Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.

1. إعداد BCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الفك السفلي الخنازير من جزار المحلية الطازجة قدر الإمكان. وضع الفك السفلي على سطح ثابت والافراج عن سمك رفرف كامل اهتماما خاصا بعدم مغادرة أي نوع من الأنسجة الرخوة أو السمحاق تعلق على العظام. العمل في بيئة نظيفة دون الحاجة للعمل تحت غطاء تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحريرها سمك رفرف كامل، واستخدام مكشطة العظام لحصاد رقائق العظام من الجانب الشدق. يرجى ملاحظة أن مكشطة العظام يجب أن تكون حادة. التعامل بحزم مكشطة العظام ومع الحركات الطويلة بجمع العظام. تجاهل رقائق العظام الصغيرة التي 1MM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحفاظ على رقائق العظام الأم، وضع مباشرة رقائق العظام في أطباق بلاستيكية من 10CM قطر مع متوسط ​​Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) تستكمل مع 1٪ المضادات الحيوية وantimycotics عدم السماح لهم لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم تأثير المعالجة الحرارية، ورقائق العظام عرضة للبسترة لمدة 30 دقيقة في 80 ° C أوالأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم تأثير التنقيه، يهز رقائق العظام في 1 M HCL لمدة 4-6 ساعة عند 4 درجات مئوية، ويغسل مرارا مع مستنبت حتى الرقم الهيدروجيني محايدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ما مجموعه 5 غرام من رقائق العظام في 10 مل DMEM جديدة تستكمل مع 1٪ المضادات الحيوية وantimycotics في طبق بلاستيكي جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق بلاستيكية في جو مرطب عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم، والحصاد BCM. الطرد المركزي BCM في 200 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة الحطام، تصفية أنه معقم (0.2 نانومتر)، والحفاظ على قسامات في المجمد -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد في الأوراق المالية BCM فورا قبل الاستخدام وتجنب دورات متكررة من تجميد والذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء التجارب المشار إليها، نقع الأغشية الكولاجين مع مليار متر مكعب أو المصل خالية متوسطة لمدة 1 ساعة على RT. يغسل بقوة الأغشية مع برنامج تلفزيوني ووضعها في 96 لوحات جيدة. هي المصنفة الأغشية الرطبة مع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتلخص عملية إعداد BCM في الشكل 1. </لى&gt; </ol> 2. اختبارات بيولوجية استنادا إلى خلايا اللحمة المتوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا اللحمة المتوسطة الإنسان البذور (على سبيل المثال خلايا العظام، واللثة والخلايا الليفية الرباط اللثة) في لوحة 12-جيدا مع تركيز 30000 خلية / سم 2. البذور الخلايا تستخدم متوسطة النمو التي تتكون من DMEM، و 10٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية. السماح للخلايا نعلق على لوحة O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل مستنبت وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية. تحفيز الخلايا عن طريق إضافة قبل تحسنت المصل خالية مستنبت مع وبدون 20٪ BCM. وضع الخلايا في جو مرطب عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل مستنبت، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول المفضل لديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تركيز الحمض النووي الريبي من أجل الحصول على نفس الكمية من الحمض النووي الريبي في كل عينة. إعداد cDNAs وإجراء QRT-PCR لتحليل الجينات المحددة باستخدام بادئات هو مبين في الجدول 1. ملاحظة: هذه هي التخفيفات من كل مكون: 2X SYBR الأخضر، 20X التمهيدي إلى الأمام، 20X التمهيدي العكس، 5X المياه DD العقيمة، 5X كدنا]. يتم تنفيذ QRT-PCR في 40 دورات من 95 درجة مئوية 15 ثانية و 60 ° C 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب مستويات التعبير النسبية التي تطبيع إلى GAPDH الجينات التدبير المنزلي باستخدام طريقة Δ (ΔCt) حيث ΔCT هو الهدف CT - CT GAPDH وΔ (ΔCT) هو ΔCT حفز - ΔCT السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك مراقبة الجودة، إضافة BCM إلى مستنبت لتحفيز جميع أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا اللحمة المتوسطة، الخلايا المكونة للدم أو الخلايا البطانية. </li></ol>

