이 통신 이전 바이러스학 저널 BioMed 중앙로 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>)의 조건에 따라 오픈 액세스 모드에서17 에 게시 하는 결과에 따라 한 정식 사용자입니다. 저자 기꺼이 인정 조종 연구의 프레임 워크에서 열매가 많이 열리는 협력 "약물 및 만성 전염병" ("DRUCK 연구") 미국 마커 스, W. Cai, W. 장와 R. 짐머에서는 로버트 코흐 연구소 (베를린, 독일)과 그림 1 뿐만 D. F. Whybrew, 박사 (괴팅겐, 독일)로 해결 하기 위한 조립 사진 복용에 대 한 S. Moyrer에 게 감사 하는 원고. 또한 제이 Ackermann, E. Bayrambasi, 미국 Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. 자아 르에 숙련 된 기술 지원에 대 한 그들의 감사를 표현 하는 그들은 M. Schröter와 K.이. 이 연구는 부분적으로 지원 국가 참조 센터 건강의 독일 교육부의 교부 금에 의해 간염 c

프로토콜은 의료 진단에 사용 하기 위해 설계 되었습니다, 이후 응용 프로그램 헬싱키 선언19의 원칙을 준수 해야 합니다. 이 통신에 제시 하는 결과의 첫 번째 부분에 대 한 두 환자에 의해 별도 계약 및 윤리 위원회에 의해 승인 될 듯 불가결 두 가지 이유: (1) "입학" 에센 대학 병원, "모든 환자 제공 시 서 면된 동의 모든 필요한 생화학, 세균, 및 virological 조사. " 17 (2) "DBS 테스트의 평가에서 사용 되는 모든 샘플에 보내진 일상적인 임상 진단 과정에서 바이러스학 연구소. 따라서, 아무도 표본 연구 목적을 위해 특별히 수집, 하지 단일 추가 venipuncture 수행 및 자료의 정상적인 과정에서 의사에 의해 요구 된 모든 매개 변수에 대 한 테스트를 했다 진단 작업 업입니다. " 17 연구 "약물 및 만성 전염병" (DRUCK 연구 ")18, 있는 DBS 테스트 마지막으로 사용 되었다 베를린, 에센의 독일 도시에서 적극적으로 약물을 주사 하는 사람을 평가 하는 데이터에 대 한 연방 위원에 의해 승인 되었다 보호 및 자유 정보 (베를린, 독일)의 고도 의료 대학 Charité (베를린, 독일)의 윤리 위원회로.
1입니다. 혈액의 수집
<ol><li>Venipuncture14, 15, 20, 21<ol>
<li>일회용 라텍스 고무 장갑에 넣고 적절 한 살 균 제, 예를 들어, 70% 이소프로필 알코올 의도 펑크 사이트 (선호 메디아 cubital 정 맥 antecubital 포에서)의 영역을 청소.</li>
		<li>적용 한 지 혈 대 정 맥 distend를 putative 펑크 사이트 위에 4-6 인치. 환자의 정 맥에 바늘을 안내 하 고, 일단 자리에, 부드럽게 연결 된 혈액 튜브, EDTA 항 응고 제로 포함 된 채우기.</li>
		<li>최대한 빨리 venipuncture 완료 되는 지 혈 대 놓고 바늘을 철회. 그런 다음, 이후에 열릴 수 있다 장소에서 붕대에 의해 찔린 사이트에 마른 거 즈 패드를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피부 빵 꾸 (그림 1A)13-15, 20, 22, 23,<ol>
<li>일회용 라텍스 고무 장갑 한 켤레를 입었다.</li>
		<li>피부 빵 꾸, 전에 환자 자신의 손을 따뜻하게 해야. 손가락 마사지 anterogradely 리치 사이트 펑크 쪽으로 혈액 흐름 이다.</li>
		<li>적합 한 살 균 제, 예를 들어, 70% 이소프로필 알코올 비 쓰기 손의 세 번째 또는 네 번째 손가락의 팁 원심 phalanx의 손바닥 쪽의 피부를 청소. 단일 사용 안전 란 셋에 의해 피부를 찔린 합니다. 중력은 손가락에 혈액의 수집을 용이 하 게 같은 위치에 손가락을 개최 한다.</li>
		<li>피부 펑크에 의해 모 세관 혈액의 수집 완료 되 면 손가락 끝에 붕대를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 준비의 핏 자국
<ol><li>Venipuncture15 에 의해 수집 된 혈액에서 준비<ol>
<li>필터 카드에 수집 된 안티 응고 (EDTA) 전체 정 맥 피를 최대한 빨리 자리. Venipuncture 후 24 시간 이상 말린된 핏 자국을 준비 하지 마십시오.</li>
		<li>필터 카드에 환자의 식별에 필요한 모든 정보를 넣어. 한 개인의 혈액 만으로 하나의 카드를 발견 한다.</li>
		<li>일회용 라텍스 고무 장갑에 넣어.</li>
		<li>부드럽게 반전 혈액 컬렉션 튜브 2-4 시간 하 고 이후 신중 하 게 마 개를 엽니다.</li>
		<li>일회용 팁을 피 펫을 사용 하 여 전체 정 맥 혈의 50 µ l 발음 필터 종이 피 펫의 끝을 직접 건드리지 않고 한 원의 중심에 혈액을 전송. 완전히 포화 원 하려고 합니다.</li>
		<li>카드의 모든 필요한 서클을 채우기 위해이 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피부에 의해 수집 된 혈액에서 준비 펑크 (그림 1B 및 1 C)13-16, 23<ol>
<li>거 즈 패드와 함께 혈액의 첫 번째 드롭 다운을 닦아 초과 조직 체액을 포함할 수 있기 때문에. 펑크 사이트에서 혈액 흐름을 증가를 다시 손가락을 마사지. 손가락으로 직접 화면을 건드리지 않고 다음 드롭 필터 카드의 서클 중 하나에 전송. 혈액 모 세관 힘만에 의해 필터의 질감에 배어 있을 수 있습니다.</li>
