La presente comunicazione si basa sui risultati precedentemente pubblicati nel giornale di virologia17 in modalità di accesso aperto sotto i termini della Creative Commons Attribution License (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) con BioMed Central come un Licenziatario. Gli autori riconoscono con gratitudine la proficua collaborazione nel quadro di pilotare lo studio "Droghe e malattie infettive croniche" ("studio DRUCK") con U. Marcus, W. Cai, Zhang W. e R. Zimmermann dall'Istituto Robert Koch-(Berlino, Germania) e sono grato a S. Moyrer per scattare le fotografie assemblati in Figura 1 , nonché per quanto riguarda D. F. Whybrew, Ph.D., (Gottinga, Germania) per la correzione del manoscritto. Esse esprimono anche il loro apprezzamento per l'assistenza tecnica sapiente di J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, r. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter e K. Seidel. Questo studio è stato sostenuto in parte da una sovvenzione del Ministero tedesco della sanità per il centro di referenza nazionale per l'epatite c.

Poiché il protocollo è progettato per l'uso nella diagnostica medica, l'applicazione deve seguire i principi della dichiarazione di Helsinki19. Per la prima parte dei risultati presentati in questa comunicazione, sia un accordo separato dai pazienti e approvazione di un comitato etico sembrava essere superflua per due motivi: (1) "al momento del ricovero" all'ospedale dell'Università di Essen, "ogni paziente fornisce consenso scritto di tutte le indagini biochimiche, batteriologiche e virologiche necessarie." 17 (2) "tutti i campioni utilizzati durante la valutazione di DBS test sono stati inviati per l'Istituto di virologia nel processo di diagnostica clinica di routine. Così, nessuno degli esemplari sono stati raccolti specificamente ai fini dello studio, non un singolo aggiuntiva venipuntura è stato effettuato e nessuno dei materiali è stato testato per qualsiasi parametro diverso da quelli richiesti dai medici nel corso del normale work-up diagnostico." 17 lo studio "Droghe e malattie infettive croniche" (studio DRUCK")18, in cui DBS test infine è stato usato nelle città tedesche di Berlino ed Essen per valutare le persone che hanno attivamente iniettano farmaci, è stato approvato dal Commissario federale per i dati Protezione e libertà di informazione (Berlino, Germania) e anche come dal comitato etico del Charité Medical University, (Berlino, Germania).
1. raccolta del sangue
<ol><li>Prelievo venoso14, 15, 20, 21<ol>
<li>Indossare guanti monouso in lattice di gomma e pulire l'area del sito di puntura previsto (preferibilmente la vena cubitale mediana nella fossa antecubitale) con un disinfettante appropriato, ad esempio, alcool isopropilico al 70%.</li>
		<li>Applicare un laccio emostatico 4 – 6 pollici sopra il sito di puntura putativo per distendere le vene. Guidare l'ago nella vena del paziente e, una volta che è in atto, delicatamente riempire la provetta di sangue collegato, che contiene EDTA come anticoagulante.</li>
		<li>Appena venipuntura è completa, rilasciare il laccio emostatico e ritirare l'ago. Quindi, premere un tampone di garza asciutta sul sito della puntura, che successivamente può essere tenuto in posizione da una benda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Puntura della pelle (Figura 1A)13-15, 20, 22, 23<ol>
<li>Mettere su un paio di guanti monouso in lattice di gomma.</li>
		<li>Prima della puntura della pelle, il paziente dovrebbe scaldare il suo mani. Il dito è massaggiato anterograda arricchire il sangue fluire verso al sito di puntura.</li>
		<li>Pulire la pelle del lato palmar della falange distale di punta del terzo o quarto dito della mano non-scrittura con un disinfettante adatto, per esempio, alcol isopropilico al 70%. Forare la pelle di una lancetta monouso di sicurezza. Il dito dovrebbe tenersi in posizione tale che la gravità facilita la raccolta di sangue sul polpastrello.</li>
		<li>Quando la raccolta di sangue capillare da puntura della pelle è completa, posizionare una fasciatura sulla punta del dito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione di macchie di sangue
<ol><li>Preparazione da sangue prelevati tramite prelievo venoso15<ol>
<li>Individuare i raccolti anticoagulato (EDTA) sangue intero venoso sulle carte filtro appena possibile. Non preparare macchie di sangue secco, più di 24 ore dopo il prelievo venoso.</li>
		<li>Mettere tutte le informazioni necessarie per l'identificazione del paziente sulla scheda filtro. Una carta dovrebbe essere individuata solo con il sangue di un singolo individuo.</li>
		<li>Indossare guanti monouso in lattice di gomma.</li>
		<li>Capovolgere delicatamente la provetta 2-4 volte e successivamente aprire il tappo con cautela.</li>
		<li>Aspirare 50 µ l di sangue intero venoso utilizzando una pipetta con punta monouso. Trasferire il sangue al centro di un cerchio senza toccare la carta da filtro direttamente con la punta della pipetta. Tenta di saturare completamente il cerchio.</li>
		<li>Ripetere questa procedura per riempire tutti i cerchi richiesti della carta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione da sangue raccolti dalla pelle puntura (figure 1B e 1C)13-16, 23<ol>
<li>Eliminare la prima goccia di sangue con un tampone di garza perché può contenere liquidi dei tessuti in eccesso. Massaggiare il dito per aumentare il flusso sanguigno al sito di puntura. Trasferire la goccia seguente in uno dei circoli di una carta filtro senza toccare la superficie direttamente con il polpastrello. Permettere al sangue di essere immersi nella trama del filtro da forze capillari solo.</li>
