Cette communication est basée sur les résultats précédemment publiés dans Virology Journal17 en mode libre accès aux termes de la licence Creative Commons (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) avec BioMed Central comme un titulaire de licence. Les auteurs a remercient la collaboration fructueuse dans le cadre du pilotage de l’étude « Médicaments et maladies infectieuses chroniques » (« DRUCK Study »), avec U. Marcus, Cai W., W. Zhang et R. Zimmermann du Robert Koch Institute (Berlin, Allemagne) et sommes reconnaissants à S. Moyrer pour la photographier assemblés dans la Figure 1 , ainsi que D. F. Whybrew, Ph.d., (Göttingen, Allemagne) pour corriger le manuscrit. Ils expriment aussi leur gratitude pour l’assistance technique habile à J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter et K. Seidel. Cette étude a été financée en partie par une subvention du ministère allemand de la santé au Centre National de référence pour l’hépatite c.

Étant donné que le protocole est conçu pour une utilisation dans le diagnostic médical, sa demande doit suivre les principes de la déclaration d’Helsinki19. Pour la première partie des résultats présentés dans la présente communication, les deux un accord séparé par les patients et l’approbation par un Comité d’éthique semblent être dispensable pour deux raisons : (1) « lors de l’admission » à l’hôpital universitaire d’Essen, « dispose de tous les patients consentement écrit de toutes les recherches biochimiques, bactériologiques et virologiques nécessaires. » 17 (2) « tous les échantillons utilisés tout au long de l’évaluation des tests de DBS ont été envoyés à l’Institut de virologie dans le processus de diagnostic clinique de routine. Ainsi, aucun des spécimens ont été recueilli spécifiquement dans le but de l’étude, pas une seule ponction supplémentaire a été effectuée et aucun des matériaux a été testé pour tout paramètre autre que celles requises par les médecins dans le cadre de la normale diagnostic « marche à suivre. 17 l’étude « Médicaments et maladies infectieuses chroniques » (DRUCK Study »)18, dans laquelle DBS essais enfin servait dans les villes allemandes de Berlin et Essen à évaluer ceux qui ont activement s’injectent des drogues, a été approuvé par le Commissaire fédéral aux données Protection et la liberté de l’Information (Berlin, Allemagne) et ainsi que par le Comité d’éthique de la Charité de l’Université médicale, (Berlin, Allemagne).
1. collecte de sang
<ol><li>Ponction de14, 15, 20, 21<ol>
<li>Mettez des gants jetables en latex et nettoyer la zone de la ponction prévue (préférence la veine cubitale médiane dans la cubitale) avec un désinfectant approprié, par exemple, alcool isopropylique à 70 %.</li>
		<li>Appliquer un garrot 4 à 6 pouces au-dessus du site de ponction putatif à distendre les veines. Introduire l’aiguille dans la veine du patient et, une fois en place, remplir doucement le tube de sang connectés, qui contient l’EDTA comme anticoagulant.</li>
		<li>Dès la ponction veineuse est terminée, relâcher le garrot et retirer l’aiguille. Puis, appuyez sur une compresse sèche sur le site de ponction, qui par la suite peut être maintenu en place par un bandage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perforation de la peau (Figure 1 a)13-15, 20, 22, 23<ol>
<li>Enfiler une paire de gants jetables en latex.</li>
		<li>Avant la perforation de la peau, le patient doit réchauffer ses mains. Le doigt est massé axonales l’enrichir le sang circuler vers de site de ponction.</li>
		<li>Nettoyer la peau de la face palmaire de la phalange distale de l’extrémité de la troisième ou quatrième doigt de la main non-écrit avec un désinfectant approprié, par exemple, alcool isopropylique à 70 %. Piquer la peau par une lancette à usage unique de sécurité. Le doigt se tiendrait dans une position telle que la gravité facilite la collecte de sang sur le bout des doigts.</li>
		<li>Lorsque le prélèvement du sang capillaire par ponction de la peau est terminée, placer un bandage sur le bout du doigt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation des taches de sang
<ol><li>Préparation à partir de sang prélevé par ponction veineuse15<ol>
<li>Repérer l’anti-coagulé (EDTA) ensemble veineux sang sur les cartes de filtre dès que possible. Ne préparez pas de taches de sang séché de plus de 24 heures après la ponction veineuse.</li>
		<li>Mettre toutes les informations nécessaires à l’identification du patient sur la carte de filtre. Une seule carte doit être repérée seulement avec le sang d’un individu.</li>
		<li>Mettez des gants jetables en latex.</li>
		<li>Retourner doucement le tube de prélèvement de sang 2 à 4 fois et ensuite ouvrir le bouchon avec précaution.</li>
		<li>Aspirer 50 µl de sang veineux tout en utilisant une pipette avec un embout jetable. Transférer le sang vers le centre d’un cercle sans toucher le papier filtre directement avec l’embout de la pipette. Essayer de saturer complètement le cercle.</li>
		<li>Répétez cette procédure pour remplir tous les cercles requises de la carte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation du sang recueilli par peau percer (Figures 1 b et 1C)13-16, 23<ol>
<li>Essuyer la première goutte de sang avec un tampon de gaze parce qu’il peut contenir des liquides tissulaires excédentaire. Masser le doigt à nouveau pour augmenter le flux sanguin à la ponction. Transférer la baisse suivante à un des cercles d’une carte de filtre sans toucher la surface directement avec le bout des doigts. Permettre au sang d’être trempé dans la texture du filtre par des forces capillaires seulement.</li>
		<li>Laissez la prochaine grosse goutte de forme de sang capillaire sur le bout du doigt et ramasser en cercle suivant. Continuez cette procédure jusqu'à ce que tous les cercles nécessaires sont remplies ou la circulation sanguine s’arrête.</li>
