticari kaynak sınıf II tıbbi cihazlar için kan toplama5, 16olarak FDA tarafından onaylanan. Bu filtre kart sistemleri son derece düzgün ve böylece ikisinin de üzerinde hazırlanan kapiller kandan elde edilen analitik sonuçlar % 4-%528daha farklı değil çok benzer emme özelliklere sahip. Doğal olarak, Masciotra ve co-işçiler29 bu nedenle HIV-1 RNA tespit eşit derecede kan toplama kartları farklı kaynaklardan gelen elüsyon sonra bir nitel tahlil ile iyi. Bu veriler göz önüne alındığında, bu hemen hemen herhangi bir test ederken gözlenen farklılıklar birleştiğinde işaretçileri için serum/DBS çiftlerini HBV, HCV ve HIV enfeksiyonları17 tek başına filtre kartı seçimi ile neden oldu dışlanabilir. Ancak, bir analit doğru miktar vazgeçilmez olduğunda, kaynak kaynak değişimi artık önemsiz olabilir ve daha sofistike teknikleri, örneğin, microsampling30 veya hazırlık için bir yöntemi olarak DBS (PDB) delikli kurutulmuş serum lekeler (DSS)31 10test geleneksel DBS yerine uygulanması gerekebilir.
Sadece az miktarda kan testi DBS için kullanıldığından (kılcal kan bir damla oluşur yaklaşık 50 µl)5, 16, numune hacmi değişimler önemlidir ve itiraf etmek gerekirse, en azından bazı serolojik sonuçları arasındaki farklılıkları ve katılımcının kendi kendine bildirilen HBV ve HCV durumu "DRUCK çalışması" Pilot sırasında kaydedilen bu değişkene atfedilebilecek. "Dalgalanmalar" numune hacmi en aza indirmek için tek en önemli etken kuşkusuz sadece teknik personel22dikkatli ve devam eden eğitim tarafından elde edilebilir kılcal kan toplama doğru bir tekniktir. Ayrıca, kalite kontrol, bir ölçüsü olarak tüm laboratuvarlar DBS ile çalışma zaten yordamlar belirlenmesi ve daha sonra yetersiz veya geçersiz16olarak dikkate alınması gereken var DBS örnekleri hariç olmak üzere başlatılan.
Öncelikle HIV32 bağlamında yürütülen çalışmalar ve yenidoğan tarama33 yüksek nem analitler düşmesine neden olabilir, ama şimdiye kadar hiçbir fikir birliği ne kadar DBS air-dried olması gerektiği ile ilgili soru ulaşıldı göstermiştir . En az 4 saat ve tercihen bir aralığı O/N bu iletişim, bu nedenle tüm ilgili yayınları32, 34 veri depolama DBS büyük çoğunluğu HBV ve HCV için daha sonra kullanılmak üzere kullanılmaya başlanmıştır koşulları kabul önerilen test çakışıyor. 1981 yılında çağdaş analitik teknikler uygulamış, Villa ve co-işçiler35, antikor titreleri olsaydı depolama RT, HBV analizleri sonuçlarını 180 gün tüm gözlem döneminde etkilemedi rapor > 1/1000, ama o DBS 15 gün sonra serum titreleri sadece 1/100 yaşındayken sınır-pozitif veya negatif bile oldu. Depolama Sıcaklığı-20 ° C veya 4 ° C, önemli bir gelişme sonuçlanmamıştır. Buna ek olarak, otuz yıl sonra36 test HBV-pozitif örnek çoğaltır bir çalışma yaptık ve yazarlar bu anti-HBc Oysa HBsAg aynı koşullar altında olmuş anti-HBs antikor için 183 yaşam, RT, istikrarlı yanı sıra bulundu 63 gün sonra zaten yanlış negatif. DBS eluates HBV DNA algılama, ile ilgili olarak viral nükleik asit konsantrasyonu en az yedi gün 37 ° C37 istikrarlı veya depolama vasıl ilâ üç haftadır RT "dayanıklı" olduğunu kanıtladı38. İki piyasada bulunan üçüncü nesil uzun39 doğru sonuçlar bir gün süre ile 117-20 ° C, 2-8 ° C ve 20-25 ° C, sırasıyla depolanan DBS numuneleri kullanılarak sağlanan kullanarak anti-HCV antikor testi. -20 ° c, depolama Ancak, optik yoğunluğu en düşük varyasyon sonuçlandı. Uygulama bir dördüncü nesil anti-HCV ELISA, Yani, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, test, Larrat ve ark. DBS bağlamında 40 analitik özgüllük üç gündür RT., DBS numuneler depolamak sonra keskin bir düşüş gözlendi Öte yandan, kesin test sonuçlar örnekleri çeşitli koşullarda (-20 ° C, 2-8 ° C ve 22-26 ° C) 60 gün boyunca Brandao ve iş41tarafından yatırılan kullanan aynı kiti ile elde edilmiştir. En çok bir yıl42 için hiçbir önemli değişiklik-RT, DBS HCV RNA konsantrasyonlarda çeşitli saklama koşulları altında düşüş üzerine gözlemler ortam sıcaklığı43dört hafta sonra on kat bir değişim alanı. Bu oldukça çakışan veri istikrar HBV ve HCV antijenleri, nükleik asitler ve antikorlar dikkate alarak, bu daha önce için kullanılması için DBS örneklerin depolama birimi için tanımlanan bir fikir birliği için önerilen protokolündeki geri çekmek mantıklı mı geldi 15, 30test HIV: daha uzun bir süre için en iyi depolama donmuş koşullar ise kısa vadeli ifade (ilâ iki hafta) için antijenleri, viral nükleik asit ve antikorlar RT, ahırda olarak kabul edilmektedir.
