Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.

1. הכנת BCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג לסתות חזיר מהקצב המקומי הטרי ככל האפשר. מניחים את הלסתות על משטח יציב ולשחרר דש בעובי מלא תשומת לב מיוחדת שלא להשאיר את כל רקמה רכה או periosteum מצורף לעצם. לעבוד בסביבה נקייה ללא הצורך לעבוד תחת מכסה המנוע הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שדש בעובי מלא הוא שוחרר, להשתמש מגרד עצם לקצור את שבבי עצם מהצד הלחי. שים לב שמגרד העצם צריך להיות חד. ידית בחוזקה מגרד העצם ועם תנועות ארוכות לאסוף את העצם. בטל שבבי עצם קטנים יותר 1 מ&quot;מ ש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על שבבי עצם ילידים, למקם ישירות שבבי העצם בצלחות פלסטיק של 10 ס&quot;מ קוטר עם המדיום של הנשר השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת אנטיביוטיקה 1% וantimycotics לא לתת להם להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ההשפעה של עיבוד תרמי, שבבי עצם כפופים לפסטור למשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס אוהחיטוי במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ההשפעה של איבוד מינרלים, לנער שבבי עצם ב 1 M HCL במשך 4-6 שעות על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף שוב ושוב עם מדיום התרבות עד pH ניטראלי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כולל של 5 גרם של שבבי עצם לDMEM הטרי 10 מיליליטר בתוספת אנטיביוטיקה 1% וantimycotics לתוך צלחת פלסטיק חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחות פלסטיק באווירת humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, BCM קציר. צנטריפוגה BCM ב XG 200 במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות, לסנן אותה (ננומטר 0.2) סטרילי, ולשמור aliquots הקפוא ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את מניית BCM מייד לפני השימוש ולהימנע ממחזורים חוזרים ונשנים של הקפאה והפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים שצוינו, לספוג קרומי קולגן עם מדיום BCM או סרום ללא עבור שעה 1 ב RT. לשטוף במרץ הקרומים עם PBS ולהכניס אותם לתוך 96 צלחות גם. קרומים רטובים הם זורעים עם תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך הכנת BCM מסוכם באיור 1. </li&gt; </ol> 2. bioassays המבוסס על תאי mesenchymal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע אנושיים mesenchymal (לדוגמא תאי עצם, חניכיים ופיברובלסטים רצועת חניכיים) לתוך צלחת 12 גם עם ריכוז של 30,000 תאים / 2 סנטימטר. זרע התאים להשתמש מדיום גידול בהיקף של DMEM, 10% בסרום עגל עוברי ואנטיביוטיקה. בואו התאים לצרף N / O הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום התרבות לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס. לעורר את התאים על ידי הוספת תרבות בינוני סרום ללא מחוממת מראש עם ובלי BCM 20%. מניחים את התאים באווירת humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם ולחלץ את RNA על פי הפרוטוקול המועדף עליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של רנ&quot;א כדי שתהיה לה הכמות של RNA בכל דגימה. הכן cDNAs ולבצע qRT-PCR לנתח את הגנים שנבחרו באמצעות פריימרים מוצגים בטבלה 1. הערה: אלה הם דילולים של כל רכיב: 2x SYBR הירוק, 20x פריימר קדימה, 20x הפוך פריימר, מים DD סטרילי 5x, 5x cDNA. QRT-PCR מתבצע ב40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס 15 שניות ו -60 מעלות צלזיוס 1 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את רמות הביטוי היחסית על ידי נרמול לGAPDH גן המשק בשיטת Δ (ΔCt) בי ΔCT היא יעד CT - CT GAPDH וΔ (ΔCT) הוא ΔCT המגורה - ΔCT שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בקרת איכות זו, להוסיף BCM למדיום תרבות כדי לעורר את כל סוגי תאים, כולל תאי mesenchymal, תאי hematopoietic או תאי האנדותל. </li></ol>