		<li>손가락 끝에서 모 세관 혈액 형성의 다음 큰 드롭 시키고 원에 수집. 모든 필요한 동그라미 가득 또는 혈 중지 될 때까지이 절차를 계속 합니다.</li>
		<li>쥐 어 짜기 하지 또는 "우유" 손가락 지나치게 혈액 흐름 필터 카드의 모든 필요한 서클을 채우기 위해 충분 하지 않은 경우. 혈 중지 손가락 끝에는 붕대를 놓습니다. 더 많은 혈액 검사를 위해 필요한 경우에 다른 손가락 두 번째 피부 빵 꾸를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 혈액 명소의 건조
<ol><li>핏 자국 건조, 넣어 깨끗 한 종이에 카드 생물 안전 캐비닛에 수건 고 말리, 필터 선호 O/N (하지만 적어도 4 시간), 열의 어떤 외부 소스의 부재에 실시간에. 건조 과정 완료 되, 혈액의 관광 명소는 균일 하 게 어두운 갈색 색상 고 없는 빨간색 영역을 볼 수 있습니다 더 이상 (그림 1D)13, 15, 16.</li>
</ol>4. 저장 및 건조 혈액 명소 (DBS)의 교통
참고: 혈액 명소의 처리 건조 후 중단 될 수 있습니다. 필터 카드 이제 저장된13-16, 23수 있습니다.
<ol><li>스토리지, 필터 종이 카드는 표본 습기 로부터 보호 하기 (그림 1E) 1 ~ 2 desiccant sachets을 포함 하는 단일, 가스 불 침투성 지퍼 가방에 넣어. 습도 지시자 카드는 필요에 따라 추가 합니다.</li>
	<li>-20 ° C의 온도 냉동 실에이 가방을 전송 또는 가능한 한 빨리 낮은. 냉동 고를 필드 조건에서 사용할 수 없는 경우, 최대 14 일 동안-4 ° C에서 또는 심지어 주위 온도에 저장은 가능 합니다.</li>
	<li>드라이 아이스에 냉동된 DBS 표본 전송. 필터 카드 처음 온도에서 보관, 지퍼 되었는데 내부 컨테이너 뿐만 아니라 내부 및 외부 봉투의 구성 된 트리플 패키징 시스템을 사용 합니다. 아니 콘텐츠 표시 일반 우편 배송에 대 한 외부 봉투에 필요 하지만 국제 생물 학적 기호16기본 내부 컨테이너 부착 해야 합니다.</li>
	<li>건조제 팩 및 추가 습도 지시자 카드는 핑크 색상을 변경 하는 경우 추가 처리에서 필터 카드를 제외 합니다.</li>
</ol>5. 건조 혈액의 차입 명소13, 15, 16, 23
<ol><li>단일 사용 6 m m 장치 학년 903 필터 카드 (그림 1 층)의 혈액 젖 ㄴ 원 각에서 한 자리 펀치. 한 환자에서 12-잘 접시의 한 잘 모두 천공된 말린된 핏 자국을 전송.</li>
	<li>0.05% 트윈 20와 0.08% 나트륨 아 지 드 (그림 1G)을 포함 하는 인산 염 버퍼 염 분에 잘 채워. 말린된 피 반점 있다의 후속 분석을 위해 사용 하는 분석 결과의 최소한의 각 요구 사항에 추가 된 버퍼의 볼륨을 적응.</li>
	<li>분자 분석을 수행 하기 위해 자리 있다 건조 혈액의 두 번째 시리즈를 얻기 위해이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>셀 문화 접시 실험실 셰이 커에 넣고 부드럽게 4 시간 최소 elute 천공된 말린된 혈액 명소 하 게 또는, 선호, O/N (그림 1 H).</li>
	<li>다음 날, 관광 명소는 혈액에서 거의 자유롭다 고 hemolytic supernatants (그림 1I) 형성. Microcentrifuge 튜브 전송이 있다. 그런 다음, 차입 (그림 1 K) 동안에 형성 했다 어떤 파편 든 지에서 supernatants를 10500 x g (그림 1J)에서 2 분 동안 원심 분리를 그들을 주제.</li>
</ol>6입니다. 있다 분석
<ol><li>Centrifuged 있다 의도 분석에 사용할 수 지금 있습니다. B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스 및 상용 키트를 사용 하 여 HIV 감염의 표시를 위한 있다 조사 하 고 해당 제조 업체의 지침을 따르십시오 (그림 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> 그림 1. 준비 및 건조 혈액 명소 immunoassays 분자 기법에 의해 사용 될에이 통신에 제안 된 프로토콜의 그래픽 요약. 전체 정 맥 혈과 모 세관 혈액 바소 (A)에 의해 venipuncture 또는 피부의 펑크에 의해 얻은 말린된 혈액 자리 분석 표본으로 봉사 할지도 모른다. 학년 903 필터 카드 (B, C)의 서클에는 혈액의 양도, 후 샘플 해야 건조 선호 O/N 생물 안전 캐비닛 빨간색의 어떤 interspersion 없이 균등 하 게 갈색 색상의 양식 명소에 주위 온도에 (D) 지역입니다. 건조 혈액 명소 완료 되 고 저장이 필요한 필터 카드 포장 될 수 있다 1-2 desiccant sachets (E)을 포함 하는 가스 불 침투성 지퍼 가방에. 통 (H에 최소 4 시간 또는, 선호, O/N의 PBS 기반 버퍼에 펀치의 차입 (F, G), 원의 중심에서 6 mm 단일 사용 장치에서 펀치의 세대를 구성 하는 DBS의 실험실 처리 ), 있다 (나), 그리고 마지막으로 실험실 컵 (J) (K) 과정에서 차입 유래 수 어떤 파편 든 지에서 DBS 있다 무료의 원심 분리의 복구. 그 후, DBS 있다 각각 HBV, HCV, HIV 감염의 혈 청 학적인 마커를 탐지 하기 위해 완전 자동화 된 플랫폼 (L)에 의해 수행 되었다 분석에 대 한 준비가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

과거에는, RSR 애 보트 진단에서 강 및 그의 과학적인 일에 대 한 재정 지원을 제공 하는 사례금을 받았다. NG와 옴 들은 전혀 상반 되는 관심사를 선언 합니다.