		<li>Ne pas squeeze ou « lait » le doigt trop si le débit sanguin ne suffit pas à combler tous les cercles requises de la carte de filtre. En cas d’arrêt de la circulation sanguine, placer un bandage sur le bout du doigt. Effectuer une deuxième crevaison de peau sur un autre doigt si plus de sang est nécessaire pour l’examen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. séchage des taches de sang
<ol><li>Pour sécher les taches de sang, mettre le filtre cartes sur un papier propre serviette dans une enceinte de sécurité biologique et les laisser sécher, préférence O/N (mais pour au moins 4 heures), à la droite en l’absence de toute source de chaleur externe. Lorsque le processus de séchage est terminé, les taches de sang ont une couleur brunâtre foncée uniformément et sans zones rouges sont visibles plus (Figure 1)13, 15, 16.</li>
</ol>4. stockage et transport des taches de sang séché (DBS)
Remarque : Le traitement des taches de sang peut être interrompu après séchage. Les cartes de filtre peuvent désormais être stockées13-16, 23.
<ol><li>Pour le stockage, mettre la carte de papier filtre dans un sac unique, gaz-imperméable à capuche, contenant 1 à 2 sachets déshydratants pour protéger les spécimens de l’humidité (Figure 1E). Ajouter éventuellement une carte d’indicateur d’humidité.</li>
	<li>Transférer ce sac dans un congélateur à une température de-20 ° C ou plus bas dès que possible. Si congélateurs ne sont pas disponibles dans des conditions naturelles, conservation à-4 ° C ou même à la température ambiante est possible jusqu'à 14 jours.</li>
	<li>Transport des échantillons congelés de DBS sur la glace sèche. Pour les cartes de filtre initialement maintenus à température ambiante, utilisent un système de triple emballage, qui comprend le sac fermeture éclair comme les réservoirs intérieurs ainsi qu’un intérieur et l’enveloppe extérieure. Non content de marquages sont requis sur l’enveloppe extérieure pour l’expédition par la poste, mais le symbole biohazard international doit être apposé sur le conteneur interne primaire16.</li>
	<li>Exclure les cartes filtre de traitement ultérieur si le dessiccateur et/ou de la carte d’indicateur humidité supplémentaire change d’une couleur rose.</li>
</ol>5. l’élution du sang séché taches13, 15, 16, 23
<ol><li>Percez un spot avec un dispositif à usage unique de 6 mm de chaque cercle sanglant de la carte de filtre de Grade 903 (Figure 1F). Transfert de tous les coups de poing des taches de sang séché d’un seul patient à un puits de la plaque de 12 puits.</li>
	<li>Remplir le puits avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,05 % Tween 20 et 0,08 % d’azide de sodium (Figure 1). Adapter le volume de tampon supplémentaire minime part aux exigences du test utilisé pour une analyse ultérieure des éluats de taches de sang séché.</li>
	<li>Répétez ces étapes pour obtenir une seconde série d’éluats tache de sang séché afin d’effectuer des analyses moléculaires.</li>
	<li>Mettre la plaque de culture cellulaire sur un agitateur de laboratoire et de laisser les taches de sang séché perforée éluer doucement pendant au moins 4 heures ou, de préférence, O/N (Figure 1 H).</li>
	<li>Le lendemain, les taches sont presque exempts de sang et des surnageants hémolytiques ont formé (Figure 1I). Transférer ces éluats microtubes à centrifuger. Ensuite, les soumettre à une centrifugation pendant 2 min à 10 500 g (Figure 1J) pour libérer les surnageants de tous les débris qui s’était formé au cours d’élution (Figure 1 K).</li>
</ol>6. analyse des éluats
<ol><li>Les éluats centrifugés sont maintenant prêts à être utilisés pour les analyses prévues. Étudier les éluats de marqueurs de l’hépatite B, virus de l’hépatite C et VIH en utilisant des kits disponibles dans le commerce et suivre attentivement les instructions des fabricants respectifs (Figure 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> Figure 1. Graphique Sommaire du protocole proposé dans la présente communication pour la préparation et le traitement des taches de sang séché être utilisé dans les immunoessais et par des techniques moléculaires. Ensemble tube de prelevement sanguin et capillaire sanguin obtenu par ponction veineuse ou perforation de la peau par une lancette (A) peuvent servir d’échantillons pour l’analyse de tache de sang séché. Après le transfert du sang aux cercles d’une carte de filtre de Grade 903 (B, C), les échantillons doivent être séchés préférence O/N à la température ambiante sous une hotte à taches de forme d’une couleur uniformément brunâtre sans n’importe quel mélange de rouge de sécurité biohazard zones (D). Lors du séchage des taches de sang est terminé et le stockage est nécessaire, les cartes filtre peuvent être emballés dans des sacs à fermeture à glissière imperméable au gaz contenant de 1 à 2 sachets déshydratants (E). Traitement ultérieur de laboratoire de DBS constituent la génération des coups de poing par un dispositif à usage unique 6 mm depuis le Centre des cercles (F, G), l’élution des coups de poing dans un tampon PBS pendant au moins 4 heures ou, préférablement, O/N sur un agitateur (H ), la récupération des éluats (j’ai) et enfin centrifugation des coupes du laboratoire (J) pour libérer les éluats DBS de tout débris qui pourrait avoir son origine au cours du processus d’élution (K). Par la suite, les éluats DBS sont prêts pour des analyses qui ont été réalisées par une plate-forme entièrement automatisée (L) afin de détecter des marqueurs sérologiques des infections à VHB, VHC et VIH, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Dans le passé, la RSR a reçu d’honoraires permettant de présenter des conférences et un soutien financier pour son travail scientifique d’Abbott Diagnostics. NG et OM déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts contradictoires.

