يمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المواد الحيوية. خاصة لتجديد العظام. يتم استخدامها لتقييم فعالية المواد الحيوية والاستجابات المناعية المحتملة.
الميزة الرئيسية لهذه المنصة متعددة التخصصات هي أنها توفر مجموعة من المعايير للتنبؤ بالتكواؤم الحيوي لالمواد الحيوية المستخدمة في إصلاح العظام. الآثار المترتبة على هذه في المختبر وفي تقنيات العظام في الجسم الحي تمتد نحو اضطرابات العظام الأخرى. نظرا للحاجة إلى فحص ما قبل الفحص من المواد الحيوية العظام رواية.
يمكن أن توفر منهجية الجلد رؤى في المواد الحيوية للشفاء العظام، ويمكن أيضا أن تطبق على تقييمات المواد الحيوية لأي إشارة سريرية أخرى. متوسطة الثقافة من osteoblasts الأولية 14 يوما بعد إضافة متوسطة التمعدن العظمي. شطف مرتين مع 0.5 ملليلتر من 1X PBS.
ثم إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من 10٪ buffered حل formalin والتحضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. بعد 10 دقيقة, التعرق 10٪ buffered formalin مع أنبوب واحد الاستخدام وغسل مرتين مع 0.5 ملليلتر من الماء فائقة الpure. ثم إضافة 250 ميكرولترات من 40 ملليمتر أليزارين الأحمر S تلطيخ حل لهشاشة العظام الثابتة.
واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على شاكر في 100 يهز في الدقيقة الواحدة. بعد الحضانة مع حل تلطيخ، pirate حل تلطيخ مع أنبوب واحد الاستخدام وشطف مع ملليلتر واحد من الماء فائقة السخ. كرر هذه الخطوة خمس إلى 10 مرات حتى يأتي حل الشطف واضح لإزالة تلطيخ غير محدد.
بعد التعرق غسل النهائي، إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على شاكر كما كان من قبل. بعد ذلك، نقل أقراص الفوسفات بيتا tricalcium الملون إلى بئر جديدة ومسح لوحات مع ماسحة مسطحة لتسجيل تمعدن.
بعد التقاط الصور، إضافة 250 ميكرولترات من 10٪ من محلول كلوريد cetylpyridinium وتهز لمدة 15 دقيقة لاستخراج صبغة اليزرين الأحمر S. بعد ذلك، نقل الحل من الآبار إلى أنابيب فردية 1.5 ملليلتر وطاردة مركزية عند 17،000 × ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخفيف استخراج مع 10 ٪ من كلوريد cetylpyridinium محلول في حصة التخفيف من 1:10 إلى 1:20 في أنبوب 1.5 ملليلتر.
ثم نقل 300 ميكرولترات من كل عينة مخففة في آبار لوحة 96 جيدا. وتشمل اثنين من الآبار الفارغة التي تحتوي على 10٪ فقط من كلوريد cetylpyridinium. المقبل, إعداد سبعة معايير مرجعية Alizarin الأحمر S تتراوح بين 4 400 ميكرومولار عن طريق تمييع 40 ميليمولار عليزارين الأحمر تلطيخ حل مع 10٪ cetylpyridinium محلول كلوريد لتوليد منحنى قياسي.
تحميل 300 ميكرولترات من كل معيار في لوحة. وأخيراً، اقرأ ماصة العينات، وفراغات، والمعايير المرجعية في 520 نانومتر. عزل السلائف نخاع العظم العظمي من عظم الفخذ و tibiae من الماوس القتل الرحيم باستخدام مقص معقمة لإزالة الساقين من الجسم في مفصل الورك.
قطع أطرافه في الركبة والمفاصل الكاحل وإزالة الأنسجة الرخوة مع مشرط عقيمة والملقط. قطع epiphyses. إدراج إبرة قياس 27 تعلق على حقنة مليئة بميليلتر واحد من متوسط نمو العظام في التجويف وطرد النخاع في طبق بيتري معقمة ستة سنتيمترات.
بعد تكرار هذا لجميع عظم الفخذ و tibiae، نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. غسل طبق بيتري ستة سنتيمترات مع خمسة ملليلتر من نمو العظام المتوسطة ونقلها إلى نفس أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي عند 350 x ز عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد في بئر من تمايز العظم المتوسط. يوفر ماوس واحد BALB/c أعدادًا كافية من السلائف العظمية لطبقة ثقافة 24 بئرًا. أضف العظم العظمي الأولي المعلق في وسط نمو العظام على المواد الحيوية والضوابط عند 8.8*10^4 خلايا لكل سنتيمتر مربع.