DBS 100 년2 에 대 한 사용 되었습니다 하지만, 놀랍게도, 아직 그들의 준비 및 처리에 대 한 일반적인 합의 없다입니다. 날짜 하려면,이 중요 한 사전 분석 단계의 충분 한 표준화만 달성 하고있다 신생아 검사14의 분야에서 다양 한 다른 프로토콜 DBS 테스트5, 16, 23의 다른 모든 응용 프로그램에 대 한 존재 하는 반면. 이 놀라운이 극복 하기 위해 immunoassays과 분자 기술로 활용 될 준비 하 고 DBS를 처리에 대 한 포괄적인 단계별로 지침이이 통신에 및 그 효과 관한 평가 HBV, HCV, HIV 감염의 마커를 감지에 대 한 합니다. 다음 논의의 초점은 주로 제안 된 프로토콜의 여러 단계에 배치 됩니다.
많은 다른 지를 테스트 하는 DBS의 역사에서 카드 사용된2 왔지만 오늘만 두 상용 소스 장치로 클래스 II 의료 혈액 컬렉션5, 16에 대 한 FDA에 의해 승인 됩니다. 이러한 필터 카드 시스템 매우 균일 하 고 그들 중에 준비 하는 모 세관 혈액에서 얻은 분석 결과 4%-528이상으로 차이가 없습니다 있도록 매우 유사한 흡수 특성을가지고. 아니나 다를까, Masciotra와 동료29 따라서 hiv-1 RNA를 발견 다른 소스에서 혈액 컬렉션 카드에서 차입 후 질적 분석 결과와 동등 하 게 잘. 이러한 데이터를 감안할 때, 그것은 제외할 수 있습니다 거의 테스트 때 관찰 하는 불일치의 HBV, HCV의 표식에 대 한 혈 청/DBS 쌍을 결합 하 고 HIV 감염17 혼자 필터 카드의 선택에 의해 발생 했다. 그러나, 정확한 정량화 된 분석의 불가결 이면 소스-소스 변형 더 이상 무시할 수 없습니다 및 더 정교한 기술, 예를 들어, microsampling30 또는 준비 하기 위한 방법으로 DBS (PDB) 천공 건조 혈 청 관광 명소의 (DSS)31 기존의 DBS10테스트 대신 적용할 할 수 있습니다.
DBS 테스트에 사용 되는 작은 양의 피 때문 (모 세관 혈액 한 방울 이루어져 약 50 µ l)5, 16, 샘플 볼륨 변화는 중요 한, 그리고 명백 하 게, 적어도 일부의 혈 청 학적인 결과 사이의 불일치 그리고 참가자의 자기 보고 "DRUCK 연구"의 조종 하는 동안 기록 하는 HBV 및 HCV 상태가 변수에 기인. 샘플 볼륨의 "변동"을 최소화 하기 위한 하나의 가장 중요 한 요인은 의심할 여 지 없이 기술 인력22의 신중 하 고 지속적인 훈련에 의해 달성 될 수 있는 모 세관 혈액 컬렉션의 올바른 기술입니다. 또한, 품질 관리의 수단으로 모든 실험실 작업 DBS는 이미 시작 합니다 식별 하 고 그 후 불만족 또는 유효 하지 않은16으로 간주 될 수 있는 DBS 표본 제외에 대 한 절차.
주로 HIV32 의 맥락에서 연구 하 고 신생아 심사33 높은 습도, analytes의 저하로 이어질 수 있습니다 하지만 지금까지 아무런 합의 도달 했습니다 얼마나 DBS air-dried 해야한다의 질문에 대 한 . O/N이이 통신에서 HBV와 HCV에 사용할 이후에 모든 관련 간행물32, 34 데이터 DBS의 저장에의 대다수에서 사용 된 조건을 따라서 채택 제안 간격 4 시간 이상 또는 선호 테스트 상반 된다입니다. 1981 년, 빌라와 동료35, 현대 분석 기법을 적용, 보고는 RT에 스토리지 미치지 않았다 HBV 분석의 결과 180 일의 전체 관찰 기간 동안 항 체 titers 라면 > 1/1000, 하지만 그 DBS 15 일 titers 혈 청에만 1/100 후 경계선 긍정 또는 부정적인 되었다. -20 ° C 또는 4 ° C에서 저장 상당한 개선에 발생 하지 않았다. 대조적으로, 30 년 이상36 테스트 HBV 양성 샘플의 복제를 연구 하 고 저자 발견 그 Anti-hbc 뿐만 아니라 안티-HBs 항 체 했다 최대 183 일 동안에 RT, 안정적인 반면 동일한 조건 하에서 HBsAg 되었다 63 일 후에 이미 false 음수가 DBS 있다에서 HBV DNA 검출, 관련 바이러스 핵 산의 농도 37 ° C37 에 적어도 7 일 동안 안정 또는 최대 3 주까지 RT에서 저장소에 "저항" 입증38. 117 일 DBS 샘플-20 ° C, 2-8 ° C, 및 20-25 ° C에 각각 저장을 사용 하 여 기간에 대 한 정확한 결과 제공 하는 immunoassays39 두 상용 제 3 세대를 사용 하 여 안티-HCV 항 체 테스트. 하지만-20 ° C에서 저장, 광학 밀도의 낮은 변화 귀착되는. 적용 하는 4 세대 안티-HCV ELISA, 즉, Monolisa HCV-Ag-Ab-울트라, DBS 테스트, Larrat 그 외 여러분 의 맥락에서 40 데시벨 표본 실시간에 3 일 이상 저장 후 분석 특이성에 날카로운 감소를 관찰 다른 한편으로, 정확한 테스트 결과 같은 키트 샘플 Brandao 및 동료41에 의해 다양 한 조건 (-20 ° C, 2-8 ° C, 및 22-26 ° C)에서 60 일 동안 입금을 이용 하 여 얻은 했다. 다양 한 보관 조건에서 DBS에서 HCV RNA 농도의 감소에 대 한 관찰 최대 1 년42 RT에서 없음 중요 한 변경에서 온도434 주 후 10 배로 변경 범위. DBS 표본 사용할 수의 저장소에 대 한 이전 정의 합의를 제안 된 프로토콜에서 철회 합리적인 듯 HBV 및 HCV 항, 핵 산 및 계정에 항 체의 안정성에이 오히려 충돌 데이터를 복용, HIV 검사15, 30: 단기 증 착 (최대 2 주)에 대 한 항 원, 바이러스 성 핵 산 및 항 체 간주 됩니다 RT에서 안정으로 오랜 동안 보관 냉동된 조건에는.
일반적으로 세 개의 매개 변수가 고려 되어야 할 때 차입 프로토콜 설계: (1) 차입 버퍼; (2) 기간 및 차입;의 온도 (3) 차입 볼륨23. 모든 관련 간행물의 대다수에서 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) DBS, 방출 사용 되었다 고 대부분 저자 추가 단백질, 예를 들면, 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 트윈 20, 계면 활성 제, 안정화 하 여 분석 결과 신호를 개선 단백질, 그들은 솔루션을 동시에 차단 비 특정 바인딩 사이트23로 서. DBS 테스트의 컨텍스트에서 다른 차입 버퍼, 직접 비교는 단지 몇 가지 보고서를 사용할 수 있습니다. 빌라 외. 36, 예를 들어, 기록 된 모든 버퍼 PBS/BSA 하지만 사용에 대 한 거의 차입 용량 0.5% 비 특정 반응성의 저급에 결과. 매우 비슷한 관찰 Croom 및 동료44 에 의해 만들어진 DBS에서 안티-HCV 항 체의 차입에 대 한 유전학 시스템 rLAV EIA의 표본 희석제를 적용할 때. 관광 명소 주위 온도에 O/N을 품 어 부드러운 끝 이상 혼합 하 여 차입 과정을 지원 하 고 샘플 저하의 위험 DBS (위 참조)의 준비 후 첫 번째 시간에서 매우 낮은 이기 때문에, 결정 되었다. 이 방법은 표본 이전 날 렸을 장점이 하루 옮겨질 수 있다 직접 일상 진단 일찍 다음 아침23. 차입 버퍼의 희석 비율을 가능한 한 낮게 유지 후속 분석을 위해 사용 하는 분석 실험의 최소한의 각 요구 사항에 적응 한다. 그러나 높은 견본 처리량 "DRUCK 연구"17동안 비교적 짧은 시간에 보장 해야 하기 때문에, 모든 단일 분석에 대 한 차입 조건의 주의 최적화 이전 평가에서 가능 하지 않았다. 따라서, 오히려 불리 한 볼륨 PBS 기반 버퍼의 1000 µ l의 두 가지 별도 작업의 모든 매개 변수에 대 한 전체 차입 과정을 완료 하기 위해 사용 되었다.
하나이 이렇게 한 손으로 "완전히 낮은 항 체 농도; 인해 HIV에 감염 하는 그 개인에 대 한 안티-HBc/안티-HBs 시스템에서 실패 ..., 그것은 분자 생물학 절차 HBV DNA에 관해서는 최적의 분석 감도 및 필요 HCV RNA 검사. " 17 다른 한편으로, 높은 차입 볼륨 어떠한 방식으로 HBsAg, 안티-HCV, 및 평가에서 사용 되는 키트에 의해 반대로 HIV에 대 한 불리 한 것으로 판명. "전체 혈액 있다에서 긍정적인 재료 100 µ l, 250 µ l, 또는 600 µ l, 500 µ l의 훨씬 작은 차입 볼륨 사용 부분에서 이전 연구에서 유사 하 게 높은 정도로 98.6%의 감도와 성공 HBsAg의 검출"17 36, 45, 46. 안티-HCV 항 체는 이미 존재의 결과에 대응에 대 한 179 혈 청/DBS 쌍의 조사에서 결정 하는 97.8%의 민감도 보고서24, 44, 47, 48, 49, 5 ~ 10 배 낮은 차입 볼륨 근무 했다. "또한, 안티-HCV 검출에 대 한 프로토콜 했다 적절 하 게 최적화 되었습니다... 자신의 잘라 포인트를 규정 하 여"17, 24, 48, 49 "또는 20 µ l에서 100 µ l의 샘플 볼륨을 증가." 17, 49 마지막으로, 분석 특이성 및 감도 (100%) 반대로 HIV 탐지에 대 한 설립 했다 같거나 다른 immunoassays DBS 테스트50, 51 에 특히 적응의 성능 특성에 우수한 "나는 단계적 몇 가지 항 HIV 테스트의 결합된 사용과 절차"17,52. "그들은, 실제로, 또한 초과 했다 특별히 개발 되었으며 DBS 있다 (Q 방지 HIV 1 + 2 DBS 키트)에서 항 HIV 항 체의 검출에 대 한 최적화 된 분석 결과의 성능 기록." 17, 53  
함께 찍은,이 통신에 포괄적인 단계별 프로토콜 가능 하 고 사용자 친화적인 도구를 준비 하 고 처리 하는 DBS 입증 하 고 따라서 진단 바이러스학에 안정적으로 사용할 수 있습니다. 그것은 자동화 54 를 사용 하 여 접근을 허용 한다 고 우수한 성능 특성으로 인해 종류 DBS 실험실에서 테스트의 글로벌 분야에서 미래의 일반적으로 허용된 합의 프로토콜에 대 한 초석의 역할을 의학입니다.

