يوفر هذا الأسلوب استراتيجية فعالة لإعداد السقالات الوظيفية لأبحاث ورم العظام. decellularized العظام المصفوفة extracelullar، وأظهرت قابلية نموة مائية متغيرة للبقاء على قيد الحياة وأنشطة خلايا العظام. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن ثقافة خلايا العظام في المصفوفة المشتقة من العظام تظهر مورفولوجيا شديدة ال heterogenous مشابهة لهشاشة العظام السريرية.
توفر هذه الطريقة نموذجًا مثاليًا للتحقيق في تطور وتطور حساسيات المخدرات لأورام العظام ، مثل ورم العظام ، ساركوما Ewing ، وغيرها من الأورام الخبيثة الانبثاث حتى العظم. للبدء ، والحصول على أربعة إلى ستة أسابيع من العمر BALB / c الفئران ، بعد القتل الرحيم فأر باستخدام مقص الجراحية العقيمة ، وقطع الشظية الطازجة ، الساق ، وعظم الفخذ من طرف خلفي. مع مساعدة من ملاقط، قشر قبالة الأنسجة الظهارية، ومن ثم إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة.
شطف عظام الساق مع محلول PBS معقمة 10 mM مرتين لإزالة الدم في طبق طوله ستة سنتيمترات. تزج العظام في طبق مع 75٪ الإيثانول لمدة ثلاث دقائق ثم شطف مع برنامج تلفزيوني مرتين. تخزين العظام النظيفة في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر مع أنبوب معقم PBS في 80 درجة مئوية.
اذيب العظام المجمدة في درجة حرارة الغرفة ثم تجمد مرة أخرى عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. إخضاع العظام لأكثر من دورتين تجميد ذوبان للخلايا وانهيار الأنسجة. ثم، ضع العظام في أنبوب جهاز طرد مركزي معقمة 50 ملليلتر مملوءة بـ 0.5 من كلوريد الهدّان الطبيعي واحتضانها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري مع اهتزاز لطيف لضمان تغطية كاملة وحتى للعظام.
بعد decalcification ، decant حمض الهيدروكلوريك حل تماما وشطف العظام تحت المياه الجارية لمدة ساعة واحدة. ثم، استخدام الماء المقطر لغسل العظام مرتين لمدة 15 دقيقة لكل غسل على شاكر المدارية. تماما decant الحل.
لاستخراج الدهون في العظام ذات الملهى، ضع العظام في أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر مع خليط 1:1 من الميثانول والكلوروفورم. التفاف أنبوب مع رقائق القصدير لتجنب الضوء لمنع تحلل الكلوروفورم. ووضع الأنبوب على شاكر مداري لمدة ساعة واحدة.
ثم، استخدام ملاقط لنقل العظام إلى أنبوب آخر من الميثانول مع رقائق القصدير لمدة 30 دقيقة. إزالة الميثانول تماما، ويغسل بالماء المقطر مرتين لمدة 15 دقيقة على شاكر المدارية. Decant غسل المياه النهائية والمضي قدما في ظل حالة معقمة.
شطف العظام في طبق ستة سنتيمترات مع برنامج تلفزيوني عقيم لمدة ثلاث دقائق. أضف 40 ملليلتر من محلول TE المعقم بنسبة 0.05٪ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر وعظام حاضنة لمدة 23 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. تجاهل الحل TE، وشطف مرتين مع برنامج تلفزيوني عقيمة تكملها 90 غرام /مليلتر أمبيسيلين و 90 غرام / مل kanamycin لمدة 15 دقيقة لكل من على شاكر المدارية.
بعد decanting غسل النهائي تماما، وتجديد مرة أخرى مع 40 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة مع المضادات الحيوية. اغسل جيدا لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لتحقيق التعقيم الفعال للمساحات المسامية. ثم، نقل العظام إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر مليئة برنامج تلفزيوني مع المضادات الحيوية العقيمة.
يمكن تخزين المصفوفة خارج الخلية العظمية المعدة عند أربع درجات مئوية لمدة شهرين. اغمر بي إم في 75٪ الإيثانول في طبق ويصافح الطبق باليد لمدة 30 ثانية. ثم شطف مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 ثانية، مرتين.