Bir kural olarak, üç parametre bir elüsyon Protokolü tasarlarken dikkate alınmalıdır: (1) elüsyon arabellek; (2) süresi ve elüsyon sıcaklığını; ve (3) elüsyon birim23. Tüm ilgili yayınları büyük çoğunluğu fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) DBS eluting için kullanıldı ve çoğu yazarlar bir protein, örneğin, sığır serum albumin (BSA) veya ara 20, yüzey aktif, sabitleme ile tahlil sinyallerinin geliştirilmesi için eklendi proteinler, çözüm ve aynı anda engelleme non-spesifik bağlama siteleri23giderken. Doğrudan farklı elüsyon arabellekleri DBS test bağlamında karşılaştırmak, sadece birkaç raporlar kullanılabilir. Villar vd. 36, örneğin, hemen hemen eşdeğer elüsyon kapasiteleri, PBS/BSA kullanılan tüm arabellekleri için kaydedilen % 0.5 spesifik olmayan reaktivite düşük düzeyde sonuçlandı. Çok benzer bir gözlem Croom ve iş44 tarafından yapılan anti-HCV antikorları elüsyon genetik sistemler rLAV ÇED numune seyreltici DBS uygularken. Örnek bozulma riski DBS (yukarı bakın) hazırlanması sonra ilk saat içinde son derece düşük olduğundan, bu noktalar O/N, ortam sıcaklığında kuluçkaya ve nazik bitti sıra karıştırılarak elüsyon işlemi desteklemek için karar verildi. Bu yaklaşım örnekler önceki yumruk avantajı vardır gün doğrudan transfer için rutin tanı erken ertesi sabah23. Elüsyon arabellek hacmi seyreltme faktörü mümkün olduğunca düşük tutmak için daha sonraki analizler için kullanılan deneyleri en az kendi ihtiyaçlarına adapte edilmelidir. Ancak, yüksek örnek işlem hacmi nispeten kısa sürede sırasında "DRUCK çalışması"17garanti çünkü elüsyon koşullar tek her analit için dikkatli bir optimizasyon önceki değerlendirilmesinde mümkün değildi. Sonuç olarak, 1.000 µl PBS tabanlı arabellek oldukça olumsuz hacmi için iki ayrı işlem tüm parametreleri tüm elüsyon işlemini tamamlamak için kullanıldı.
Bu yaklaşım bir yandan "tamamen anti-HBc/anti-HBs sistemi nedeniyle düşük antikor konsantrasyonları; HIV ile enfekte kişilerin için başarısız ... ve HBV DNA ile ilgili olarak en iyi analitik hassasiyetle moleküler biyolojik yordamları gerekli ve HCV RNA sınar. " 17 Öte yandan, yüksek elüsyon birim hiçbir şekilde HBsAg, anti-HCV ve Anti-HIV değerlendirme kullanılan kitleri tarafından belirlenmesi için dezavantajlı olduğunu kanıtladı. "HBsAg pozitif tam kan eluates malzemelerden başarılı %98.6 100 µl, 250 µl veya 600 µl veya 500 µl çok daha küçük bir elüsyon hacmi kısmen kullanmış olduğu önceki çalışmalarda olduğu gibi aynı şekilde yüksek derecede bir hassasiyetle tespiti"17 ,36, 45, 46. %97,8 179 serum/DBS çiftleri soruşturmada anti-HCV antikorları zaten var olan sonuçlarını denk için belirlenen duyarlılığını 5-10 kat daha düşük bir elüsyon birimdeki çalıştı24, 44, 47, 48, 49, raporlar. "Ayrıca, anti-HCV algılama protokollerde uygun şekilde... kendi kesme noktaları ana tarafından optimize edilmiştir"17, 24, 48, 49 "veya 20 µl 100 µl örnek birimlere artırarak." 17, 49 son olarak, analitik özgüllük ve Anti-HIV algılama için kurulan duyarlılık (% 100 her) eşit veya50, 51 test DBS için özel olarak uyarlanmış diğer uzun performans özelliklerinin daha üstün "veya bir kademeli yordamı birkaç Anti-HIV testleri kombine kullanımı ile"17,52. "Onlar, gerçekten de, aynı zamanda performans göstermiş özel olarak geliştirilmiş ve DBS eluates (Q önlemek HIV 1 + 2 DBS kiti) Anti-HIV antikor tespiti için optimize edilmiş bir testin aşıldı." 17, 53  
Birlikte ele alındığında, bu iletişimde sunulan kapsamlı adım adım Protokolü hazırlama ve DBS işleme için mümkün ve kullanıcı dostu bir araç olduğu ortaya çıktı ve böylece, güvenilir bir şekilde tanı Viroloji kullanılabilir. Otomasyon 54 kullanarak yaklaşımlar sağlar ve mükemmel performans özellikleri nedeniyle bir tür için bir gelecek genel kabul gören uzlaşma protokol DBS laboratuarda test küresel alandaki temel taşı olarak hizmet potansiyeline sahiptir Tıp.