셀 루 로스로 만든 종이 카드에 수집 된 혈액을 사용 하는 아이디어는이 기독교 방 (1869-1918 년), 현대 임상 microanalysis1, 2의아버지 관찰 작용. 1913 년에 쾅 있다 건조 혈액 명소 (DBS)3 의 하 고, 나중에, 또한 질소 측정 킬달 메서드를 사용 하 여이 필터 종이 기술2에서 포도 당 결정. 그 후, 여러 조사를 매 독2진단 혈 청 학적인 테스트 위한 DBS의 사용에 보고. 마찬가지로 일찍 1924 년에서 채 프 먼 DBS 테스트의 장점을 요약 때 그가 특히 강조는 여전히 유효한 오늘 4 개 항목: (1) 기존에 비해 venipuncture, 적은 혈액 볼륨 필수 이며이 사실을 소아에서 가장 중요 한 진단; (2) 혈은 간단, 비 침략 적, 하 고 저렴 한; (3) 세균 오염 또는 용 혈이 최소한의; 그리고 (4) DBS analytes2, 4의 거의 아무 저하와 오랜 기간 동안 보존 될 수 있습니다. 매 독에 대 한 테스트에 사용, 게다가 DBS 기술의 더 이른 응용 프로그램, 예를 들면, 홍 역, 유행 성 이하선염, 소아마비, 파라 인플루엔자 바이러스, 그리고 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 항 체의 검출에에서 포함 19532, 배설물에서 이질균의 식별 필터 종이에 건조와 DBS 발병 지역에서 촬영 하 고 3 개월 후 분석5에서에서 Schistosoma에 항 체의 검출으로 서 네덜란드 라이덴 인도네시아에서 일반 우편으로 배송 . 1963 년, 50 년 후 빵의 원래 통신2, 6, 오클라호마 마침내 출판 신생아7, 8에서발뒤꿈치 미친 놈 여 DBS에서 페닐케톤뇨증의 진단에 대 한 그의 유명한 방법.
그 시간 이후부터 DBS는 수집에 대 한 일반적으로 적용 가능한 방법으로 간주 되었다, 저장, 수송, 및 다양 한 인간의 체액5, 분석 진단에 그들의 사용 아직도 남아의 진단에 주로 초점을 맞춘 리소스 제한 설정 및 수십 년9, 10에 대 한 상속 된 대사 장애에 대 한 신생아의 체계적인 검사에 특히 감염. 그러나 2005 년부터,, 새로운 혁신적인 DBS 응용 프로그램의 다양 한 등장 하기 시작 했다. 이 결과 현재에서 매년 거의 450 약 50에서 DBS에 각각 과학적인 간행물의 수에 거의 기 하 급수적 증가. 신흥 응용 프로그램 toxico-그리고 pharmacokinetic 연구, 대사 프로 파일링, 치료 약물 모니터링, 법의학 독성, 또는 환경 오염 제어10, 11등 다양 한 분야 이다.
DBS 테스트, 따라서, 했다 임상 실험실 진단을 통해 개선 3 월 동안 과거 100 년2. 그러나 임상 화학12에서,이 3 월 중 사전 분석 변수 하지 적절 하 게 고려 되었다 몇 년 동안. 사실, 심지어 오늘날, CDC의 필터 종이 평가 프로젝트13 또는14, 사전 분석 단계를 차단 하는 신생아의 프레임 워크에서 필터 종이에 혈액 컬렉션에 대 한 국가 표준의 정립 등 저명한 활동 후 여전히 크게 과소 평가는 DBS 테스트는 적용5, 10, 다른 분야의 대부분 에입니다.
이 배경을 감안할 때, 포괄적인 단계별 프로토콜14-16 에서 사용 immunoassays 분자 기술에 커버의 모든 필수 단계, 준비 하 고 다음과 같은 통신에서 DBS를 처리에 대 한 제안: (1) 컬렉션의 혈액; (핏 자국;의 준비 2) (3) 건조 혈액 명소; (4) 저장과 수송; (DBS;의 차입 5) 그리고 마지막으로 (6) 분석의 DBS 있다. 프로토콜의 효과 처음 평가 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍 B 형 간염 바이러스 (HBV) 표면 항 원 (HBsAg), HBV 코어 항 원 (Anti-hbc), HBV 표면 항 원 (HBs 안티), HBV DNA에 항 체에 항 체 검출을 위한 항 체 C 형 간염 바이러스 (HCV) (안티-HCV)에 HCV RNA, 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 1-p24-항 원/항-HIV 1/2는 완전 자동화 된 플랫폼 또는 민감한 질적 핵 산을 사용 하 여 테스트 합니다. 17. 두 번째 단계에서 프로토콜 파일럿 연구 "약물 및 만성 전염병" ("DRUCK 연구") 활성에 의해 로버트 코흐-연구소의 긴밀 한 협력에 국가 참조 센터 C 형 간염에 대 한 실시 되었다에서 이용 되었다 베를린, 에센18의 독일 도시에서 마약 사용자.