<ol>
	<li>Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Stability+of+Early+Implant+Placement+with+Contour+Augmentation.">Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation.</a> Journal of dental research. , (2013).</li><li>Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=augmentation+procedures+in+implant+dentistry.">augmentation procedures in implant dentistry.</a> The International journal of oral &amp; maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).</li><li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=substitutes:+an+update.+Injury.">substitutes: an update. Injury.</a> 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).</li><li>Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=healing+and+graft+resorption+of+autograft,+anorganic+bovine+bone+and+beta-tricalcium+phosphate.+A+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs.">healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).</li><li>Jensen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+biphasic+calcium+phosphate+in+standardized+bone+defects:+a+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs.">Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).</li><li>Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=graft+and+bone+graft+substitutes+in+spine+surgery:+current+concepts+and+controversies.">graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).</li><li>Khan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+bone+grafting.">The biology of bone grafting.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).</li><li>Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteogenic+effect+of+bone+transplants+in+rabbits.+The+Journal+of+bone+and+joint+surgery.">The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery.</a> British. 50, 866-873 (1968).</li><li>Bone Urist, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=formation+by+autoinduction.">formation by autoinduction.</a> Science. 150, 893-899 (1965).</li><li>Caball&#233;-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+porcine+bone+conditioned+medium.">Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium.</a> The International journal of oral &amp; maxillofacial implants. , (2014).</li><li>Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-Conditioned+Medium+Inhibits+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Cells+In+Vitro.">Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro.</a> Clinical implant dentistry and related research. , (2014).</li><li>Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+chips+release+of+sclerostin+and+FGF-23+into+the+culture+medium:+an+in+vitro+pilot+study.">Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study.</a> Clinical oral implants research. , (2014).</li><li>Caball&#233;-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=conditioned+medium+enhances+osteoclastogenesis+in+murine+bone+marrow+cultures.+Clin+Oral+Impl+Res;+in.">conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).</li><li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-conditioned+medium+changes+gene+expression+in+bone-derived+fibroblasts).">Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts).</a> IJOMI accepted. , (2014).</li><li>Fulzele, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelopoiesis+is+regulated+by+osteocytes+through+Gsalpha-dependent+signaling.">Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling.</a> Blood. 121, 930-939 (2013).</li><li>Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demineralized+bone+matrix+mediates+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+in+vitro:+effect+of+age+of+cell+donor.">Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor.</a> Journal of. 11, 1703-1714 (1996).</li><li>Kupcova Skalnikova, ., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+techniques+for+characterisation+of+mesenchymal+stem+cell+secretome.">Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome.</a> Biochimie. , (2013).</li><li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cell+secretome:+A+novel+role+for+progranulin+during+risedronate+treatment.">Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment.</a> , (2013).</li><li>Schuldt Filho, ., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+of+demineralized+bone+matrix+activates+TGF-&#946;+signaling+pathways+in+mesenchymal+cells+in+vitro.">Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-&#946; signaling pathways in mesenchymal cells in vitro.</a> J Cranio Maxill Surg. , (2015).</li><li>Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+implant+placement+following+single-tooth+extraction+in+the+esthetic+zone:+biologic+rationale+and+surgical+procedures).">Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures).</a> The International journal of periodontics &amp; restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).</li><li>Stoecklin-Wasmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorbable+collagen+membranes+for+periodontal+regeneration:+a+systematic+review.">Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review.</a> Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף. ג&#39;ורדי Caballé-סראנו קיבל מלגה מטעם הקרן למחקר לרפואת שיניים וחינוך, באזל, שווייץ.

בינוני-מותנה עצם משקף את הפעילות המסחרית של שתלי עצם בשלבים המוקדמים של התחדשות עצם השלבים. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים ללמוד את תגובת סוגים שונים של תאים מעורבים בהתחדשות עצם של. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי להכין מדיום מותנה ממילוי עצם או עצם מעובד. השיטו...