Selüloz yapılan bir kağıt kartına toplanan kan kullanma fikri Ivar Christian Bang için (1869-1918), modern klinik microanalysis1, 2babası atfedilen. 1913 yılında Bang glikoz Kjeldahl yöntemi ile bu filtre kağıdı tekniği2kullanarak da gerçekleştirilen eluates kurumuş kan lekeleri (DBS)3 ve daha sonra azot ölçüleri üzerinden belirlenir. Daha sonra birkaç müfettişler frengi2teşhis etmek için serolojik test etmek için DBS kullanımı bildirdi. Erken 1924'te olduğu gibi DBS test avantajları Chapman özetlenen ne zaman o özellikle vurguladı bugün hala geçerli olan dört öğeler: (1) kıyasla geleneksel iz, az kan hacmi gereklidir ve bu gerçeği Pediatrik içinde en önemli Tanılama; (2) kan toplama basit, olmayan invaziv ve ucuz değildir; (3) bakteriyel kirlenme veya hemoliz riskini en az düzeydedir; ve (4) DBS analitler2, 4neredeyse hiçbir bozulma ile uzun süre korunabilir. Frengi için test kullanımı yanı sıra, DBS tekniği daha da erken uygulamaları, örneğin, kızamık, kabakulak, poliovirus, parainfluenza virüs ve respiratuar sinsisyal virüs (RSV) karşı antikor tespiti 19532' de bulunan, Shigella tanımlaması dışkı içinde filtre kağıdı kuru ve normal posta yoluyla--dan Indonesia endemik bölgelerde alınan ve üç aydan fazla daha sonra analiz DBS5 Schistosoma antikorlar tespiti yanı sıra Hollanda Leiden sevk . 1963 yılında, elli yıl sonra yerini özgün iletişim2, 6, Guthrie Fenilketonüri topuk hıyar yenidoğan7, 8tarafından elde edilen DBS gelen tanı için ünlü onun yöntemi sonunda yayınlandı.
Her ne kadar o zamandan itibaren DBS toplamak için yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem olarak kabul edildi, depolama, taşıma ve insan vücut sıvıları5, çeşitli analiz kullanımları teşhis hala ağırlıklı olarak tanısında üzerinde duruldu kaldı enfeksiyonları özellikle içinde kaynak sınırlı ayarları ve yenidoğan yıl9, 10için kalıtsal metabolik bozukluklar için sistematik tarama. 2005 yılından bu yana, ancak, çeşitli yeni ve yenilikçi DBS uygulamalar başlamıştır ortaya. Bu ilgili bilimsel yayınlardan DBS üzerinde yaklaşık 50 neredeyse 450 sayısını neredeyse üstel artış her yıl şu anda sonuçlandı. Gelişmekte olan uygulamalar arasında böyle toxico - ve farmakokinetik uygulama, metabolik profil oluşturma, tedavi edici ilaç izleme, adli toksikoloji veya çevresel kirlenme kontrolü10, 11olarak farklı alanlardır.
DBS test böylece, yapılan klinik laboratuvar teşhis aracılığıyla bir zafer yürüyüşü geçmişte sırasında 100 yıl2. Klinik kimya12olduğu gibi Ancak, bu yürüyüş sırasında önceden analitik değişkenleri yeterince uzun yıllar kabul edildi değil. Gerçekten de, bugün bile, CDC filtre kağıdı değerlendirme projesi13 veya filtre kağıdı Framework üzerinde kan topluluğu14, önceden analitik aşama eleme yenidoğan için ulusal bir standart formülasyonu olarak seçkin böyle etkinliklere sonra hala DBS test uygulanan5, 10olduğu diğer alanların çoğunda büyük ölçüde gözardı durumda.
Bu arka plan göz önüne alındığında, tüm temel adımları kapsar, kullanmak uzun ve moleküler teknikleri, kapsamlı adım adım protokolü14-16 hazırlama ve DBS aşağıdaki iletişim içinde işlemek için önerilmektedir: (1) kan toplama; (2) kan lekeleri hazırlanması; (3) kan lekeleri kurutma; (4) depolama ve taşıma; (5) DBS elüsyon; ve son olarak (6) analizleri DBS eluates. İletişim kuralı etkinliğinin ilk 1,762 eşleşmiş serum/DBS çiftiyle Hepatit B virüsü (HBV) yüzey antijeni (HBsAg), HBV çekirdek antijen (anti-HBc), HBV yüzey antijeni (anti-HBs), HBV DNA, antikor antikor algılamak için değerlendirildi antikorlar Hepatit C virüs (HCV) (anti-HCV), HCV RNA ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) 1-p24-antijen/anti-HIV 1/tam otomatik platform veya hassas nitel nükleik asit kullanarak 2 testleri. 17. İkinci adımda, pilot çalışma "uyuşturucu ve kronik enfeksiyon tarafından Robert Koch-Enstitüsü yakın işbirliği içinde ulusal başvuru Merkezi ile aktif Hepatit C için yapılmıştır hastalığa" ("DRUCK çalışma") iletişim kuralı kullanılmıştır Berlin ve Essen18Alman şehirlerde uyuşturucu kullanıcıları.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