		<li>Lasciate che la prossima grande goccia di forma di sangue capillare sulla punta del dito e raccoglierlo nel cerchio successivo. Continuare questa procedura fino a quando tutti i cerchi necessari sono pieni o si interrompe il flusso di sangue.</li>
		<li>Non spremere o "latte" il dito eccessivamente se il flusso di sangue non è sufficiente a riempire tutti i cerchi richiesti della carta filtro. Se si interrompe il flusso di sangue è possibile inserire una benda sulla punta delle dita. Eseguire una seconda puntura della pelle su un altro dito se più sangue è necessaria per l'esame.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. asciugatura di macchie di sangue
<ol><li>Per asciugare le macchie di sangue, mettere il filtro carte su una carta pulita asciugamano in un armadietto di sicurezza biohazard e lasciarli asciugare, preferibilmente O/N (ma per almeno 4 ore), a RT in assenza di qualsiasi fonte esterna di calore. Quando il processo di essiccazione è completo, le macchie di sangue hanno un colore marrone scuro uniforme e zone rosse non sono visibili piu ' (Figura 1)13, 15, 16.</li>
</ol>4. stoccaggio e trasporto di macchie di sangue essiccato (DBS)
Nota: L'elaborazione delle macchie di sangue può essere interrotto dopo l'essiccazione. Le carte di filtro possono ora essere memorizzati13-16, 23.
<ol><li>Per deposito, mettere la scheda di carta da filtro in un sacchetto di chiusura lampo singolo, gas-impermeabile, contenente 1-2 bustine essiccante per proteggere gli esemplari da umidità (Figura 1E). Facoltativamente, aggiungere una scheda di indicatore di umidità.</li>
	<li>Trasferire questa borsa per un congelatore con una temperatura di-20 ° C o inferiore appena possibile. Se non sono disponibili in condizioni di campo congelatori, deposito-4 ° c o anche a temperatura ambiente è fattibile fino a 14 giorni.</li>
	<li>Trasporto campioni congelati di DBS su ghiaccio secco. Per filtro carte inizialmente mantenuti a temperatura ambiente, utilizzare un sistema di confezionamento triple, che consiste la cerniera borsa (s) come i contenitori dei interna come pure un'interiore e una busta esterna. Nessun contenuto marcature sono tenute sulla busta esterna per la spedizione per posta ordinaria, ma il simbolo di rischio biologico internazionale deve essere apposto il contenitore primario interno16.</li>
	<li>Escludere le carte filtro da ulteriore elaborazione se i dessiccante e/o la scheda di indicatore di umidità ulteriori assume un colore rosa.</li>
</ol>5. eluizione di sangue essiccato punti13, 15, 16, 23
<ol><li>Punch out uno spot con un dispositivo monouso 6 mm da ogni cerchio intrisa di sangue della scheda filtro Grade 903 (Figura 1F). Trasferimento tutti i pugni macchie di sangue secco da un singolo paziente per un pozzetto della piastra 12-pozzetti.</li>
	<li>Riempire il pozzetto con tampone fosfato salino contenente 0.05% Tween 20 e 0,08% di sodio azide (Figura 1). Adattare il volume del buffer aggiunto ai minimi requisiti rispettivi del dosaggio utilizzato per la successiva analisi di eluati di macchie di sangue essiccato.</li>
	<li>Ripetere questi passaggi per ottenere una seconda serie di eluati chiazza di sangue essiccato al fine di eseguire analisi molecolari.</li>
	<li>Mettere la piastra di coltura cellulare su un agitatore di laboratorio e lasciate che le macchie di sangue essiccato perforato eluire delicatamente per un minimo di 4 ore o, preferibilmente, O/N (Figura 1 H).</li>
	<li>Il giorno successivo, le macchie sono quasi esenti da sangue e surnatanti emolitici hanno formato (Figura 1I). Trasferire questi eluati microcentrifuga. Quindi, di sottoporli a centrifugazione per 2 min a 10.500 x g (Figura 1J) gratuita i surnatanti da eventuali detriti che si era formata durante l'eluizione (Figura 1 K).</li>
</ol>6. analisi degli eluati
<ol><li>Centrifugato di eluati sono ora pronti per essere utilizzati per le analisi previste. Indagare gli eluati marcatori del virus dell'epatite B, virus dell'epatite C e l'infezione da HIV usando i kit disponibili in commercio e seguire attentamente le istruzioni dei rispettivi produttori (Figura 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> Figura 1. Riepilogo grafico del protocollo proposto nella presente comunicazione per preparazione e del trattamento di macchie di sangue essiccato essere utilizzato nei immunoassays e mediante tecniche molecolari. Sangue intero venoso e sangue capillare, ottenuto a seguito di iniezione in vena o puntura della pelle di una lancetta (A) possono servire come campioni per analisi chiazza di sangue essiccato. Dopo il trasferimento del sangue ai cerchi di una carta di filtro Grade 903 (B, C), i campioni dovrebbero essere asciugati preferibilmente O/N a temperatura ambiente in un armadietto a macchie di forma di un colore uniformemente marrone senza qualsiasi interspersion di rosso di sicurezza biohazard aree (D). Quando l'essiccazione delle macchie di sangue è completo e deposito è necessario, le carte di filtro possono essere confezionate in sacchetti di cerniera gas-impermeabile contenente 1-2 bustine di essiccante (E). Ulteriore elaborazione di laboratorio della DBS comprendono la generazione di pugni di un dispositivo monouso 6 mm dal centro dei cerchi (F, G), l'eluizione dei pugni in un buffer basato su PBS per un minimo di 4 ore o, preferibilmente, O/N su un agitatore (H ), il recupero di eluati (io) e, infine, centrifugazione delle tazze del laboratorio (J) gratuita Gli eluati DBS da eventuali detriti che potrebbero aver avuto origine durante il processo di eluizione (K). Successivamente, gli eluati DBS sono pronti per le analisi, che sono state eseguite da una piattaforma completamente automatizzata (L) al fine di individuare indicatori sierologici di HBV, HCV e HIV infezioni, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