<ol>
	<li>Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Stability+of+Early+Implant+Placement+with+Contour+Augmentation.">Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation.</a> Journal of dental research. , (2013).</li><li>Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=augmentation+procedures+in+implant+dentistry.">augmentation procedures in implant dentistry.</a> The International journal of oral &amp; maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).</li><li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=substitutes:+an+update.+Injury.">substitutes: an update. Injury.</a> 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).</li><li>Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=healing+and+graft+resorption+of+autograft,+anorganic+bovine+bone+and+beta-tricalcium+phosphate.+A+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs.">healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).</li><li>Jensen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+biphasic+calcium+phosphate+in+standardized+bone+defects:+a+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs.">Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).</li><li>Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=graft+and+bone+graft+substitutes+in+spine+surgery:+current+concepts+and+controversies.">graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).</li><li>Khan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+bone+grafting.">The biology of bone grafting.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).</li><li>Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteogenic+effect+of+bone+transplants+in+rabbits.+The+Journal+of+bone+and+joint+surgery.">The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery.</a> British. 50, 866-873 (1968).</li><li>Bone Urist, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=formation+by+autoinduction.">formation by autoinduction.</a> Science. 150, 893-899 (1965).</li><li>Caball&#233;-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+porcine+bone+conditioned+medium.">Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium.</a> The International journal of oral &amp; maxillofacial implants. , (2014).</li><li>Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-Conditioned+Medium+Inhibits+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Cells+In+Vitro.">Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro.</a> Clinical implant dentistry and related research. , (2014).</li><li>Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+chips+release+of+sclerostin+and+FGF-23+into+the+culture+medium:+an+in+vitro+pilot+study.">Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study.</a> Clinical oral implants research. , (2014).</li><li>Caball&#233;-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=conditioned+medium+enhances+osteoclastogenesis+in+murine+bone+marrow+cultures.+Clin+Oral+Impl+Res;+in.">conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).</li><li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-conditioned+medium+changes+gene+expression+in+bone-derived+fibroblasts).">Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts).</a> IJOMI accepted. , (2014).</li><li>Fulzele, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelopoiesis+is+regulated+by+osteocytes+through+Gsalpha-dependent+signaling.">Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling.</a> Blood. 121, 930-939 (2013).</li><li>Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demineralized+bone+matrix+mediates+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+in+vitro:+effect+of+age+of+cell+donor.">Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor.</a> Journal of. 11, 1703-1714 (1996).</li><li>Kupcova Skalnikova, ., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+techniques+for+characterisation+of+mesenchymal+stem+cell+secretome.">Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome.</a> Biochimie. , (2013).</li><li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cell+secretome:+A+novel+role+for+progranulin+during+risedronate+treatment.">Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment.</a> , (2013).</li><li>Schuldt Filho, ., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+of+demineralized+bone+matrix+activates+TGF-&#946;+signaling+pathways+in+mesenchymal+cells+in+vitro.">Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-&#946; signaling pathways in mesenchymal cells in vitro.</a> J Cranio Maxill Surg. , (2015).</li><li>Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+implant+placement+following+single-tooth+extraction+in+the+esthetic+zone:+biologic+rationale+and+surgical+procedures).">Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures).</a> The International journal of periodontics &amp; restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).</li><li>Stoecklin-Wasmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorbable+collagen+membranes+for+periodontal+regeneration:+a+systematic+review.">Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review.</a> Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف. تلقى جوردي Caballé-سيرانو على منحة دراسية من مؤسسة أبحاث طب الأسنان والتعليم، بازل، سويسرا.