עצם אוטולוגית נעשה שימוש נרחב לגשר פגמים שנפלו כתוצאה ממום, ניתוח resective, ניתוח שחזור טראומה, ולפני מיקום שתל 1,2. הבנת העקרונות הביולוגיים של כמה תלי עצם לתמוך בתהליך של איחוד שתל היא לא מפתח היחיד להבין מדוע autografts נחשב סטנדרטי בניתוח שחזור הזהב, הוא גם יונית לעיצוב המשופר של תחליפי עצם 3. ובכל זאת, איחוד שתל הוא מהיר יותר עם ​​עצם אוטולוגית לעומת עצם תחליפי 4,5. לפיכך, הוא הכרחי כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים ותאיים שגורמים עצם אוטולוגית כל כך יעיל לתמיכה בהתחדשות עצם. ישנם שלושה מאפייני ספר לימוד של autografts שנחשבים לתמיכה בתהליך האיחוד 6,7. העצם ראשון, אוטולוגית הוא osteoconductive, מתן הדרכה לעצם החדש שנוצר לגדוללפגם. שנית, עצם אוטולוגית הוא osteogenic, כלומר הוא מכיל תאי mesenchymal שיכול להתמיין לosteoblasts 8. עצם שלישי, אוטולוגית הוא osteoinductive כגורמי גדילה כמו חלבוני המוךפו&quot;גנטי העצם קבורים במטריצה ​​יכולים להתחיל בתהליך של endochondral או אפילו יצירת עצם intramembranous 9. יש היבט נוסף: שבבי עצם מוכנים טרי להחזיק פונקציה אוטוקריני מבוססת על התצפיות במבחנה עם &quot;בינוני מותנה עצם&quot; 10-15. גם את ההשפעה של myelopoiesis יצוין 16. טווח דומה &quot;בינוני עצם demineralized מיזוג מטריצה&quot; כבר נטבע בשנת 1996 ותומך ברעיון הכללי של פונקציה אוטוקריני של עצם, גם כאשר מעובד על ידי איבוד מינרלים 17. למטרות שלנו, BCM יכול להיות מוכן מחזיר טרי לסתות 10,11. ניתוחי proteomic של BCM חשפו את ההרכב המורכב, הכוללים למעשה צמיחהORS ומרכיבים של מטריקס 10, גם הרחבת ידע הקיים בפרוטאזום של כל עצם 18,19. לפיכך, BCM צריך לשקף את הפעילות המסחרית של שינויים שונים של שתלי עצם במבחנה. מה קורה כאשר תאי mesenchymal, למשל אלה מבודדים משבבי עצם או מרקמות רכות בעל פה, נחשפים לBCM? במבחנה, BCM מפחית osteogenic ובידול adipogenic, ומעורר עלייה חזקה של ביטוי IL11 11. הגנום microarray הרחב גילה גנים רבים יותר לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתאי mesenchymal בתגובה לBCM. בין הגנים הללו adrenomedullin (ADM) הם, IL11, IL33, מונואמין NADPH 4 (NOX4), פרוטאו 4 (PRG4, או lubricin) וpentraxin 3 (PTX3) 15. BCM מתקבל משבבי עצם autoclaved לא הצליח לשנות את הביטוי של גנים בהתאמה 14. BCM משבבי עצם שעברו פסטור והקפאה היה מסוגללשנות ביטוי גני 14. בינוני גם מותנה של מטריצת demineralized עצם (DBM-CM) משנה את הביטוי של TGF-β-מוסדרת גנים 20. מעניין לציין, קרומי מחסום קולגן משמשים להגן על שבבי עצם מהרקמות הרכות סביב 21,22, נספחים אותם חלקים של BCM שאחראים לשינויים בביטוי הגנים 23. מחקר BCM יכול להתארך עד סוגי תאים אחרים מעורבים בהתחדשות עצם כגון osteoclasts resorbing-עצם ותאי האנדותל, עד כמה שם. בסך הכל, במבחנה נתוני צבירה לספק את הבסיס המדעי לעיצובו של מחקר פרה-קליני. הפרוטוקול הנוכחי הוא כפול: ראשית, הוא מראה כיצד להכין BCM. שנית, הוא מראה איך לבדוק הפעילות הביולוגית שלה מבוסס על תאי mesenchymal במבחנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pig Mandibles</td>
			<td>Local bucher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Scraper</td>
			<td>Hu-Friedy</td>
			<td>PPBUSE2/36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics &#38; Antimicotics</td>
			<td>All life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Membranes (Bio-Gide)</td>
			<td>Geistlich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation</td>
			<td align="right">16030074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Corporation</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			High Pure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4379012001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green (for Q-RT-PCR)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4673484001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone conditioned medium: preparation and bioassay

שתלי עצם אוטולוגית נמצאים בשימוש נרחב בניתוח, אורתופדיה, וtraumatology פה והלסתות. שתלי עצם אוטולוגית לא רק להחליף עצם חסר, הם גם תומכים בתהליך המורכב של התחדשות עצם. התנהגות חיובית זו של autografts מיוחסת לשלושה מאפיינים: osteoconductivity, osteogenicity, וosteoinductivity. עם זאת, יש היבט נוסף: העצם שתל לשחרר מספר עצום של מולקולות, כולל גורמי גדילה, אשר יכול למקד תאי mesenchymal המעורבים בהתחדשות עצם. המאפיינים אוטוקריני של שתלי עצם ניתן ללמוד במבחנה על ידי השימוש במדיום מיזוג עצם (BCM). כאן אנו מציגים פרוטוקול על איך להכין מדיום מיזוג עצם מעצם קליפת המוח חזיר ילידים, ועצם שעבר תהליך עיבוד או איבוד מינרלים תרמיים. תאים יכולים להיות חשופים ישירות לBCM או זורעים על ביו-חומרים, כגון ממברנות קולגן, ספוג בעבר עם BCM. אנחנו נותנים דוגמאות במבחנת bioassaי&quot;ש עם תאי mesenchymal בביטוי של גנים מוסדרים TGF-β. הפרוטוקולים שהוצגו לעודד לחשוף עוד יותר את ההשפעות אוטוקריני של שתלי עצם במהלך התחדשות עצם ולפתוח נתיב למחקר translational בתחום הרחב של ניתוח שחזור.