In passato, RSR ha ricevuto un onorario per fornire lezioni e sostegno finanziario per il suo lavoro scientifico da Abbott Diagnostics. NG e OM dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.

DBS sono stati utilizzati per 100 anni2 ma, sorprendentemente, non ci è ancora consenso generale sulla loro preparazione e l'elaborazione. Ad oggi, una sufficiente standardizzazione di questa importante fase pre-analitica è stata conseguita solo in materia di screening neonatale14, considerando che esiste una varietà di diversi protocolli per tutte le altre applicazioni di DBS test5, 16, 23. Per superare questa eterogeneità notevole, una completa istruzione dettagliata per la preparazione e l'elaborazione di DBS per essere utilizzato nei immunoassays e mediante tecniche molecolari è presentata nella presente comunicazione e valutata per quanto riguarda la sua efficacia per la rilevazione di marcatori d'infezione da HBV, HCV e HIV. L'obiettivo della discussione seguente è posto principalmente sulle diverse fasi del protocollo suggerito.
Nella storia della DBS test molti diversi filtro carta carte sono state usate2 ma oggi solo due fonti commerciali sono approvati dalla FDA come dispositivi medici di classe II per la raccolta di sangue5, 16. Questi sistemi di carta filtro sono altamente uniformi e abbiano caratteristiche di assorbimento molto simili, in modo che i risultati analitici ottenuti da sangue capillare preparato su una di esse non differiscono di oltre il 4%-5%28. Non sorprendentemente, Masciotra e colleghi di lavoro29 pertanto rilevato HIV-1 RNA ugualmente bene con un dosaggio qualitativo dopo eluizione da schede di raccolta di sangue da diverse fonti. Dato questi dati, si può praticamente escludere che qualsiasi delle discrepanze osservate durante il test accoppiato coppie siero/DBS per marcatori dell'HBV, HCV e HIV infezioni17 è stata causata dalla scelta della carta filtro da solo. Tuttavia, quando è indispensabile accurata quantificazione di un analita, source-to-source variazione non potrebbe essere più trascurabile e tecniche più sofisticate, per esempio, perforato DBS (PDB) come un metodo per Microcampionamento30 o la preparazione delle macchie secche del siero (DSS)31 potrebbe essere necessario applicare al posto del convenzionale DBS test10.
Poiché solo piccole quantità di sangue sono usate per DBS test (una goccia di sangue capillare è costituita da circa 50 µ l)5, 16, variazioni del volume di campione sono essenziali e, devo ammettere che, in almeno alcune delle discrepanze tra i risultati sierologici e del partecipante auto-riferito stato HBV e HCV, registrato durante il pilotaggio dello "Studio DRUCK" sono attribuibili a questa variabile. Il singolo fattore più importante per ridurre al minimo le "fluttuazioni" il volume del campione è senza dubbio una tecnica corretta di prelievo di sangue capillare, che può essere raggiunto solo da un'attenta e costante formazione del personale tecnico22. Inoltre, come misura di controllo di qualità, tutti i laboratori che lavorano con DBS dovrebbero già avviato le procedure per l'identificazione e successivamente escluse esemplari DBS che devono essere considerati come insoddisfacente o non valido16.
Gli studi condotti principalmente nel contesto dell'HIV32 e screening neonatale33 hanno dimostrato che alta umidità può portare ad un degrado degli analiti, ma finora nessun consenso è stato raggiunto per quanto riguarda la questione di quanto tempo DBS dovrebbe essere asciugato ad aria . Un intervallo di almeno 4 ore o preferibilmente O/N è proposto nella presente comunicazione, che ha pertanto adottato condizioni che sono state utilizzate nella stragrande maggioranza di tutte le pubblicazioni pertinenti32, 34 dati su storage di DBS per essere utilizzati successivamente per HBV e HCV test sono in conflitto. Nel 1981, Villa e colleghi di lavoro35, che ha applicato le tecniche analitiche contemporanee, ha riferito che deposito presso RT non ha influenzato i risultati delle analisi HBV durante l'intero periodo di osservazione di 180 giorni se titoli dell'anticorpo erano > 1/1.000, ma quel DBS è diventato borderline-positiva o addirittura negativo dopo 15 giorni quando i titoli nel siero erano solo 1/100. Conservazione a-20 ° C o a 4 ° C non ha provocato un miglioramento notevole. Al contrario, uno studio condotto trent'anni più tardi36 testato replica di un campione di HBV-positivi, e gli autori hanno trovato che anti-HBc così come gli anticorpi anti-HBs erano stabili fino a 183 giorni a RT, mentre è diventato HBsAg alle stesse condizioni falso-negativo già dopo 63 giorni. Per quanto riguarda la rilevazione del DNA di HBV da eluati DBS, la concentrazione dell'acido nucleico virale è stato stabile per almeno sette giorni a 37 ° C37 o ha dimostrato di essere "resistenti" al deposito presso RT fino a tre settimane38. Test per anticorpi anti-HCV utilizzando due terza generazione disponibili in commercio test immunologici39 fornito risultati accurati per un periodo di 117 giorni utilizzando DBS campioni conservati a-20 ° C, 2 – 8 ° C e 20 – 25 ° C, rispettivamente. Conservazione a-20 ° C, tuttavia, ha provocato la minima variazione di densità ottica. L'applicazione di una quarta generazione anti-HCV ELISA, cioè, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, nel contesto della DBS test, Larrat et al. 40 osservata una drastica riduzione nella specificità analitica dopo la memorizzazione gli esemplari DBS per più di tre giorni a TA. D'altra parte, precisi risultati della prova sono stati ottenuti