<table><tbody><tr><td>Latex rubber gloves</td><td>Hartmann</td><td>#4049500041515</td><td></td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol</td><td>Bode Chemie</td><td>#9768050</td><td></td></tr><tr><td>Mulifly safety cannula</td><td>Sarstedt</td><td>#85.1638</td><td></td></tr><tr><td>EDTA blood collection tube</td><td>Sarstedt</td><td>#02.1066.001</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive bandage</td><td>Hartmann</td><td>#2994163</td><td></td></tr><tr><td>Dry gauze pad</td><td>Hartmann</td><td>#143213</td><td></td></tr><tr><td>Singel-use safety lancet</td><td>Owen Mumford</td><td>#3802421</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper card</td><td>Whatman/sigmaaldrich</td><td>#10534612</td><td>Filter paper card Grade 903</td></tr><tr><td>Disposable pipette tips</td><td>Starlab</td><td>#S1126-7810, #S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Zipper bag</td><td>Flexico</td><td>#20219</td><td></td></tr><tr><td>Mini desiccant bag</td><td>Tropack</td><td>#-</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Punch</td><td>pfmmedical</td><td>#48601</td><td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td></tr><tr><td>Disposable Forceps</td><td>Servoprax</td><td>#H7301</td><td></td></tr><tr><td>12 Well Cell Culture Plate</td><td>Greiner</td><td>#665180</td><td></td></tr><tr><td>PBS Buffer</td><td>Gibco</td><td>#14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Applichem</td><td>#A1389.0500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Merck</td><td>#66880250</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>#30120086</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT HBsAg (Quantitative)</td><td>Abbott</td><td>#6C3642</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT anti-HBc II</td><td>Abbott</td><td>#8L4425</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT anti-HBs</td><td>Abbott</td><td>#7C1825</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT anti-HCV</td><td>Abbott</td><td>#6C3725</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td><td>Abbott</td><td>#4J2727</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td><td>Roche</td><td>#6374891001</td><td></td></tr><tr><td>artus HBV LC PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td><td>Siemens Healthcare</td><td>#2554311</td><td></td></tr></tbody></table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