DBS ont été utilisés pour 100 ans2 mais, étonnamment, il n’y a encore aucun consensus sur leur préparation et le traitement. A ce jour, une normalisation suffisante de cette importante phase pré-analytique a seulement obtenue dans le domaine du dépistage néonatal14, une variété de différents protocoles existe pour toutes les autres applications de DBS test5, 16, 23. Pour surmonter cette hétérogénéité remarquable, un enseignement complet étape par étape pour préparer et traiter les DBS devant être utilisée dans les immunoessais et par des techniques moléculaires est présentée dans la présente communication et évaluée en ce qui concerne son efficacité pour la détection des marqueurs des infections à VHB, VHC et VIH. La mise au point de la discussion qui suit est principalement mis sur les différentes étapes du protocole suggéré.
Dans l’histoire de DBS essais nombreux papier-filtre différentes cartes ont été utilisées2 mais aujourd'hui seulement deux sources commerciales sont approuvés par la FDA comme dispositifs médicaux de classe II pour blood collection5, 16. Ces systèmes de carte de filtre sont très uniformes et ont des caractéristiques d’absorption très similaires afin que les résultats d’analyse obtenus à partir de sang capillaire préparé sur un d’eux ne diffèrent pas de plus de 4 % à 5 %,28. Il n’est pas surprenant, Masciotra et ses collègues29 détecté donc ARN du VIH-1 aussi bien avec un essai qualitatif après élution de cartes de collection de sang provenant de différentes sources. Compte tenu de ces données, il peut être pratiquement exclu que tout les écarts observés lors du test couplé paires de sérum/DBS pour marqueurs du VHB, VHC et VIH infection17 a été causée par le choix de la carte filtre seul. Toutefois, lorsqu’une quantification précise d’un analyte est indispensable, variation de la source à l’autre peut-être ne plus être négligeable et des techniques plus sophistiquées, par exemple, perforé DBS (PDB) comme méthode de Microprélèvement30 ou la préparation des taches de sérum séché (DSS)31 peut devraient s’appliquer au lieu de DBS classiques tests10.
Étant donné que de petites quantités de sang sont utilisées pour les essais de DBS (une goutte de sang capillaire se compose d’environ 50 µl)5, 16, variations dans le volume de l’échantillon sont essentiels et, certes, au moins une partie de l’écart entre les résultats sérologiques et du participant autodéclaré statut VHB et VHC enregistré pendant le pilotage de l’étude « DRUCK » sont imputables à cette variable. Le facteur le plus important pour réduire les « fluctuations » volume de l’échantillon est sans aucun doute une bonne technique de prélèvement sanguin capillaire, qui ne peut être atteint par une formation attentive et continue du personnel technique22. En outre, en tant que mesure de contrôle de la qualité, tous les laboratoires qui travaillent avec SRD devraient ont déjà lancé des procédures d’identification et par la suite, à l’exclusion des spécimens DBS qui doivent être considérées comme insatisfaisantes ou invalide16.
Des études menées principalement dans le contexte du VIH32 et dépistage néonatal33 ont montré que le taux d’humidité élevé peut conduire à une dégradation des analytes, mais jusqu’ici aucun consensus ne s’est dégagé au sujet de la question de combien de temps les DBS doit être séché à l’air . Un intervalle d’au moins 4 heures ou de préférence O/N est proposé dans la présente communication, qui a donc adopté des conditions qui ont servi dans la grande majorité de toutes les publications pertinentes32, 34 données sur le stockage de DBS à servir par la suite pour le VHB et le VHC test sont contradictoires. En 1981, Villa et ses collègues35, qui ont appliqué les techniques d’analyse contemporaines, a signalé que stockage à RT n’a pas affecté les résultats des analyses de VHB pendant la période d’observation complète de 180 jours si les titres d’anticorps étaient > 1/1 000, mais cette DBS est devenu borderline-positif ou négatif même après 15 jours, quand les titres dans le sérum sont seulement de 1/100. Stockage à-20 ° C ou 4 ° C n’a pas entraîné une amélioration substantielle. En revanche, une étude réalisée trente ans plus tard36 testé réplique d’un échantillon de VHB positifs, et les auteurs ont constaté qu’anti-HBc ainsi que les anticorps anti-HBs étaient stables jusqu'à 183 jours à ta, tandis qu’AgHBs dans les mêmes conditions est devenu faux-négatifs déjà après 63 jours. En ce qui concerne la détection de l’ADN du VHB d’éluats DBS, la concentration de l’acide nucléique viral a été stable pendant au moins sept jours à 37 ° C37 ou s’est avéré « résistants » au stockage à ta jusqu'à trois semaines38. Dépistage des anticorps anti-VHC à l’aide de deux disponible dans le commerce de troisième génération immunoessais39 a fourni des résultats précis pendant 117 jours en utilisant des échantillons DBS conservés à-20 ° C, 2 et 8 ° C et 20 – 25 ° C, respectivement. Stockage à-20 ° C, cependant, a entraîné la plus faible variation des densités optiques. Appliquer un anti-VHC de quatrième génération ELISA, c.-à-d. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, dans le contexte de DBS, essais, Larrat et al. 40 a observé une diminution forte spécificité analytique après avoir mémorisé les spécimens DBS pendant plus de trois jours à température ambiante. En revanche, les résultats des tests précis ont été obtenus avec le même kit utilisant les échantillons déposés pendant 60 jours dans des conditions différentes (-20 ° C, 2 et 8 ° C et 22 à 26 ° C) par Brandao et collègues de travail41. Observations sur la baisse des concentrations de l’ARN du VHC dans DBS dans diverses conditions de stockage comprise entre aucune modification notable à RT pour jusqu'à un an42 et un changement décuplée après quatre semaines à température ambiante43. Prenant ces données plutôt contradictoires sur la stabilité du VHB et VHC antigènes, acides nucléiques et des anticorps en considération, il semblait raisonnable de se rétracter dans le projet de protocole à un consensus, ce qui a été défini précédemment pour le stockage des spécimens DBS à utiliser pour Dépistage de15, 30: pour les dépôts à court terme (jusqu'à deux semaines) anticorps, antigènes et l’acide nucléique viral sont considérés comme stables à RT, alors que des conditions de gel ideale pour des périodes plus longues.
Trois paramètres en règle générale, sont à considérer lors de la conception d’un protocole d’élution : (1) la mémoire tampon d’élution. (2) la durée et la température d’élution ; et (3) l’élution tome23. Dans la grande majorité de toutes les publications pertinentes solution saline tamponnée au phosphate (PBS) servait à élution de DBS, et la plupart des auteurs a ajouté une protéine, par exemple, l’albumine sérique bovine (BSA) ou Tween 20, un agent tensio-actif, afin d’améliorer le signal de test en stabilisant protéines, car ils vont dans la solution et en même temps blocage non-spécifiques sites23. Seuls quelques rapports qui comparer directement les tampons d’élution différents dans le cadre des essais de DBS, sont disponibles. Villar et al. capacités d’élution presque équivalent à tous les tampons utilisés, mais PBS/BSA a enregistré 36, par exemple, 0,5 % ont abouti à la plus faible de réactivité non spécifique. Une observation très similaire a été faite par Croom et ses collègues44 lorsque vous appliquez le diluant de l’échantillon de la Genetics Systems rLAV EIE pour l’élution des anticorps anti-VHC de DBS. Étant donné que le risque de dégradation de l’échantillon est extrêmement faible dans les premières heures après la préparation de DBS (voir ci-dessus), il a été décidé à incuber les taches O/N à la température ambiante et à soutenir le processus d’élution en mélangeant la fin plus douce. Cette approche a l’avantage de spécimens poinçonnés de la précédente journée peut être directement transférée au diagnostic de routine au début du prochain matin23. Il convient d’adapter le volume de la mémoire tampon d’élution minimal part aux exigences des essais utilisés pour les analyses suivantes afin de conserver le facteur de dilution aussi bas que possible. Toutefois, une optimisation minutieuse des conditions d’élution pour chaque analyte unique n’était pas possible dans l’évaluation précédente parce qu’un débit élevé échantillon devait être garanti en relativement peu de temps au cours de l' « Étude de DRUCK »17. Par conséquent, le volume plutôt défavorable de 1 000 µl de tampon PBS a été utilisé afin de compléter le processus entier d’élution pour tous les paramètres dans deux opérations distinctes.
Cette approche une part échoue « complètement dans le système anti-HBc/anti-HBs pour les personnes infectées par le VIH en raison de la concentration d’anticorps faible ; ... et il nécessaire procédures biologiques moléculaires avec une sensibilité analytique optimale en ce qui concerne l’ADN du VHB et l’ARN du VHC teste. » 17 en revanche, le volume d’élution élevé avéré pour être en aucune manière désavantageuse pour le dosage de l’antigène HBs, anticorps anti-VHC et anti-VIH par les kits utilisés tout au long de l’évaluation. « La détection de l’AgHBs positifs issus de sang total éluats a réussi avec une sensibilité de 98,6 %, à un degré élevé de même que dans les études précédentes, qui avait utilisé en partie d’un plus petit volume d’élution de 100 µl, 250 µl, 600 µl ou 500 µl »17 ,36, 45, 46. La sensibilité de 97,8 % constatés lors de l’enquête de 179 paires de sérum/DBS pour anticorps anti-VHC correspondaient aux résultats d’un existant rapporte24, 44, 47, 48, 49, qui avait travaillé avec un volume d’élution qui était inférieur d’un facteur de 5 à 10. « En outre, les protocoles pour la détection des anticorps anti-VHC avaient été convenablement optimisés... en précisant leurs propres points de coupure »,17, 24, 48, 49 « ou en augmentant les volumes d’échantillon de 20 µl à 100 µl. » 17, 49 Enfin, la spécificité analytique et la sensibilité (100 %) mis en place pour la détection des anti-VIH étaient égaux ou supérieurs à d’autres immuno-essais spécifiquement adaptés aux DBS essai50, 51 , les caractéristiques de performances « ou un pas à pas procédure avec l’utilisation combinée de plusieurs tests anti-VIH »17,52. « Ils ont, en effet, d’aussi dépassaient le record de performance d’un test qui a été spécialement développé et optimisé pour la détection des anticorps anti-VIH dans les éluats DBS (Q-Prevent HIV 1 + 2 kit de DBS). » 17, 53  
Pris ensemble, le protocole étape par étape complète présenté dans la présente communication s’est avéré pour être un outil faisable et facile à utiliser pour la préparation et le traitement DBS et peut, ainsi, être utilisé avec fiabilité en virologie diagnostique. Il permet des approches utilisant automation 54 et en raison de ses caractéristiques excellentes performances a le potentiel pour servir en guise de première pierre pour un protocole futur consensus généralement reconnus dans le champ global de DBS, essais en laboratoire médecine.