Bir kağıt kartta kan toplanması ve daha sonra kurumuş kan lekeleri (DBS) bir asır önce kaynağı tanılama amacıyla kullanarak fikri. O zamandan beri DBS test onlarca yıl ağırlıklı olarak kalmıştır için kaynak sınırlı ayarları'nda özellikle bulaşıcı hastalıkların tanı odaklı veya sistematik yenidoğan için kalıtsal metabolik bozukluklar, eleme ve sadece son zamanlarda çeşitli var yeni ve yenilikçi DBS uygulamaları ortaya çıkmaya başladı. Uzun yıllar boyunca, önceden analitik değişkenleri yalnızca uygunsuz DBS test ve bugün bile, Yenidoğan tarama, hazırlık oluşur tüm önceden analitik faz ve DBS için işleme alanında kabul edildi onların Son tahlilde standart değil. Bu arka plan göz önüne alındığında, al temel aşamaları kapsar, kapsamlı bir adım adım protokol, Yani, kan toplanması önerilmiştir; kan lekeleri hazırlanması; kan lekeleri kurutma; depolama ve nakliye için-DBS; elüsyon DBS ve nihayet DBS eluates analizleri. Bu iletişim kuralı etkinliğinin ilk işaretleri Hepatit B virüsü, hepatit C virüsü ve human Immunodeficiency virus enfeksiyonları otomatik bir analitik platformunda algılamak için 1,762 eşleşmiş serum/DBS çiftleri ile değerlendirilmiştir. İkinci adımda, protokol aktif uyuşturucu kullanıcıları Berlin ve Essen Alman kentleri yapılmıştır bir pilot çalışma sırasında kullanılmıştır.