종이 카드에 혈액을 수집 하 고 이후에 전 세기를 유래 하는 진단 목적을 위해 건조 혈액 명소 (DBS)를 사용 하 여 아이디어. 그 이후, DBS 테스트 주로 남아 있다 십 년간에 대 한 리소스 제한 설정에서 특히 전염 성 질환의 진단에 초점을 또는 상속 된 대사 장애에 대 한 신생아의 심사 체계적이 고 유일한 최근 다양 한 새롭고 혁신적인 DBS 응용 프로그램을 시작 합니다. 많은 년에 대 한 사전 분석 변수만 부적절 하 게 여겨졌다 DBS 테스트의 오늘 조차, 신생아 검사, 준비 구성 전체 사전 분석 단계 및 처리를 위한 DBS를 제외한 분야에서 그들의 최종 분석 하지 표준화 되었습니다. 이 배경을 감안할 때, 커버 알 필수 단계, 포괄적인 단계별 프로토콜 제안, 즉, 컬렉션의 혈액; 핏 자국;의 준비 핏 자국;의 건조 저장과 수송의 DBS; DBS, 그리고 마지막으로 DBS 있다의 분석의 차입. 이 프로토콜의 효율성 먼저 B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 및 자동화 된 분석 플랫폼에 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 마커 검출을 위한 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍으로 평가 되었습니다. 두 번째 단계에서 프로토콜 파일럿 연구, 베를린, 에센의 독일 도시에서 활성 마약 사용자에 실시 되었다 동안 이용 되었다.