con lo stesso kit che utilizzano campioni depositati per 60 giorni in varie condizioni (-20 ° C, 2 – 8 ° C e 22 – 26 ° C) da Brandao e co-lavoratori41. Osservazioni sul declino delle concentrazioni di RNA di HCV in DBS in varie condizioni di deposito variano da nessuna alterazione significativa a RT per fino a un anno42 a un cambiamento dieci volte dopo quattro settimane a temperatura ambiente43. Prendendo questi dati piuttosto contrastanti sulla stabilità dell'HBV e HCV antigeni, acidi nucleici e anticorpi in considerazione, è sembrato ragionevole per ritrarre in proposta di protocollo per un consenso, che è stata definita in precedenza per il deposito degli esemplari DBS da utilizzarsi per HIV test15, 30: per deposizione a breve termine (fino a due settimane) gli antigeni, acido nucleico virale e gli anticorpi sono considerati come stalla di RT, considerando che congelate condizioni ottimali di conservazione per periodi più lunghi.
Come regola, tre parametri da considerare durante la progettazione di un protocollo di eluizione: (1) il buffer di eluizione; (2) la durata e la temperatura di eluizione; e (3) il volume di eluizione23. La stragrande maggioranza di tutte le pubblicazioni pertinenti tampone fosfato salino (PBS) è stato usato per eluizione DBS, in maggior parte dei autori hanno aggiunto una proteina, per esempio, albumina di siero bovino (BSA) o Tween 20, un tensioattivo, al fine di migliorare il segnale del dosaggio stabilizzando proteine, come vanno in soluzione e contemporaneamente blocco di siti di legame non specifico23. Soltanto alcuni rapporti, che confrontano direttamente il buffer di eluizione diverse nel contesto della DBS test, sono disponibili. Villar et al. 36, per esempio, registrato capacità di eluizione quasi equivalenti per tutti i buffer usati, ma PBS/BSA 0.5% ha provocato il più basso livello di reattività aspecifica. Un'osservazione molto simile è stata fatta da Croom e colleghi di lavoro44 quando si applica il diluente della genetica sistemi rLAV EIA per l'eluizione di anticorpi anti-HCV da DBS. Poiché il rischio di degradazione del campione è eccessivamente basso nelle prime ore dopo la preparazione della DBS (Vedi sopra), è stato deciso per incubare le macchie O/N a temperatura ambiente e a sostenere il processo di eluizione di miscelazione delicata estremità sopra. Questo approccio ha il vantaggio che gli esemplari perforati con il precedente giorno possa essere trasferito direttamente per la diagnostica di routine presto la mattina successiva23. Il volume di tampone di eluizione dovrebbe essere adattato ai minimi requisiti rispettivi dosaggi utilizzati per analisi successive al fine di mantenere il fattore di diluizione più bassa possibile. Tuttavia, un'attenta ottimizzazione delle condizioni di eluizione per ogni singolo analita non era possibile nella valutazione precedente perché un throughput elevato campione doveva essere garantito in un tempo relativamente breve durante il "DRUCK studio"17. Di conseguenza, il volume piuttosto sfavorevole di 1.000 µ l di tampone PBS-base è stato utilizzato al fine di completare il processo di eluizione intero per tutti i parametri in due operazioni distinte.
Questo approccio uno una parte non riesce "completamente nel sistema anti-HBc/anti-HBs per quegli individui infettati con l'HIV a causa delle concentrazioni di anticorpi Bassi; ... e ha richiesto procedure biologiche molecolari con sensibilità analitica ottimale per quanto riguarda il DNA di HBV e HCV RNA test. " 17 d'altra parte, il volume di eluizione elevato dimostrato di essere in alcun modo svantaggioso per la determinazione di HBsAg, anti-HCV e anti-HIV di kit utilizzato durante la valutazione. "La rilevazione dell'HBsAg positivi materiali da sangue intero eluati è riusciti con una sensibilità del 98,6% ad un grado elevato allo stesso modo come in studi precedenti, che in parte aveva usato un volume di eluizione molto più piccolo di 100 µ l, 250 µ l, o 600 µ l o 500 µ l"17 ,36, 45, 46. La sensibilità del 97,8% determinato nell'inchiesta di 179 coppie siero/DBS per anticorpi anti-HCV corrispondevano ai risultati già esistenti rapporti24, 44, 47, 48, 49, che aveva lavorato con un volume di eluizione è stata inferiore di un fattore di 5-10. "Inoltre, i protocolli per il rilevamento di anti-HCV erano stato opportunamente ottimizzati... stabilendo i propri punti di cut-off",17, 24, 48 e 49 "o aumentando i volumi di campione da 20 µ l a 100 µ l." 17, 49 infine, la specificità analitica e la sensibilità (100%) stabilito per il rilevamento di anti-HIV erano pari o superiori alle caratteristiche delle prestazioni di altri test immunodiagnostici specificamente adattati per DBS test50, 51 "o un graduale procedura con l'uso combinato di diversi test anti-HIV"17,52. "Essi, infatti, anche superato il record di prestazioni di un'analisi che erano stati appositamente sviluppato e ottimizzato per il rilevamento di anticorpi anti-HIV in eluati DBS (Q-prevenire l'HIV 1 + 2 kit di DBS)." 17, 53  
Presi insieme, il protocollo passo-passo completo presentato in questa comunicazione ha dimostrato di essere uno strumento fattibile e facile da usare per la preparazione e l'elaborazione di DBS e, quindi, utilizzabile in modo affidabile in virologia diagnostica. Permette approcci utilizzando automazione 54 e per le sue caratteristiche di prestazione eccellente ha il potenziale per servire come una sorta di fondamento-pietra per un protocollo futuro consenso generalmente accettati nel settore globale della DBS test in laboratorio medicina.