L’idée d’utiliser le sang prélevé sur une carte de papier faite de cellulose est attribuée à Ivar Christian Bang (1869-1918), le père de microanalyse clinique moderne1, 2. En 1913, Bang déterminé le glucose à partir des mesures d’azote éluats de sang séché taches (DBS)3 et, plus tard, également réalisés à l’aide de la méthode de Kjeldahl avec cette technique de papier filtre2. Par la suite, plusieurs chercheurs ont observé sur l’utilisation de DBS pour les tests sérologiques pour diagnostiquer la syphilis2. Aussi tôt qu’en 1924, Chapman a résumé les avantages de DBS test quand il a souligné en particulier quatre éléments, qui sont encore valables aujourd'hui : ponction par rapport aux classiques (1), moins le volume sanguin est nécessaire et ce fait a été plus important en pédiatrie diagnostic ; (2) collecte de sang est simple, non invasif et peu coûteux ; (3) le risque de contamination bactérienne ou une hémolyse est minime ; et DBS (4) peuvent être conservées pendant de longues périodes avec presque aucune détérioration des analytes2, 4. Outre son utilisation dans le dépistage de la syphilis, outre les premières applications de la technique DBS inclus, par exemple, la détection d’anticorps contre la rougeole, les oreillons, poliovirus, virus parainfluenza et virus respiratoire syncytial (VRS) en 19532, l’identification des Shigella dans les excréments séchés sur du papier filtre et expédié par la poste de l’Indonésie à Leyde aux Pays-Bas ainsi que la détection des anticorps à Schistosoma dans DBS prises dans les zones d’endémie et analysé plus de trois mois plus tard5 . En 1963, cinquante ans après de Bang original communication2, 6, Guthrie a publié enfin sa célèbre méthode pour le diagnostic de la phénylcétonurie de DBS obtenue par une piqûre de talon de nouveaux-nés les7, 8.
Bien que depuis lors, DBS étaient considérés comme une méthode communément applicable pour rassembler, stocker, transporter et analyser une variété de fluides de corps humains5, leur utilisation dans le diagnostic reste principalement axée sur le diagnostic de infections surtout chez les ressources limitées et le dépistage systématique des nouveau-nés pour troubles métaboliques héréditaires pour des décennies les9, 10. Depuis 2005, cependant, une variété d’applications de DBS nouvelles et novatrices ont commencé à apparaître. Il en est résulté une augmentation presque exponentielle du nombre de publications scientifiques respectives sur DBS de 50 à près de 450 par an à l’heure actuelle. Parmi les applications émergentes sont des domaines aussi divers que la toxico - et les études de pharmacocinétique, profilage métabolique, suivi thérapeutique pharmacologique, toxicologie médico-légale ou pollution control10, 11.
Tests de DBS, ainsi, a une marche triomphale à travers des diagnostics en laboratoire clinique au cours des dernières années 1002. Comme en chimie clinique12, cependant, au cours de ce mois de mars pré-analytique variables ne étaient pas adéquatement considérées pendant de nombreuses années. En effet, même aujourd'hui, après des activités éminentes comme CDC papier-filtre évaluation projet13 ou l’élaboration d’une norme nationale pour la collecte de sang sur un papier filtre dans le cadre du dépistage14, la phase pré-analytique est encore largement sous-estimé dans la plupart des autres champs, dans laquelle DBS test est appliquée en5, 10.
Dans ce contexte, un protocole étape par étape complète14-16 pour utilisation dans les immunoessais et techniques moléculaires, qui couvre toutes les étapes essentielles, est suggéré pour la préparation et le traitement DBS dans la communication ci-après : (1) collecte de sang ; (2) préparation des gouttes de sang ; (3) séchage des gouttes de sang ; (4) le stockage et le transport ; (5) élution de DBS ; et enfin (6) analyses des éluats DBS. L’efficacité du protocole a été tout d’abord évaluée avec des paires de 1 762 sérum couplés/DBS pour détecter les virus de l’hépatite B (VHB) antigène de surface (AgHBs), anticorps dirigés contre l’antigène de noyau (anti-HBc), anticorps dirigés contre l’antigène de surface (anti-HB), l’ADN du VHB, anticorps pour le virus de l’hépatite C (VHC) (anti-VHC), essais de l’ARN du VHC et virus de l’immunodéficience humaine (VIH) 1-p24-antigène/anti-VIH 1/2 à l’aide d’une plate-forme entièrement automatisée ou qualitative sensible des acides nucléiques. 17. dans un deuxième temps, le protocole a été utilisé dans l’étude pilote « drogues et chronique Infectious Diseases » (« DRUCK Study ») qui a été menée par l’Institut Robert Koch-en étroite collaboration avec le Centre National de référence pour l’hépatite C sur actif usagers de drogue dans les villes allemandes de Berlin et Essen18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