مكيفة العظام المتوسطة يعكس النشاط التي تم إصدارها من ترقيع العظام خلال المراحل الأولى من تجديد العظام. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تكييفها لدراسة استجابة من أنواع مختلفة من الخلايا المشاركة في تجديد العظام. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لإعداد المتوسط...

ويستخدم على نطاق واسع العظم ذاتي لسد العيوب التي حدثت نتيجة للتشوه، جراحة resective، والجراحة الترميمية الصدمة، وقبل الزرع وضع 1،2. فهم المبادئ البيولوجية لكيفية دعم ترقيع العظام عملية الكسب غير المشروع التوحيد ليست المفتاح الوحيد لفهم لماذا تعتبر طعم ذاتي لتكون معيار الذهب في الجراحة الترميمية، بل هو أيضا الكترونية لتصميم محسن للبدائل العظام 3. ومع ذلك، الكسب غير المشروع توحيد أسرع مع العظم ذاتي مقارنة بدائل العظام 4،5. وبالتالي، لا بد من الكشف عن الآليات الجزيئية والخلوية التي تجعل العظام ذاتي فعالة جدا لدعم تجديد العظام. هناك ثلاث خصائص الكتاب المدرسي لطعم ذاتي التي تعتبر لدعم 6،7 عملية الدمج. الأول، هو العظم ذاتي عظمي، وتوفير التوجيه للالعظام التي شكلت حديثا في النموإلى الخلل. ثانيا، العظام ذاتي هو المكونة للعظم، وهذا يعني أنه يحتوي على خلايا اللحمة المتوسطة التي يمكن أن تفرق في بانيات 8. الثالث، العظام ذاتي هو osteoinductive كما عوامل النمو مثل البروتينات مخلق العظام مدفون في المصفوفة يمكن الشروع في عملية داخل الغضروف أو حتى الغشائي تكوين العظام 9. وهناك جانب آخر: رقائق العظام الطازجة عقد وظيفة نظير الصماوي استنادا إلى الملاحظات في المختبر مع &quot;المتوسطة مكيفة العظام&quot; 10-15. كما أثر تكون النقويات تجدر الإشارة 16. مصطلح مماثل &quot;العظام المنزوعة المعادن مكيفة مصفوفة المتوسطة&quot; التي صيغت بالفعل في 1996 ويدعم مفهوم شامل وظيفة نظير الصماوي من العظام، وحتى عندما يتم معالجتها من قبل التنقيه 17. لأغراضنا، BCM يمكن إعداد من الخنزير الطازج الفك السفلي 10،11. وكشفت التحليلات البروتين من BCM تكوين معقد، بما في ذلك حقيقة النموالأملاح ومكونات المصفوفة خارج الخلية 10، وتمتد أيضا المعرفة القائمة على proteasome والعظام كله 18،19. وبالتالي، يجب BCM تعكس النشاط التي تم إصدارها من تعديلات مختلفة من الطعوم العظمية في المختبر. ماذا يحدث عندما تتعرض الخلايا الوسيطة، على سبيل المثال تلك المعزولة من رقائق العظام أو من الأنسجة اللينة عن طريق الفم، لBCM؟ في المختبر، BCM يقلل المكونة للعظم والتمايز مكون الشحم، ويثير زيادة ملحوظة في عدد IL11 التعبير 11. الجينوم كشف ميكروأري واسعة أكثر من الجينات أن أعرب تفاضلي في خلايا اللحمة المتوسطة ردا على BCM. من بين هذه الجينات هي adrenomedullin (ADM)، IL11، IL33، NADPH أوكسيديز 4 (NOX4)، بروتيوغليكان 4 (PRG4، أو lubricin) وpentraxin 3 (PTX3) 15. BCM تم الحصول عليها من رقائق العظام تعقيمها فشلت في تغيير تعبير عن الجينات المعنية 14. كان BCM من رقائق العظام التي خضعت البسترة وتجميد قادرة علىتغيير التعبير الجيني 14. متوسطة مكيفة أيضا مصفوفة العظام المنزوعة (DBM-CM) يتغير التعبير عن TGF-β تنظيم الجينات 20. ومن المثير للاهتمام، والأغشية حاجز الكولاجين تستخدم لحماية رقائق العظام من الأنسجة الرخوة المحيطة 21،22، كثف تلك الأجزاء من BCM التي هي المسؤولة عن التغيرات في التعبير الجيني 23. ويمكن تمديد البحوث BCM إلى أنواع الخلايا الأخرى المشاركة في تجديد العظام مثل الآكلة-resorbing العظام والخلايا البطانية، على سبيل المثال لا الحصر. وبصفة عامة فإن البيانات في المختبر تراكم الأساس العلمي لتصميم دراسة ما قبل السريرية. هذا البروتوكول ذو شقين: أولا، لكنه يظهر كيفية تحضير BCM. ثانيا، فإنه يظهر كيفية اختبار النشاط البيولوجي التي تقوم على خلايا اللحمة المتوسطة في المختبر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pig Mandibles</td>
			<td>Local bucher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Scraper</td>
			<td>Hu-Friedy</td>
			<td>PPBUSE2/36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics &#38; Antimicotics</td>
			<td>All life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Membranes (Bio-Gide)</td>
			<td>Geistlich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation</td>
			<td align="right">16030074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Corporation</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			High Pure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4379012001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green (for Q-RT-PCR)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4673484001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone conditioned medium: preparation and bioassay