L'idea di utilizzare campioni di sangue prelevati su una carta di carta di cellulosa è attribuita a Ivar Christian Bang (1869-1918), il padre della moderna clinica microanalisi1, 2. Nel 1913, Bang determinato glucosio dalle misurazioni di azoto eluati di sangue secco macchie (DBS)3 e, successivamente, anche eseguiti utilizzando il metodo di Kjeldahl con questo filtro carta tecnica2. Successivamente, parecchi ricercatori hanno riferito sull'uso di DBS per test sierologici per la diagnosi di sifilide2. Come presto come nel 1924, Chapman riepilogato i vantaggi di DBS test quando ha particolarmente sottolineato quattro elementi, che sono ancora validi oggi: venipuntura rispetto al convenzionale (1), è necessario meno volume di sangue e questo fatto era più importante in pediatrica diagnostica; (2) raccolta del sangue è semplice, non invasivo e poco costoso; (3) il rischio di contaminazione batterica o di emolisi è minimo; e DBS (4) può essere conservato per lunghi periodi con quasi nessun deterioramento degli analiti2, 4. Oltre al suo uso in fase di test per la sifilide, ulteriormente prime applicazioni della tecnica DBS includevano, ad esempio, la rilevazione degli anticorpi contro morbillo, parotite, poliovirus, virus parainfluenzali e virus respiratorio sinciziale (RSV) nel 19532, l'identificazione di Shigella nelle feci essiccate su carta da filtro e spediti per posta ordinaria dall'Indonesia a Leida, nei Paesi Bassi, nonché la rilevazione di anticorpi anti-Schistosoma in DBS presi nelle zone endemiche ed analizzati più di tre mesi più tardi5 . Nel 1963, cinquant'anni dopo di Bang originale comunicazione2, 6, Guthrie ha finalmente pubblicato il suo famoso metodo per la diagnosi di fenilchetonuria da DBS ottenuti da una puntura di tacco da neonati7, 8.
Anche se da quel momento in poi, DBS erano considerati un metodo comunemente applicabile per la raccolta, stoccaggio, trasporto e analizzare una varietà di liquidi organici umani5, loro uso nella diagnostica ancora rimasto principalmente focalizzata sulla diagnosi di infezioni soprattutto nelle impostazioni di risorse limitate e lo screening sistematico dei neonati per disordini metabolici ereditati per decenni9, 10. Dal 2005, tuttavia, una varietà di nuove e innovative applicazioni DBS hanno cominciato ad emergere. Ciò ha provocato un aumento quasi esponenziale del numero delle rispettive pubblicazioni scientifiche su DBS da circa 50 a quasi 450 annualmente al momento. Tra le applicazioni emergenti sono tali campi vari come tossico - e gli studi farmacocinetici, profiling metabolico, monitoraggio terapeutico del farmaco, tossicologia forense o contaminazione ambientale controllo10, 11.
DBS test ha, così, di fatto una marcia trionfale attraverso diagnostica clinica di laboratorio nel corso degli ultimi 100 anni2. Come in chimica clinica12, tuttavia, durante questa marcia variabili pre-analitiche non erano adeguatamente considerate per molti anni. Infatti, ancora oggi, dopo tali attività eminente come carta da filtro valutazione progetto13 del CDC o la formulazione di una norma nazionale per la raccolta di sangue su carta da filtro nel quadro del neonato di screening14, la fase pre-analitica è ancora in gran parte sottovalutato nella maggior parte degli altri campi, in cui DBS test è applicata di5, 10.
Dato questo sfondo, un protocollo completo passo passo14-16 per l'uso in test immunologici e tecniche molecolari, che copre tutti i passaggi essenziali, è suggerito per la preparazione e l'elaborazione di DBS nella seguente comunicazione: (1) raccolta di sangue; (2) preparazione di macchie di sangue; (3) essiccazione delle macchie di sangue; (4) stoccaggio e trasporto; (5) eluizione di DBS; e infine (6) analisi di eluati DBS. L'efficacia del protocollo in primo luogo è stata valutata con coppie di 1.762 accoppiati del siero/DBS per la rilevazione dell'epatite B (HBV) virus antigene di superficie (HBsAg), anticorpi anti-antigene "core" dell'HBV (anti-HBc), gli anticorpi all'antigene di superficie dell'HBV (anti-HBs), HBV DNA, anticorpi per il virus dell'epatite C (HCV) (anti-HCV), HCV RNA e virus dell'immunodeficienza umana (HIV) 1-p24-antigen/anti-HIV 1/2 utilizzando una piattaforma completamente automatizzata o dell'acido nucleico qualitativa sensibile test. 17. in una seconda fase, il protocollo è stato utilizzato nello studio pilota "droghe e malattie infettive croniche" ("studio DRUCK") che è stato condotto da Robert Koch-Istituto in stretta collaborazione con il centro di referenza nazionale per l'epatite C su attivo di stupefacenti nelle città tedesche di Berlino ed Essen18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