L’idée de collecte de sang sur une carte de papier et par la suite en utilisant les taches de sang séché (DBS) à des fins diagnostiques, son originaires il y a un siècle. Depuis lors, DBS stable pour des décennies, est resté principalement axée sur le diagnostic des maladies infectieuses, notamment dans les milieux de ressources limitées ou le dépistage systématique des nouveaux-nés pour les maladies métaboliques héréditaires et seulement récemment ont une variété de nouvelles et innovantes applications DBS commencées à émerger. Pendant de nombreuses années, pré-analytique variables étaient considérées comme uniquement de façon inappropriée dans le domaine des tests de DBS et aujourd'hui encore, à l’exception des nouveau-nés de dépistage, toute la phase pré-analytique, qui comprend la préparation et la transformation de DBS pour leur l’analyse finale n’a pas été normalisée. Dans ce contexte, un protocole complet étape par étape, qui porte sur al les phases essentielles, est proposé, c'est-à-dire, une accumulation de sang ; préparation des gouttes de sang ; séchage des gouttes de sang ; stockage et transport de DBS ; élution de DBS et enfin des analyses des éluats DBS. L’efficacité de ce protocole a été d’abord évaluée avec des paires de 1 762 sérum couplés/DBS pour la détection des marqueurs du virus de l’hépatite B, virus de l’hépatite C et les infections de virus de l’immunodéficience humaine sur une plateforme analytique automatisée. Dans un second temps, le protocole a été utilisé au cours d’une étude pilote, qui a été menée sur des toxicomanes actifs dans les villes allemandes de Berlin et Essen.