준비를 위해 제안 된 프로토콜의 효과 DBS의 처리 처음 HBV, HCV, HIV 감염의 마커 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍을 분석 하 여 평가 되었다. 17.이 목적을 위해 DBS 100 µ l 전체 정 맥 혈 (cf. 포인트 2.1.1-이전 프로토콜의 2.1.6)에서 준비 했다 및 1000 µ l의 PBS 기반으로 eluted 했다 버퍼, 각각, (참조 포인트 언급 한 프로토콜의 5.1-5.5) 프로세스를 완료 하려면 대 한 두 개의 별도 작업에서 모든 7 개의 매개 변수입니다. 모든 단일 분석에 대 한 차입 조건의 주의 최적화 없이 이러한 접근 방식은 다소 높은 샘플 처리량은 차기 현장 연구 "약물 및 만성 중 비교적 짧은 시간에 예상 때문에 피할 수 없을 듯 전염 성 질병"("DRUCK 연구").
모든 측정 DBS 분석 과정에서 제조업체의 권장 사항을 준수 하지만 HBsAg 및 안티-HBs 결정 중 혈의 효과 또는 희석의 결과 대 한 보상에 관하여 수정 했다. 0.05 IU/ml의 컷오프 값 (그림 2A) 샘플링 HBsAg의 테스트 DBS 있다 리드 14.7% (52 명 중 354)의 거짓 반응의 속도에 비교 될 때 혈 청에. 수신기 작동 특성 (ROC) 분석25, 26 의 데이터 표시 0.15 IU/ml을 임계값의 증가 HBsAg-원판 (0.986 [감도], [1-특이성], 0.000에서에서 HBsAg 양성의 이상적인 분리 될 그림 2B)입니다. 다른 한편으로, 안티-HBs의 정량화에 대 한 10 IU/l의 차단 항 체의 14.2% (47 명 중 331) false 네거티브 측정 율은 기록 (그림 2C). 따라서, ROC 분석 다시, 다음이 컷오프가 낮아졌다 1.5 IU/l 값 (0.917 [감도], 0.007 [1-특이성], 그림 2D)의 최적의 차별 달성 하기.
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> 그림 2. HBsAg 및 안티-HBs DBS 있다 (에서17수정)에서 테스트. ROC 기반 증가 HBsAg 정량화 0.05 IU/ml에서 (A)을 0.15 IU/ml의 컷오프 값의 (B) 감소 거짓 양성 결과의 비율 14.7%에서 0%로. 마찬가지로, 안티-HBs 농도의 ROC 분석은 해당 임계값 10 IU/l (C)에서 1.5 IU/l (D), false-원판, 처음 모든 결정의 14.2%를 차지 하 고 그로 인하여 완전 하 게 제거의 감소를 제안 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
결합 된 혈 청/DBS 분석의 결과 표 117에 요약 되어 있습니다. 아니 비 특이성 DBS 7 analytes에 대 한 테스트 동안 기록 되었다.
DBS 있다 HBsAg, i. e. HBV, 급성 및 만성 감염의 혈 청 학적인 키 매개 변수의 존재에 대 한 조사 되었다 98.6%의 분석 감도 결정 했다. 2 거짓 부정 세라에 HBsAg 농도 되었고 749 IU/ml 6 IU/ml, 각각. 안티-HBc 항 체 성공적으로 204 중 176 (i. e 86.3%)에서 발견 되었습니다. DBS 있다입니다. 개인 공동 hiv 감염에서 유래 하는 측정에 의해 탐지 되지 했다 28 표본에서 스 물 둘. 따라서, HIV 양성 개인은 계산에서 제외 된, 97.1%의 감도 eluted 말린된 전체 정 맥 혈에서 안티-HBc 항 체를 검색에 대 한 달성 되었다. 유사한 관측 안티-HBs 항 체의 결정에 대 한 진정한 개최. 1.5 IU/l 분석 결과의 컷오프 값의 조정, 후에 9 어긋나는 세럼 DBS 결과 발생 했습니다. 공동 hiv 감염 환자는 너무 낮게 건조 혈액의 차입 후 검색 허용 했다 11-26 IU/l의 혈 청 안티-HBs 농도 발견 했다.
안티-HCV 항 체는 급성 또는 만성 또는 해결 감염을 나타내는 있습니다. DBS 있다에서 4 (i. e. 2.2%) 틀리게 네거티브 안티-HCV 결과 결정 및 serological 및 분자 분석 명확 하 게 입증 각각 세라 그 감염 했다 오래 된 환자에서 찍은 아주 아마 해결.
DBS 있다 완전 자동화 된 시스템에 반대로 HIV 항 체의 검출은 100%의 분석 감도 굴복 완전히 부드러운 과정 이었다.
"전 혈 있다에서 평균 HBV DNA 농도 100 표본에 수행 되었다 (DNA 농도 의미: 1,573,898 IU/ml, 범위: < 357-> 17,860,000 IU/ml) 93.0%의 값을 생성 하 고. 따라서, 낮은 혈 청 HBV DNA 농도 409 3,643 IU/ml 사이 7 샘플 테스트 DB 검색 되지 했다. HCV RNA 긍정적인 것을 입증 했다 100 세라의 (HCV RNA 농도 의미: 1,415,944 IU/ml, 범위: 2,479-> 7,692,000 IU/ml), 해당 전체 혈액 aliquots를 사용할 수 없었습니다. 비교 조사 결과 DBS 있다에서 HCV RNA 결정에 대 한 100%의 분석 감도. " 17
준비 하 고 필드 조건에서 DBS 처리 개요 프로토콜을 테스트 하기 위해 긴밀 한 협력으로는 로버트 코흐 연구소 (베를린, 독일) 연구 "약물 및 만성 전염병"는의 시험 단계 동안에 사용 되었다 베를린, 에센18의 독일 도시에서 활성 마약 사용자에 실시. 섹션 2.2.1-2.2.3 이전 프로토콜의 세부 사항에 설명 된 대로 모든 534 참가자 등록 (433 남녀 101) 모 세관 혈액 샘플링을 받았다 그리고 DBS, 다시, eluted PBS 기반 버퍼의 1000 µ l의 추가 의하여.
두 개인 만성 HBV로 감염 된 것으로 진단 된 39 해결된 HBV 감염의 혈 청 학적인 패턴을 보여주었다. 또한, 15 참가자 안티-HBs (예방 접종 후 상태)에 대 한 긍정적인 이었고 8 Anti-hbc 혼자에 대 한 긍정적인 것을 발견 했다. 참가자 중 안티-HCV 보급은 57.3% (N = 193) 베를린, 73.0% (N = 144) 에센에서. 항 체 양성에서 샘플링 65% (N = 125) 및 62% (N = 89) viremic도 했다. 534 개인에서 25 항 HIV에 대 한 긍정적인 테스트합니다. 감염의 19는 이미 알려져 있었다 고 이러한 개인의 24 공동 HCV 감염 했다.
DBS 테스트 결과 연구 참여자의 상태와 관련 된 자기 보고 HBV 및 HCV 이루게 데이터 신중 하 게 비교 되었다. 테스트의 결과와 함께에서이 비교 혈 청/DBS 쌍 "DRUCK 연구", 6 개의 추가적인 큰 독일 도시에서 활성 마약 사용자를 등록 하는 주요 단계에 대 한 테스트 알고리즘의 작은 수정에 led를 결합: "개인 감염 된 HIV HBV DNA의 존재에 대 한 항상 시험 될 것 이다. 참가자의 DBS 있다는 긍정적인 Anti-hbc 또는 안티-HBs 복종 되어야 한다는 venipuncture에 두 번째 상담 동안 확실히 그들의 안티-HBc/안티-HBs 상태를 명확히 하기 위해, 모든 DBS 있다 HCV RNA에 대 한 검사 하는 것입니다 마지막으로, 안티-HCV 테스트의 결과."에 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>매개 변수</td>
			<td>결합 된 세라/DBS 있다 (N)</td>
			<td>어긋나는 결과 (N)</td>
			<td>혈 청 및 DBS 있다 테스트 사이의 불일치에 대 한 이유</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>2 만성 HBV 감염을 가진 환자입니다. 둘 다 항 바이러스 치료 받고 있었고 그들 중 하나 이었다 공동 hiv 감염. 혈 청에 있는 항 원 농도: 749 IU/ml 및 6 IU/ml, 각각.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-hbc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>혈 청, 20-2 환자는 해결된 HBV 감염을 했다. 6 개인 serological 찾는 "안티-HBc 혼자" 보였다. 환자의 20-2 공동 hiv 감염 했다. "HBV 확인자"에서 20으로 평가 했다 "안티-HBs 긍정적인 혼자" DBS 테스트 및, 따라서, 거짓 "예방 접종 후 조건"으로 분류 되었다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>안티-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>4 환자 에이즈 감염 공동 했다 세럼 안티-HBs 농도 11-26 IU/l, 너무 낮은 건조 혈액 명소의 차입 후 항 체 검출에 대 한 수 있도록 했다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>각각 세라 3,643 IU/ml까지 409 IU/ml에서 낮은 혈 청 HBV DNA 농도와 7 명의 환자에서 얻은 되었습니다 했다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>안티-HCV</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>이러한 4 세라 해결된 HCV 감염 이후 긴 환자에서 촬영 됐다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>에이즈</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/반대로 HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 이 준비 되었고 전체 정 맥 혈 다음이이 통신에 제안 된 프로토콜에서 처리, 1762 DBS에서 얻은 결과 참조로 결합 된 혈 청 샘플의 결과에 비해.