L'idea di raccolta di sangue su una carta di carta e successivamente usando le macchie di sangue essiccato (DBS) per scopi diagnostici, è nato un secolo fa. Da allora, DBS test per decenni è rimasta prevalentemente focalizzata sulla diagnosi delle malattie infettive, soprattutto nelle impostazioni di risorse limitate o sistematica di screening dei neonati per malattie metaboliche ereditarie e solo recentemente hanno una varietà di nuove e innovative applicazioni DBS cominciate ad emergere. Per molti anni, le variabili pre-analitiche sono state considerate solo impropriamente nel campo di prova di DBS e ancora oggi, con l'eccezione di screening, l'intera fase di pre-analitica, che comprende la preparazione e la lavorazione di DBS per neonato loro analisi finale non sono stato standardizzato. Dato questo sfondo, un protocollo completo di passo-passo, che si estende alle fasi essenziali, è proposto, cioè, raccolta di sangue; preparazione delle macchie di sangue; essiccazione delle macchie di sangue; stoccaggio e trasporto di DBS; eluizione di DBS e infine le analisi di eluati DBS. L'efficacia del presente protocollo in primo luogo è stata valutata con coppie di 1.762 accoppiati del siero/DBS per la rilevazione di marcatori del virus dell'epatite B, epatite C virus e infezioni da virus dell'immunodeficienza umana su una piattaforma analitica automatizzata. In una seconda fase, il protocollo è stato utilizzato nel corso di uno studio pilota, che è stato condotto sui tossicodipendenti attivi nelle città tedesche di Berlino ed Essen.