وتستخدم على نطاق واسع ترقيع العظام ذاتي في الفم والوجه والفكين جراحة، طب العظام، والكسور. ترقيع العظام ذاتي ليس فقط استبدال العظام في عداد المفقودين، كما أنها تدعم عملية معقدة من تجديد العظام. ويعزى هذا السلوك مواتية لطعم ذاتي لخصائص ثلاثة: osteoconductivity، osteogenicity، وosteoinductivity. ومع ذلك، هناك جانب آخر: العظام ترقيع الافراج عن عدد لا يحصى من الجزيئات، بما في ذلك عوامل النمو، والتي يمكن أن تستهدف خلايا اللحمة المتوسطة العاملة في تجديد العظام. خصائص نظير الصماوي من ترقيع العظام يمكن دراستها في المختبر عن طريق استخدام المتوسطة مكيفة العظام (BCM). هنا نقدم بروتوكول بشأن كيفية إعداد المتوسطة مكيفة العظام من الأصلي القشرية خنزير العظام، والعظام التي خضعت المعالجة الحرارية أو التنقية. الخلايا يمكن أن يتعرض مباشرة لBCM أو المصنف على المواد الحيوية، مثل الأغشية الكولاجين، غارقة في السابق مع BCM. نعطي أمثلة لفي المختبر bioassaيس مع خلايا اللحمة المتوسطة على التعبير عن TGF-β الجينات تنظيمها. يجب على البروتوكولات المعروضة يشجع على مواصلة الكشف عن الآثار نظير الصماوي من ترقيع العظام أثناء تجديد العظام وفتح مسار للأبحاث متعدية في مجال واسع من الجراحة الترميمية.

يتم إعداد العظام مكيفة المتوسطة من رقائق العظام الخنزير الطازج. يظهر محة عامة عن عملية لإعداد BCM واستخدام المواد الحيوية في تركيبة مع BCM في الشكل 1 والشكل 2 على التوالي. أثناء إعداد BCM، فمن المهم الحصول على رقائق العظام كبيرة مع الحركات طالما حركات قصيرة أو رقا...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay at JoVE.com

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

وصفنا هنا كيفية إعداد المتوسطة مكيفة العظام (BCM) واختبار نشاطه في المختبر.

العظام مكيفة المتوسطة: إعداد والأحيائي

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

bone-conditioned-medium-preparation-and-bioassay

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  School of Dental Medicine, University of Bern.  وصفنا هنا كيفية إعداد المتوسطة مكيفة العظام (BCM) واختبار نشاطه في المختبر. 