Protokolünün etkinliği için hazırlık önerdi ve DBS işlenmesi ilk işaretleri 1,762 eşleşmiş serum/DBS çifti HBV, HCV ve HIV enfeksiyonu analiz ederek değerlendirilmiştir. 17. bu amaçla, DBS 100 µl bütün Venöz kan (cf. puan 2.1.1-2.1.6 önceki iletişim kuralı) hazırlanmıştır ve PBS dayalı olarak 1000 µl ile eluted, her, (cf. 5.1-5,5 yukarıda belirtilen iletişim kuralının puan) işlemini tamamlamak için arabellek tüm yedi parametreleri için iki ayrı işlem. Böyle bir yaklaşım elüsyon koşulların tek her analit için dikkatli optimizasyon olmadan oldukça yüksek örnek işlem hacmi nispeten kısa sürede "uyuşturucu ve kronik önümüzdeki saha çalışması sırasında beklenen çünkü kaçınılmaz gibi görünüyordu Bulaşıcı hastalıklar"("DRUCK çalışması").
Tüm ölçümler üreticinin önerilerini DBS analizleri sırasında yapıştırılır ama hemoliz etkisi veya seyreltme sonucu için telafi etmek için HBsAg ve anti-HBs tayini ile ilgili olarak değiştirilmesi gerekiyordu. 0,05 IU/ml kesme değeriyle birlikte HBsAg DBS eluates kurşun yanlış-mutlak %14,7 (52 dışarı-in 354) oranının ne zaman karşılaştırmak için serum test örnekleri (şekil 2A). Alıcı karakteristik (ROC) analiz25, 26 verilerin çalışma 0,15 IU/ml eşiğine artış HBsAg negatif (0.986 [duyarlılık], 0.000 [1-özgüllük], HBsAg pozitif ideal bir ayrılık neden olacağından belirtilen Şekil 2B). Öte yandan, 10 IU/m anti-HBs miktar için cut-off ile antikor oranı % 14.2 (47 dışarı-in 331) yanlış negatif ölçümleri oldu (şekil 2C) kaydetti. Bu nedenle, tekrar ROC analizi, bu kesme 1,5 IU/M'ye (0.917 [duyarlılık], 0,007 [1-özgüllük], şekil 2B) değerlerden en uygun bir ayrımcılık ulaşmak için indirdi.
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> Şekil 2. HBsAg ve anti-HBs DBS eluates (17değiştirilmiş) testi. ROC-güdümlü artış (A) için 0,15 IU/ml 0,05 IU/ml den HBsAg miktar için cut-off değerinin indirimli (B) yanlış pozitif sonuçları oran % %14,7 0'a. Benzer şekilde, anti-HBs konsantrasyonları ROC analizi, başlangıçta tüm tespitler % 14.2 için muhasebeleştirilir yanlış negatifler, böylece tamamen ortadan kaldırarak ilgili eşik 10 IU/l (C) 1,5 IU/M'ye (D), bir düşüş önerdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
Eşleşmiş serum/DBS analiz sonuçları tablo 117' özetlenir. Sigara yok özgüllük DBS herhangi yedi analitler için test sırasında kaydedildi.
Ne zaman DBS eluates HBsAg, ı. e. serolojik anahtar parametreyi HBV ile akut ve kronik enfeksiyon varlığı için incelenmiş %98.6 analitik bir duyarlılık tespit edilmiştir. İki yanlış negatif sera konsantrasyonlarda HBsAg 749 IU/ml 6 IU/ml, idi. Anti-HBc antikorlar başarıyla 176 dışarı-in 204 ' (ı. e %86.3) tespit edildi DBS eluates. Yirmi iki ko-HIV ile enfekte bireylerin kökenli ölçümleri tarafından algılanmadı 28 örnekler dışında. Böylece, eğer HIV pozitif kişilerin hesaplama dışı bırakıldı, bir duyarlılık %97.1 anti-HBc antikorlar eluted kurutulmuş bütün Venöz kan almak için elde edildi. Benzer gözlemler anti-HBs antikor tayini için doğru tuttu. Hatta tahlil için 1,5 IU/l kesme değerini ayarlaması sonrası, dokuz tutarsız serum DBS sonuçları oluştu. HIV ile ko-enfekte olmayan hastalarda serum anti-HBs konsantrasyonları 11-26 IU/m hangi sonra kurumuş kan elüsyon algılama için izin vermek için çok düşük bulundu.
Anti-HCV antikorları ya bir akut veya kronik ya da çözülmüş enfeksiyonu işaret etmektedir. Sadece dört (ı. e. % 2.2) yanlış negatif anti-HCV sonuçları DBS eluates belirlenmiştir ve daha fazla serolojik ve moleküler analizleri ilgili sera çok muhtemelen olan enfeksiyonlar çoktan olmuştu hastalardan çekilmiş sergilenmez çözüldü.
DBS eluates tam otomatik sistem ile Anti-HIV antikor tespiti analitik bir duyarlılık % 100 kazandıran tamamen pürüzsüz bir süreç oldu.