L'efficacia del protocollo suggerito per la preparazione e lavorazione di DBS in primo luogo è stata valutata analizzando 1.762 coppie accoppiati del siero/DBS per marcatori di infezione da HBV, HCV e HIV. 17. per questo scopo, DBS sono stati preparati da 100 µ l di sangue intero venoso (cfr punti 2.1.1 – 2.1.6 del protocollo precedente) e sono stati eluiti con 1.000 µ l di PBS-based buffer, ciascuno, (cfr punti 5.1-5.5 del suddetto protocollo) per completare il processo per tutti i sette parametri in due operazioni distinte. Tale approccio senza un'attenta ottimizzazione delle condizioni di eluizione per ogni singolo analita sembrava essere inevitabile perché un throughput di campione piuttosto alto era previsto in un tempo relativamente breve durante lo studio di campo prossimo "droghe e cronica Malattie infettive"("studio DRUCK").
Tutte le misurazioni aderito alle raccomandazioni del produttore nel corso di analisi DBS, ma ha dovuto essere modificata per quanto riguarda le determinazioni di HBsAg e anti-HBs per compensare per l'effetto del hemolysis o il risultato di diluizione. Con un valore di cut-off di 0,05 IU/ml, HBsAg test di DBS eluati piombo ad un tasso di falsi positivi del 14,7% (52 su 354) rispetto al siero campioni (Figura 2A). Funzionamento (caratteristici ROC) analisi25, 26 dei dati del ricevitore indicato che una separazione ideale di HBsAg-positivi da HBsAg-negativi (0.986 [sensibilità], 0.000 [1-specificità], comporterebbe un aumento della soglia di 0,15 UI/ml Figura 2B). D'altra parte, con un cut-off di 10 UI/l per la quantificazione di anti-HBs anticorpi che un tasso di falsi-negativi misurazioni del 14,2% (47 su 331) è stato registrato (Figura 2). Quindi, a seguito di analisi ROC nuovamente, questo taglio è stato abbassato a 1,5 IU/l per ottenere una discriminazione ottima dei valori (0.917 [sensibilità], 0,007 [1-specificità], Figura 2D).
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> Figura 2. HBsAg e anti-HBs in eluati DBS (modificati da17) test. L'aumento di ROC-guida del valore di cut-off per la quantificazione di HBsAg da 0,05 IU/ml (A) a 0,15 IU/ml (B) riduce il tasso di risultati falsi-positivi dal 14,7% a 0%. Allo stesso modo, l'analisi ROC delle concentrazioni di anti-HBs ha suggerito una diminuzione della rispettiva soglia da 10 IU/l (C) a 1,5 IU/l (D), quindi completamente eliminando falsi negativi, inizialmente pari al 14,2% di tutte le determinazioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
I risultati delle analisi accoppiati del siero/DBS sono riassunti in tabella 117. Nessun non-specificità è stata registrata nel corso della DBS test per uno qualsiasi dei sette analiti.
Quando gli eluati DBS sono stati studiati per la presenza di HBsAg, cioè il parametro key sierologico dell'infezione sia acuta che cronica con HBV, è stata determinata una sensibilità analitica del 98,6%. Le concentrazioni di HBsAg nei due sieri falsamente negativi erano 749 IU/ml e 6 UI/ml, rispettivamente. Anticorpi anti-HBc con successo sono stati rilevati in 176 su 204 (i. e 86,3%) Eluati DBS. Ventidue fuori i 28 esemplari che non sono stati rilevati dalle misure ha provenute da individui co-infettati con HIV. Così, se gli individui HIV-positivi sono stati esclusi dal calcolo, una sensibilità del 97,1% è stata realizzata per il recupero di anticorpi anti-HBc da sangue intero venoso secco eluiti. Osservazioni simili valeva per la determinazione degli anticorpi anti-HBs. Anche dopo la regolazione del valore di cut-off del saggio ad 1,5 IU/l, nove discrepanti siero DBS risultati si sono presentati. Nei pazienti non co-infettati con HIV, le concentrazioni di siero anti-HBs di 11 – 26 IU/l sono state trovate, che erano troppo basse per consentire il rilevamento dopo eluizione di sangue essiccato.
Anticorpi anti-HCV sono indicativi di infezione acuta o cronica o risolta. Solo quattro risultati di falsamente negativo anti-HCV (i. e. 2.2%) sono stati determinati da eluati DBS e ulteriori analisi sierologiche e molecolare ha dimostrato chiaramente che i rispettivi sieri molto probabilmente sono stati presi dai pazienti, cui infezioni da lungo tempo erano stato risolto.
La ricerca di anticorpi anti-HIV in eluati DBS con il sistema completamente automatizzato è stato un processo completamente liscio che ha reso una sensibilità analitica del 100%.
"Concentrazione media dell'HBV DNA da sangue intero eluati è stata effettuata su 100 esemplari (concentrazione di DNA media: 1.573.898 IU/ml, range: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) e ha dato un valore di 93,0%. Così, sette campioni con concentrazioni di HBV DNA del siero basso tra 409 e 3.643 IU/ml non sono stati rilevati da DBS test. Di 100 sieri che avevano dimostrato di essere positivo del RNA di HCV (HCV RNA concentrazione media: 1.415.944 IU/ml, range: 2.479 - > 7.692.000 IU/ml), corrispondenti aliquote di sangue intero erano disponibili. L'indagine comparativa ha provocato una sensibilità analitica del 100% per le determinazioni di RNA di HCV da eluati DBS". 17
Per testare il protocollo delineato per la preparazione e l'elaborazione di DBS in condizioni di campo, è stato usato in stretta collaborazione con l'Istituto Robert Koch-(Berlino, Germania) durante la fase pilota dello studio "Droghe e malattie infettive croniche", che era condotti sui tossicodipendenti attivi nelle città tedesche di Berlino ed Essen18. Tutti i 534 partecipanti iscritti (433 uomini e 101 donne) hanno subito il prelievo di sangue capillare come descritto in dettaglio nelle sezioni 2.2.1 – 2.2.3 del protocollo precedente, e DBS erano, ancora una volta, eluita mediante aggiunta di 1.000 µ l di tampone PBS-basato.
Due individui sono stati diagnosticati per essere cronicamente infettato con HBV, e 39 ha mostrato il modello sierologico di un'infezione da HBV risolto. Inoltre, quindici partecipanti erano positivi per anti-HBs (lo stato dopo la vaccinazione) e otto sono stati trovati per essere positivi per anti-HBc isolato. La prevalenza di anti-HCV tra i partecipanti era 57,3% (N = 193) a Berlino e 73.0% (N = 144) a Essen. Dall'anticorpo-positivo campioni 65% (N = 125) e 62% (N = 89) erano anche viremici. Venti-cinque fuori gli 534 individui risultati positivi per anti-HIV. Diciannove delle infezioni erano già conosciuti e 24 di questi individui sono stati co-infettati con HCV.
I risultati ottenuti dai test di DBS con attenzione sono stati confrontati con i dati anamnestic dei partecipanti di studio per quanto riguarda lo stato auto-riferito di HBV e HCV. Questo confronto in combinazione con i risultati dei test accoppiato coppie siero/DBS hanno portate a modifiche minori dell'algoritmo test per la fase principale dello "Studio DRUCK", che sarà iscrivere gli utenti di droga attiva in sei ulteriori grandi città tedesche: "gli individui infettati con HIV sarà sempre testato per la presenza di HBV DNA. Partecipanti di cui eluati DBS sono positivi per anti-HBc o anti-HBs dovrebbero essere sottoposti a un prelievo venoso durante una seconda fase di consultazione al fine di chiarire sicuramente il loro status di anti-HBc/anti-HBs e, infine, tutti gli eluati DBS saranno proiettati per l'HCV RNA indipendentemente dai risultati dei test anti-HCV". 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>Parametri</td>
			<td>Sieri accoppiati/DBS eluati (N)</td>
			<td>Risultati discrepanti (N)</td>
			<td>Motivo delle discrepanze tra test siero ed eluati DBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>Due pazienti con infezione cronica da HBV. Entrambi erano sotto trattamento antivirale e uno di loro era co-infettato con HIV. Le concentrazioni di HBsAg nel siero: 749 IU/ml e 6 UI/ml, rispettivamente.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>Nel siero, ventidue pazienti hanno avuti un'infezione HBV risolta. Sei individui hanno mostrato il reperto sierologico "anti-HBc alone". Ventidue dei pazienti erano co-infettati con HIV. Da "i resolver HBV", venti sono stati valutati come "Anti-HBs positivi solo" testando DBS e, quindi, sono stati erroneamente classificati come "condizione dopo la vaccinazione".</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>I quattro pazienti non co-infetti con HIV hanno avuti concentrazioni di siero anti-HBs di 11 ‑ 26 IU/l, che erano troppo basse per consentire il rilevamento di anticorpi dopo eluizione delle macchie di sangue essiccato.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>I rispettivi sieri erano stati ottenuti da sette pazienti con concentrazioni di HBV DNA basso del siero che variano da 409 IU/ml a 3.643 IU/ml.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HCV</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>Questi quattro sieri erano stato preso dai pazienti con infezione da HCV risolte da tempo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/anti-HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Risultati ottenuti da 1.762 DBS, che sono stati preparati e trasformati dal successivo di sangue intero venoso il protocollo proposto nella presente comunicazione, confrontano ai risultati nei campioni accoppiati del siero come riferimento.