نقل BEM على لوحة ثقافة خلية ستة-جيدا نظيفة. إضافة ملليلترين من ثقافة كاملة متوسطة لكل بئر. احتضان BEM بين عشية وضحاها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية.
الحصول على خطوط خلايا نظام التشغيل البشري في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مسبق الدفء تحتوي على مؤشر الفينول الأحمر. استخدام ماصة لتعليق خلايا OS مع تركيز تقريبي من 1 مرات 10 إلى 5. بعد أن يتم نقع BEM بالكامل في الوسط ، من epiphyses القريبة أو البعيدة ، يخترق الإبرة إلى تجويف النخاع في BEM وحقن خلايا OS في BEM.
احتضان نموذج OS-BEM لمدة ساعتين على الأقل في جو ثاني أكسيد الكربون المرطب 5٪ عند 37 درجة مئوية لضمان التزام الخلايا المحقونة بقوة بـ BEM. ثم أخرج الصحن من الحاضنة أضف ثقافة ملليلتر واحدة متوسطة على اللوحة، وابقيها في الحاضنة بين عشية وضحاها لتغطي سطح ثقافة BEM تمامًا.
قم بنقل نموذج OS-BEM برفق إلى بئر جديد من لوحة سداسية مع ملاقطة معقمة، ثم قم بإعادة تغذية متوسط ثقافة المليلتر الطازجة. ثقافة النموذج لمدة 14 يوما في الحاضنة. خلال فترة الحضانة لمدة 14 يومًا، استمر في مراقبة اللون المتوسط.
إذا تحول المتوسط إلى البرتقالي، أو حتى الأصفر، على الفور تحديث المتوسطة عن طريق تجاهل نصف المتوسطة القديمة وإضافة في المتوسطة الجديدة للحفاظ على بيئة صحية لخلايا نظام التشغيل. الحفاظ على رصد حالة الخلية تحت المجهر المقلوب الفلورانس. عندما تتوسع خلايا نظام التشغيل إلى لوحة، قم بنقل نموذج OS-BEM بلطف إلى بئر جديد آخر مع ملاقط عقيمة.
بعد ثقافة 14 يوما، بلطف شطف نموذج OS-BEM مع برنامج تلفزيوني لإزالة الوسط ثقافة. ثم نقل إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر وإضافة 10٪ buffered formalin لإصلاح لتحديد النسيج. بعد إزالة الألغام وإزالة الخلية، يبدو أن BEM شفافة مع مرونة أقوى ومثابرة مقارنة بعظم الفأر الأصلي.
يمكن ملاحظة بقايا العضلات الصغيرة في مساحة تجويف النخاع بوضوح. يظهر التصوير في المجال الساطع للعظم الأصلي و BEM المزيل الخلية، الإزالة الشاملة لخلايا الخلايا. البنية المسامية الطبيعية في ترتيب شبكة الكولاجين يتم صيانتها بشكل جيد في BEM غير الخلوية.
بالإضافة إلى ذلك، يُظهر التلطيخ المناعي للكولاجين الأول والكولاجين الرابع أن المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية يتم الحفاظ عليها في قصبة الماوس بعد إزالة الخلايا. خلال ثقافة 14 يوما، يتم اختراق كل من periosteum و endosteum من قبل التوسع في خلايا نظام التشغيل. تظهر خلايا نظام التشغيل على BEM غير الخلية مورفولوجيا غير متجانسة للغاية تشبه ميزات cytopathologic لقسم نظام التشغيل.
تحليل البيوكيميائية بعد زراعة في نموذج BEM لمدة 14 يوما يظهر مزايا كبيرة في الثقافات على المدى الطويل. أيضا، خلايا OS و BEM الثقافة، أعرب عن مصفوفة العظام عالية الجليكوبروتين، وهو محدد لمصفوفة العظام. وقد استخدم هذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر لإثبات عدم التجانس الظاهري وآلية تنظيمية للفك الفصال العظمي مع النجاح.