"Ortalama HBV DNA toplama tam kan eluates üzerinden 100 numuneler üzerinde gerçekleştirilen (DNA konsantrasyon anlamına gelecektir: 1,573,898 IU/ml, aralığı: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) ve %93.0 değeri vermiştir. Böylece, düşük serum HBV DNA konsantrasyonları 409 ve 3,643 IU/ml arasında yedi örnekleriyle test DBS tarafından algılanmadı. HCV RNA pozitif olduğu kanıtlanmıştır 100 sera (yani HCV RNA konsantrasyon: 1,415,944 IU/ml, aralığı: 2,479 - > 7,692,000 IU/ml), karşılık gelen tam kan aliquots kullanıma hazır hale getirildi. DBS eluates üzerinden HCV RNA belirlemeleri için %100 analitik bir duyarlılık karşılaştırmalı araştırma sonuçlandı." 17
Hazırlama ve DBS alan koşullarda işleme için anahatları belirlenmiş iletişim kuralı test etmek için bu yakın işbirliği ile Robert Koch-Enstitüsü (Berlin, Almanya) "Uyuşturucu ve kronik bulaşıcı olan hastalıklar", çalışmanın pilot aşamasında kullanılmıştır Berlin ve Essen18Alman kentleri etkin uyuşturucu kullanıcılarında yapılan. Bölümlerde 2.2.1-2.2.3 önceki iletişim kuralı, ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kılcal kan örnekleme kayıtlı tüm 534 katılımcılar (433 erkek ve 101 kadın) uygulandı ve DBS yeniden, buna ek olarak PBS tabanlı arabellek 1.000 µl tarafından eluted.
İki kişi kronik HBV ile bulaşması için teşhis ve 39 çözümlenmiş bir HBV enfeksiyonu serolojik desen gösterdi. Ayrıca, on beş katılımcıların anti-HBs (sonrasi hipererjik durumu) için olumlu ve sekiz anti-HBc için yalnız olumlu bulundu. Katılımcılar arasında anti-HCV prevalansı %57.3 idi (N = 193) Berlin ve %73.0 (N = 144) Essen'de. Antikor pozitif % 65 örnekleri (N = 125) ve % 62 (N 89 =) da viremic vardı. Yirmi-beş 534 bireylerin dışında Anti-HIV pozitif. On dokuz enfeksiyonların zaten biliniyordu ve 24 bu bireylerin ortak HCV ile enfekte.
DBS sınayarak elde edilen sonuçları dikkatle kendi kendine bildirilen HBV ve HCV durumuyla ilgili çalışmaya katılanların anamnestic veri ile karşılaştırıldı. Bu karşılaştırma test sonuçları ile birlikte birleştiğinde serum/DBS çiftleri sınama algoritma küçük değişiklikler "DRUCK altı ek büyük şehirlerde Alman etkin uyuşturucu kullanıcılarının kayıt çalışması" ana aşaması için yol açtı: "bireyler ile enfekte HIV her zaman test edilebilir HBV DNA varlığı için. Katılımcılar olan DBS eluates anti-HBc veya anti-HBs pozitif bir iz için ikinci bir Danışma sırasında kesinlikle anti-HBc/anti-HBs durumlarını açıklamak için tabi olması ve son olarak, tüm DBS eluates HCV RNA için gösterimi yapılacak anti-HCV testi sonuçları ne olursa olsun." 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>Parametreleri</td>
			<td>Eşleşmiş sera/DBS eluates (N)</td>
			<td>Tutarsız sonuçlar (N)</td>
			<td>Serum ve DBS eluates test arasında farklılıklar nedeni</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>Kronik HBV enfeksiyonu ile iki hasta. Hem antiviral tedavi edildi ve bunlardan biri ortak HIV ile enfekte oldu. Serum konsantrasyonlarda HBsAg: 749 IU/ml ve 6 IU/ml, anılan sıraya göre.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>Serum içinde yirmi iki çözümlenmiş bir HBV enfeksiyonu vardı. Altı bireylerin serolojik bulma "anti-HBc yalnız" gösterdi. 22 yaşında olan hastaların ortak HIV ile enfekte. "HBV çözümleyiciler" yirmi olarak değerlendirildi "DBS test ederek anti-HBs pozitif yalnız" ve böylece, yanlışlıkla "koşulu sonrasi hipererjik" olarak sınıflandırıldı.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>HIV ile ko-enfekte değil dört hasta serum anti-HBs konsantrasyonları 11 ‑ vardı 26 IU/l, elüsyon kurumuş kan lekeleri sonra antikor algılama için izin vermek için çok az oldu.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>409 IU/ml 3,643 IU/ml arasında değişen düşük serum HBV DNA konsantrasyonları ile ilgili sera seven hastalardan elde vardı.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HCV</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>Bu dört sera çoktan çözülmüş HCV enfeksiyonu olan hastalarda dan alınmıştı.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/anti-HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Hangi kurumlara ve bu iletişim protokolü önerilen tüm Venöz kan aşağıda üzerinden işlenen, 1,762 DBS elde edilen sonuçlar bir referans olarak eşleşmiş serum numuneleri bulguları ile karşılaştırıldığında.

Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

Hazırlama ve işleme için onların son tahlilde kurumuş kan noktalar (DBS) hala kötü çoğu tanılama uygulaması standardize edilmiştir. Bu eksiklik üstesinden gelmek için kapsamlı adım adım iletişim kuralı önerdi ve daha sonra işaretleri viral enfeksiyonların algılama etkinliği ile ilgili olarak değerlendirildi.

Kurumuş kan lekeleri - hazırlanması ve uzun ve moleküler teknikleri kullanmak için işleme

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

dried-blood-spots-preparing-processing-for-use-immunoassays-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

39.4K Görüntüleme.  University of Duisburg-Essen. Hazırlama ve işleme için onların son tahlilde kurumuş kan noktalar (DBS) hala kötü çoğu tanılama uygulaması standardize edilmiştir. Bu eksiklik üstesinden gelmek için kapsamlı adım adım iletişim kuralı önerdi ve daha sonra işaretleri viral enfeksiyonların algılama etkinliği ile ilgili olarak değerlendirildi.

Video: Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Biyoloji

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

Mikroakışkan Probe: Çalışma ve Yerelleştirilmiş Yüzey İşleme için kullanın

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Kobaylardaki Sigara Terminal Kan Örnekleme Teknikleri

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Yetişkin Zebra balığı Kan Testleri için Tekrarlanan Kan Alma

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Montaj ve &#39;Kayma Rings&#39; Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...