L’efficacité du protocole proposé pour la préparation et le traitement de DBS a été tout d’abord évaluée par l’analyse de 1 762 paires de sérum couplés/DBS pour les marqueurs de l’infection à VHB, VHC et VIH. 17. à cet effet, DBS ont été préparés à partir de 100 µl de sang entier veineux (cf. points 2.1.1 – 2.1.6 du protocole précédent) et sont élués avec 1 000 µl de PBS-basée de la mémoire tampon, chacun, (cf. points 5.1 à 5.5 du protocole susmentionné) pour terminer le processus pour tous les sept paramètres dans deux opérations distinctes. Une telle approche sans optimisation minutieuse des conditions d’élution pour chaque analyte unique semble être inévitable car un débit assez élevé échantillon était prévu dans un temps relativement court pendant l’étude de terrain à paraître « drogues et chronique Infectious Diseases » (« DRUCK Study »).
Toutes les mesures ont adhéré aux recommandations du fabricant dans le cadre des analyses DBS, mais avaient dû être modifié en ce qui concerne les déterminations de l’AgHBs et l’anticorps anti-HBs pour compenser l’effet de l’hémolyse ou le résultat de la dilution. Avec une valeur de seuil de 0,05 UI/ml, tests AgHBs de DBS éluats conduisent à un taux de faux positifs de 14,7 % (52 sur 354) par rapport au sérum échantillons (Figure 2 a). Récepteur de fonctionnement caractéristique (ROC) analyse25, 26 des données indique qu’une augmentation du seuil à 0,15 UI/ml se traduirait par un idéal de la séparation de l’AgHBs positifs de HBsAg-négatifs (0,986 [sensibilité], 0,000 [1-spécificité], Figure 2 b). En revanche, avec un seuil de 10 UI/l pour la quantification d’anticorps anti-HBs, anticorps à qu'un taux de faux négatifs des mesures de 14,2 % (47 sur 331) a été enregistrent (Figure 2). Donc, après analyse ROC à nouveau, ce seuil a été abaissé à 1,5 UI/l pour obtenir une discrimination optimale des valeurs (0,917 [sensibilité], 0,007 [1-spécificité], Figure 2D).
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> Figure 2. Ag HBs et anticorps anti-HBs test dans les éluats DBS (modifiés d’après17). L’augmentation de ROC-guidée de la valeur de seuil pour la quantification d’AgHBs de 0,05 UI/ml (A) à 0,15 UI/ml (B) réduit le taux de résultats faussement positifs de 14,7 % à 0 %. De même, l’analyse ROC des concentrations d’anticorps anti-HBs suggère une diminution du seuil respectif de 10 UI/l (C) à 1,5 UI/l (D), éliminant ainsi complètement faux-négatifs, qui représentait initialement 14,2 % de toutes les déterminations. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
Les résultats des analyses couplées sérum/DBS sont résumés dans le tableau 117. Aucun non-spécificité a été enregistrée au cours de la DBS stable pour tous les analytes de sept.
Lorsque les éluats DBS ont été étudiés pour la présence de l’AgHBs, i. e. le paramètre key sérologique d’une infection aiguë ou chronique par le VHB, une sensibilité analytique de 98,6 % a été déterminée. AgHBs concentrations dans les deux sérums faussement négatifs étaient 749 UI/ml et 6 UI/ml, respectivement. Anticorps anti-HBc ont été correctement détectés dans 176 sur 204 (i. e 86,3 %) Éluats DBS. Vingt-deux sur les 28 spécimens qui n'ont pas été détectés par les mesures provenaient de personnes co-infectées par le VIH. Donc, si les personnes séropositives ont été exclues du calcul, une sensibilité de 97,1 % a été atteint pour récupérer les anticorps anti-HBc de sang veineux entier séché éluée. Des observations similaires était vraies pour le dosage des anticorps anti-HBs. Même après ajustement de la valeur seuil du test à 1,5 UI/l, neuf résultats DBS sérum discordants s’est produite. Chez les patients ne pas co-infectés par le VIH, les concentrations sériques d’anticorps anti-HBs de 11 – 26 UI/l ont été trouvées, qui étaient trop faibles pour permettre une détection après élution du sang séché.
Anticorps anti-VHC sont révélateurs de soit une infection aiguë ou chronique ou résolue. Des résultats faussement négatifs anti-VHC (i. e. 2.2 %) seulement quatre ont été déterminées par les éluats DBS et autres analyses sérologiques et moléculaires a clairement démontré que les sérums respectifs proviennent très probablement de patients, dont les infections avaient depuis longtemps été résolu.
La détection des anticorps anti-VIH dans les éluats DBS avec le système entièrement automatisé a été un processus complètement lisse qui a rapporté une sensibilité analytique de 100 %.
« L’ADN du VHB moyenne concentration de sang éluats a été réalisée sur 100 spécimens (ADN concentration moyenne : 1 573 898 UI/ml, gamme : < 357 - > 17,860,000 UI/ml) et a donné une valeur de 93,0 %. Ainsi, sept échantillons avec des concentrations d’ADN-VHB sérique entre 409 et 3 643 UI/ml n’ont pas été détectés par la DBS stable. De 100 sérums qui s’étaient avérés positifs l’ARN du VHC (concentration de l’ARN du VHC moyenne : 1 415 944 UI/ml, gamme : 2 479 - > 7 692 000 UI/ml), correspondant aliquotes de sang étaient disponibles. L’enquête comparative a entraîné une sensibilité analytique de 100 % pour les déterminations de l’ARN du VHC d’éluats DBS. » 17
Pour tester le protocole indiqué pour préparer et traiter les DBS dans des conditions naturelles, il a été utilisé en étroite collaboration avec l’Institut Robert Koch-(Berlin, Allemagne) au cours de la phase pilote de l’étude « Drogues et chronique maladies infectieuses », qui a été menées sur les usagers de drogue actifs dans les villes allemandes de Berlin et Essen18. Tous les 534 participants inscrits (433 hommes et 101 femmes) a subi le prélèvement sanguin capillaire comme décrit en détail dans les sections 2.2.1 à 2.2.3 du protocole précédent, et DBS sont, encore une fois, éluées par addition de 1 000 µl de tampon PBS.
Deux personnes ont été diagnostiquées pour être une infection chronique par le VHB, et 39 a montré le modèle sérologique d’une infection à VHB résolu. En outre, quinze participants étaient positifs pour les anticorps anti-HBs (statut après la vaccination) et huit se sont révélés positifs pour les anticorps anti-HBc seul. La prévalence des anticorps anti-VHC parmi les participants était de 57,3 % (N = 193) à Berlin et à 73,0 % (N = 144) à Essen. De l’anticorps positifs des échantillons 65 % (N = 125) et 62 % (N = 89) ont été également virémique. Vingt-cinq sur les 534 personnes étaient positifs anti-VIH. Dix-neuf des infections étaient déjà connues et 24 d'entre eux ont été co-infectées par le VHC.
Les résultats obtenus lors d’essais de DBS ont été soigneusement comparés avec les données anamnestiques des participants à l’étude concernant le statut VHB et VHC auto-déclarés. Cette comparaison en conjonction avec les résultats des tests couplé paires de sérum/DBS a conduit à des modifications mineures de l’algorithme de test pour la phase principale de l’étude « DRUCK » qui va s’inscrire des toxicomanes actifs dans six autres grandes villes allemandes : « Individuals infectés par le VIH est toujours testé pour la présence d’ADN du VHB. Participants dont éluats DBS sont positifs pour les anticorps anti-HBc ou anti-HBs doivent être soumis à une ponction veineuse au cours d’une deuxième consultation pour clarifier définitivement leur statut d’anticorps anti-HBc/anti-HBs et, enfin, tous les éluats DBS seront projetés pour l’ARN du VHC Quelles que soient les résultats des tests d’anticorps anti-VHC. » 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>Paramètres</td>
			<td>Couplé sérums/DBS éluats (N)</td>
			<td>Résultats discordants (N)</td>
			<td>Raison des différences entre les tests sériques et les éluats DBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>VHB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>AgHBs</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>Deux patients avec une infection chronique par le VHB. Ils étaient sous traitement antiviral et un d'entre eux était co-infectés par le VIH. Concentrations d’antigène HBs dans le sérum : 749 UI/ml et 6 UI/ml, respectivement.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anticorps anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>Dans le sérum, vingt-deux patients avaient une infection par le VHB résolu. Six individus ont montré le résultat sérologique « anti-HBc seul ». Vingt-deux des patients ont été co-infectées par le VIH. Des « résolveurs VHB », vingt ans ont été évalués comme « Anti-HBs positif seul » en testant DBS et, par conséquent, étaient faussement classées comme « condition après la vaccination ».</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anticorps anti-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>Les quatre patients ne pas co-infectés par le VIH avaient sériques d’anticorps anti-HBs de ‑ 11 26 UI/l, qui étaient trop faibles pour permettre une détection des anticorps après élution des taches de sang séché.</td>
		</tr>
<tr>
<td>ADN DU VHB</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>Les sérums respectifs ont été obtenus de sept patients avec des concentrations d’ADN-VHB sérique allant de 409 UI/ml à 3 643 UI/ml.</td>
		</tr>
<tr>
<td>VHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Anticorps anti-VHC</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>Ces quatre sérums ont été prises chez les patients, avec de longues depuis résolu par le VHC.</td>
		</tr>
<tr>
<td>ARN DU VHC</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
<tr>
<td>VIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>VIH 1-p24/anti-VIH 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Résultats obtenus à partir de 1 762 DBS, qui ont été préparés et transformés à base de qui suit le sang veineux tout le protocole proposé dans la présente communication, comparativement aux résultats dans des échantillons de sérum couplés comme référence.