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Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

준비 하 고 그들의 최종 분석에 대 한 건조 혈액 명소 (DBS)의 처리는 여전히 저조한 대부분 진단 응용 프로그램에 대 한 표준화 됩니다. 이 단점을 극복 하기 위해 포괄적인 단계별 프로토콜은 제안 하 고 이후 바이러스 성 감염의 마커를 탐지 하기 위한 그것의 효과 관한 평가.

말린된 피 명소-준비 및 Immunoassays 및 분자 기술 사용에 대 한 처리

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

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Research

JoVE Journal

Biology

40.0K 조회수.  University of Duisburg-Essen. 준비 하 고 그들의 최종 분석에 대 한 건조 혈액 명소 (DBS)의 처리는 여전히 저조한 대부분 진단 응용 프로그램에 대 한 표준화 됩니다. 이 단점을 극복 하기 위해 포괄적인 단계별 프로토콜은 제안 하 고 이후 바이러스 성 감염의 마커를 탐지 하기 위한 그것의 효과 관한 평가.

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Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

연구

면역학 및 감염병학

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the starting point to achieve reproducible and reliable results. All samples should be treated in the same way from blood collection to storage. Depending on the analyses to be performed, whole blood and serum samples should be stored at -20 &#176;C or -80 &#176;C until use. Blood/serum samples should also be aliquoted to avoid multiple freeze-thawing. Another important issue is the sample conditions during shipment from one laboratory to another. If dry ice is not available or the shipment takes longer than a few days, alternative approaches are needed. One option is to use filter paper for blood collection. Here, we propose a method for blood and serum sample collection that takes advantage of dried blood spots (DBS) and dried serum spots (DSS). We developed the procedure to extract DNA from DBS for the downstream evaluation of some single nucleotide polymorphisms (SNPs) by real time PCR. We also optimized an ELISA assay starting from proteins eluted from DSS. This method can be used with other ELISA assays or procedures evaluating proteins.

This protocol describes a simple and useful method to store peripheral blood and serum/plasma for downstream analyses such as single nucleotide polymorphism (SNP) evaluation and ELISA assay.

샘플 저장소 암 바이오 마커의 평가를 위한 유용한 툴으로 말린 혈액 및 혈 청 관광 명소

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

암 연구학

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

건강 바이오 마커의 혈액 스팟 컬렉션 인구 연구에의 참여를 극대화하기 위해 건조

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

의학

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

생물학

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

기능 Assays을위한 조직 항원의 추출

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

플라즈마 단백질 보존을위한 혈액 수집 장비로부터 게놈 DNA를 추출하는 실제적이고 새로운 방법

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of treatment, and help guide dose and schedule setting of therapeutics. From a single blood draw, peripheral blood mononuclear cells can be isolated and processed to analyze and quantify protein markers, and plasma samples can be used for the analysis of circulating tumor DNA, cytokines, and plasma metabolomics. Longitudinal samples from a treatment provide information on the evolution of a given protein marker, the mutational status and immunological landscape of the patient. This can only be achieved if the processing of the peripheral blood is carried out effectively in clinical sites and samples are properly preserved from the bedside to bench. Here, we present an optimized general-purpose protocol that can be implemented at clinical sites for obtaining PBMC pellets and plasma samples in multi-center clinical trials, that will enable clinical professionals in hospital laboratories to successfully provide high quality samples, regardless of their level of technical expertise. Alternative protocol variations are also presented that are optimized for more specific downstream analytical methods. We apply this protocol for studying protein biomarkers against DNA damage response (DDR) on X-ray irradiated blood to demonstrate the suitability of the approach in oncology settings where DDR drugs and/or radiotherapy have been practiced as well as in preclinical stages where mechanistic hypothesis testing is required.

This protocol details clinically implementable preparation of high quality PBMC and plasma biosamples at the clinical trial site that can be used for translational biomarker analysis.

바이오마커 분석을 위한 임상 시험 현장에서 단하나 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포 펠릿 및 플라즈마의 준비

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

<meta charset="utf8"></head><body>진균 및 바이러스 면역 분석을 위해 최적화된 전혈 면역분석법

Whole Blood Assay with Dual Co-Stimulation for Antigen-Specific Analysis of Host Immunity to Fungal and Viral Pathogens

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of advanced antigen-specific immunoassays. Traditionally, such immunoassays, especially antigen-specific T-cell analysis by flow cytometry or enzyme-linked immunosorbent spot assays, often rely on the isolation of peripheral blood mononuclear cells. This process is time-consuming, subject to many pre-analytic confounders, and requires large blood volumes. Whole blood-based assays provide a facile alternative with increased pre-analytic robustness and lower blood volume requirements. Furthermore, whole blood-based assays allow for the preservation of inter-cellular interactions that are not captured by assays using isolated cell subsets. Recently, a refined whole blood immunoassay with dual anti-CD28 and anti-CD49d co-stimulation for comprehensive analysis of both antigen-specific T-cell functions and complex intercellular interactions in response to various fungal and viral antigens has been proposed. This protocol provides guidance for the preparation of stimulation tubes, blood stimulation, and downstream sample processing for flow cytometry, cytokine secretion assays, and transcriptional analyses. This includes a validated and functionally equivalent, previously unpublished, low-volume protocol (250 &#181;L) to make flow cytometric and cytokine-based T-cell monitoring more accessible for studies in pediatric patients or preclinical studies in small animals (e.g., mice). Altogether, these protocols provide a versatile toolbox for complex antigen-specific immune analysis in both clinical and translational research settings.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Advancing Immune Monitoring in Critical Care Patients Using Whole Blood Assays (전혈 분석을 사용한 중환자 치료의 면역 모니터링 발전)

Whole blood-based immunoassays provide a facile and resource-efficient tool to analyze antigen-specific immunity for diagnostic and research purposes. This article provides an optimized whole blood-based protocol with dual co-stimulation for comprehensive analysis of host immunity to fungal and viral pathogens, including a low-volume version for pediatric patients and small animals.

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of ...

말린된 피 명소-준비 및 Immunoassays 및 분자 기술 사용에 대 한 처리

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효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

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바이오마커 분석을 위한 임상 시험 현장에서 단하나 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포 펠릿 및 플라즈마의 준비

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석