Video: Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

الحفاظ على الولبخية في الخلية خالية متوسطة

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides vital information on bone turnover or bone formation and resorption. This has tremendous importance in a variety of clinical and research applications. It yields beautiful images1 and allows for techniques such as fluorochrome assessment and histomorphometry2. Fluorochrome analysis is a technique where fluorescent dyes that bind to calcium are injected at a particular time point, which allows for quantification of the amount of mineralisation at that given time. Histomorphometry is a process of bone quantification at the microscopic level. 
Performing undecalcified bone histology is technically challenging, particularly with large size specimens. It requires variations in technique from those used in standard paraffin embedded histology. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them. Specimen preparation, fixation and processing are achieved with a manner similar to other soft tissues, however due to the density and lower permeability of bone considerably longer fixation and processing times are required, often taking several weeks. Embedding is achieved using a supporting medium with similar or equal hardness and density to the bone such as methacrylate- based resins, but unlike paraffin infiltration and embedding, this is an irreversible step. Sectioning can be achieved by grinding which produces a thicker section, which is optimal for studies such as fluorochrome analysis. This is best achieved using a diamond blade on a macrotome. Alternatively, thinner sections can be produced for light microscopy and this is achieved using a sledge microtome with a very sharp blade. The sledge microtome provides the additional strength and stability required for large, hard blocks. Resin embedded sections can be stained with a variety of stains, which are demonstrated.

Undecalcified bone histology provides important information for a variety of clinical and research applications. It is technically challenging, particularly with large size specimens. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them.

Undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل Histomorphometry ملون تألقي

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

جمع الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي من مفصل الركبة هشاشة العظام البشرية

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

استخدام محلل التدفق الأيضي للخلايا في الوقت الفعلي لمراقبة الطاقة الحيوية لمنطقة العظام

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

فحص كيميائي محسن للتعرف السريع على الجاذبات الكيميائية الريزوبكتيرية في إفرازات الجذر

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي لتحديد سمية المبيدات الحشرية للبعوض وذباب الفاكهة

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is limited by cost, throughput, and the caveats inherent to isotopic labeling of the food Fe. Thus, there exists a critical need for an approach that is high-throughput and cost-effective. The Caco-2 cell bioassay was developed to satisfy this need. The Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability utilizes simulated gastric and intestinal digestion coupled with culture of a human intestinal epithelial cell line known as Caco-2. In Caco-2 cells, Fe uptake stimulates the intracellular formation of ferritin, an Fe storage protein easily measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ferritin forms in proportion to Fe uptake; thus, by measuring Caco-2 cell ferritin production, one can assess intestinal Fe uptake from simulated food digests into the enterocyte. 
Via this approach, the model replicates the key initial step that determines food Fe bioavailability. Since its inception in 1998, this model approach has been rigorously compared to factors known to influence human Fe bioavailability. Moreover, it has been applied in parallel studies, with three human efficacy studies evaluating Fe biofortified crops. In all cases, the bioassay correctly predicted the relative amounts of Fe bioavailability from the factors, crops, and overall diet. This paper provides detailed methods on Caco-2 cell culture coupled with the in vitro digestion process and cell ferritin ELISA necessary to conduct the Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability.

The Caco-2 cell bioassay for iron (Fe) bioavailability represents a cost-effective and versatile approach to assess Fe bioavailability from foods, food products, supplements, meals, and even diet regimens. Thoroughly validated to human studies, it represents the state of the art for studies of Fe bioavailability.

المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 لقياس التوافر البيولوجي للحديد الغذائي

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

غرسات الغضروف الاصطناعي لتجديد العظام عن طريق التعظم داخل الغضروف

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز تجديد العظام مع تكامل الغضروف الاصطناعي الوعائي 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

تشكيل العظام المتكاملة من خلال التعظم داخل الغضروف في الجسم الحي باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...