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Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

La préparation et le traitement des taches de sang séché (DBS) pour leur analyse finale sont encore mal standardisées pour la plupart des applications diagnostiques. Pour remédier à cette lacune, un protocole étape par étape complète est suggéré et évalué par la suite en ce qui concerne son efficacité pour la détection des marqueurs des infections virales.

Taches de sang séché - préparer et traiter pour utilisation dans les immunoessais et Techniques moléculaires

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

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39.4K vues.  University of Duisburg-Essen. La préparation et le traitement des taches de sang séché (DBS) pour leur analyse finale sont encore mal standardisées pour la plupart des applications diagnostiques. Pour remédier à cette lacune, un protocole étape par étape complète est suggéré et évalué par la suite en ce qui concerne son efficacité pour la détection des marqueurs des infections virales.

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Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Techniques de microinjection pour l&#39;étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Recherche

Biologie

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonde microfluidique: Fonctionnement et utilisation pour le traitement de surface localisé

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Non-Terminal techniques d&#39;échantillonnage de sang chez les cobayes

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Techniques pour l&#39;analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Collecte de sang répétées pour des tests sanguins dans le poisson zèbre adulte

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

L&#39;Assemblée et l&#39;application des «Shear Anneaux»: A Novel Endothelial Modèle pour Orbital, unidirectionnel et périodique Fluid débit et contrainte de cisaillement

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Techniques de phénotypage micron-échelle de maïs faisceaux vasculaires issu de tomographie à rayons x Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...