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Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

La preparazione e il trattamento delle macchie di sangue essiccato (DBS) per la loro analisi finale sono ancora poco standardizzati per la maggior parte delle applicazioni diagnostiche. Per ovviare a questa lacuna, un protocollo completo di passo-passo è suggerito e successivamente valutato per quanto riguarda la sua efficacia per la rilevazione di markers di infezioni virali.

Macchie di sangue essiccato - preparazione ed elaborazione per l'uso in test immunologici e tecniche molecolari

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

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39.4K Views.  University of Duisburg-Essen. La preparazione e il trattamento delle macchie di sangue essiccato (DBS) per la loro analisi finale sono ancora poco standardizzati per la maggior parte delle applicazioni diagnostiche. Per ovviare a questa lacuna, un protocollo completo di passo-passo è suggerito e successivamente valutato per quanto riguarda la sua efficacia per la rilevazione di markers di infezioni virali.

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Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Ricerca

Biologia

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonda Microfluidic: funzionamento e utilizzo per l&#39;elaborazione delle superfici localizzate

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Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Non terminale Tecniche di prelievo di sangue in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Tecniche per l&#39;Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

L&#39;Assemblea e l&#39;applicazione di &quot;Shear Anelli &#39;: A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Micron-scala Phenotyping tecniche di mais fasci vascolari basato su x-Ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...