בינוני אוויר עצם מוכן משבבי עצם חזירי טריים. סקירה כללית של התהליך להכנת BCM ולהשתמש בביו-חומרים בשילוב עם BCM מוצגת באיור 1 ואיור 2 בהתאמה. במהלך הכנת BCM, חשוב להשיג שבבי עצם גדולים עם תנועות ארוכות כתנועות קצרות או שבבי עצם קטנים מאוד יכול להשפיע על האיכות של BCM ?...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay at JoVE.com

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

אנו מתארים כאן כיצד להכין מדיום מיזוג עצם (BCM) ולבדוק את פעילותו במבחנה.

בינוני אוויר עצם: הכנה ומבדק

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

bone-conditioned-medium-preparation-and-bioassay

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  School of Dental Medicine, University of Bern.  אנו מתארים כאן כיצד להכין מדיום מיזוג עצם (BCM) ולבדוק את פעילותו במבחנה. 

Video: Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

שמירה ב Wolbachia בינוני סלולרי חינם

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides vital information on bone turnover or bone formation and resorption. This has tremendous importance in a variety of clinical and research applications. It yields beautiful images1 and allows for techniques such as fluorochrome assessment and histomorphometry2. Fluorochrome analysis is a technique where fluorescent dyes that bind to calcium are injected at a particular time point, which allows for quantification of the amount of mineralisation at that given time. Histomorphometry is a process of bone quantification at the microscopic level. 
Performing undecalcified bone histology is technically challenging, particularly with large size specimens. It requires variations in technique from those used in standard paraffin embedded histology. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them. Specimen preparation, fixation and processing are achieved with a manner similar to other soft tissues, however due to the density and lower permeability of bone considerably longer fixation and processing times are required, often taking several weeks. Embedding is achieved using a supporting medium with similar or equal hardness and density to the bone such as methacrylate- based resins, but unlike paraffin infiltration and embedding, this is an irreversible step. Sectioning can be achieved by grinding which produces a thicker section, which is optimal for studies such as fluorochrome analysis. This is best achieved using a diamond blade on a macrotome. Alternatively, thinner sections can be produced for light microscopy and this is achieved using a sledge microtome with a very sharp blade. The sledge microtome provides the additional strength and stability required for large, hard blocks. Resin embedded sections can be stained with a variety of stains, which are demonstrated.

Undecalcified bone histology provides important information for a variety of clinical and research applications. It is technically challenging, particularly with large size specimens. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them.

עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

בדיקת כימוטקסיס משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפים ריזובקטריאליים באקסודות שורש

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

יישום אקטואלי Bioassay כדי לכמת רעילות קוטל חרקים עבור יתושים וזבובי פירות

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is limited by cost, throughput, and the caveats inherent to isotopic labeling of the food Fe. Thus, there exists a critical need for an approach that is high-throughput and cost-effective. The Caco-2 cell bioassay was developed to satisfy this need. The Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability utilizes simulated gastric and intestinal digestion coupled with culture of a human intestinal epithelial cell line known as Caco-2. In Caco-2 cells, Fe uptake stimulates the intracellular formation of ferritin, an Fe storage protein easily measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ferritin forms in proportion to Fe uptake; thus, by measuring Caco-2 cell ferritin production, one can assess intestinal Fe uptake from simulated food digests into the enterocyte. 
Via this approach, the model replicates the key initial step that determines food Fe bioavailability. Since its inception in 1998, this model approach has been rigorously compared to factors known to influence human Fe bioavailability. Moreover, it has been applied in parallel studies, with three human efficacy studies evaluating Fe biofortified crops. In all cases, the bioassay correctly predicted the relative amounts of Fe bioavailability from the factors, crops, and overall diet. This paper provides detailed methods on Caco-2 cell culture coupled with the in vitro digestion process and cell ferritin ELISA necessary to conduct the Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability.

The Caco-2 cell bioassay for iron (Fe) bioavailability represents a cost-effective and versatile approach to assess Fe bioavailability from foods, food products, supplements, meals, and even diet regimens. Thoroughly validated to human studies, it represents the state of the art for studies of Fe bioavailability.

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במזון

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

שתלי סחוס מלאכותיים להתחדשות עצם באמצעות אוספיקציה אנדוכונדרלית

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

מחבר זרקור: שיפור התחדשות העצם באמצעות שילוב סחוס מלאכותי וסקולרי 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...