بيتا tricalcium أقراص الفوسفات، والعظام البقرية تسيطر عليها، والبلاستيك ثقافة الأنسجة تستخدم هنا. احتضان في 37 درجة مئوية في خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، إضافة السلائف العظمية العظمية المعزولة حديثا وتمايز العظم العظمي المتوسطة إلى العظام الأولية المستزرعة والعودة إلى الحاضنة لمدة خمسة أيام من الثقافة في 37 درجة مئوية في خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون.
استبدل الوسط بوسيط تمايز العظم الطازج كل يومين. ثم وصمة العظام لphosphatase حمض راترات مقاومة لتقييم التمايز. حلق فروة رأس فأر BALB/c تخدير يبلغ من العمر ثمانية أسابيع وانظف السطح بمحلول اليود بنسبة 7.5٪povidone و 70٪ من الإيثانول.
غطي العينين مرهم العيون لمنع التجفيف أثناء العملية. ضمان مستوى مناسب من التخدير عن طريق عدم وجود رد فعل على إصبع قدم والذيل قرصة. ثم بعد إجراء شق القوس في منتصف الخط إزالة الأنسجة الضامة paracranium فوق العظام الجدارية اليمنى عن طريق كشط مع مشرط.
ثم استخدام ربتين الأسنان معقمة مع قطرها أربعة ملليمترات في 2000 التناوب في الدقيقة الواحدة لخلق خلل في الحجم الحرجة في العظام الجدارية اليمنى. ري المنطقة باستمرار مع محلول ملحي معقمة في حين الشق العظام الجدارية الحق وقطع من خلال ectocortext وبعض endocortex. لمنع الأضرار التي لحقت ديرا ماطر، استخدم مصعد صغير في الزّمرة لكسر الـ endocortex المتبقي.
ثم استخدام ملقط لرفع بعناية عظم العجل وإزالته. يجب أن يكون العيب الناتج دائريًا وقطره حوالي 3.5 ملليمتر. المقبل، ملء عيب الكالفاري مع بيتا tricalcium الفوسفات رغوة الكولاجين، presoaked في برنامج تلفزيوني عقيمة.
للحفاظ على المواد الحيوية في مكانها ، ضع 0.5 ميكرولترات من لاصق الأنسجة في نهاية العيب عند نقطتين متقابلتين. ثم أغلق الجلد بخياطة غير قابلة للغلق. وضع الماوس تخدير على ظهره، حلق الفراء البطن وتنظيف السطح حل حلق مع 7.5٪ povidone اليود و 70٪ الإيثانول.
بعد إجراء شق خط الوسط بطول ثمانية ملليمترات عبر الجلد على طول ألبا البطن ، زرع PBS غارقة في المواد الحيوية تحت الجلد. ثم خياطة الجلد مع خياطة غير قابلة للابغة. ثمانية أسابيع بعد زرع، استئصال موقع زرع مع الأنسجة المحيطة بها من الفأر القتل الرحيم.
هذه الصورة يدل على أن النمو على أقراص بيتا tricalcium الفوسفات هو مبين في الحانات المفتوحة لا يؤثر على صلاحية العظام مقارنة بالنمو على زراعة الأنسجة البلاستيك في سبعة و 14 يوما من الثقافة. كانت العظام المستزرعة ملطخة بالعليزارين الأحمر S بعد 14 يومًا. كان التمعدن أعلى بالنسبة لضوابط المتوسطة التمعدن مقارنة بـ أوستيوبلاسات المستزرعة في الوسط وحده.
وعلى أقراص الفوسفات tricalcium بيتا في آبار ثقافة التعليق. عندما ترك عيب في الكالفاري الحرجة الناجم جراحيًا فارغًا ، لوحظ وجود طبقة رقيقة تغطي العيب بأكمله ، ولكن لم يكن هناك تشكيل عظمي كبير في 12 أسبوعًا بعد العملية. في المقابل، عندما يحتوي العيب على رغوة الكولاجين فوسفات بيتا ترايكالغيم، فإن بقايا الرغوة المحاطة بأنسجة ليفية كثيفة بما في ذلك بعض الأوعية الدموية والخلايا الالتهابية سدت منطقة العيب دون دليل على تكوين العظام.
بعد ما تحت الجلد بيتا tricalcium زراعة رغوة الكولاجين الفوسفات، لوحظ استجابة التهابية مع الخلايا العملاقة الجسم الأجنبية على الهماتوسلين والأيوسين الملون أقسام دليل على التليف على أقسام ماسون الملون ثلاثية الألوان في ثمانية أسابيع. في المقابل ، كان موقع زرع الضوابط صورية التهاب الحد الأدنى وليس التليف. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم القيام بدقة واستنساخ الكالفاريوم دون إيذاء الحيوان.
بعد هذا الإجراء يمكن أن تكون أساليب أخرى مثل التمايزات العظمية و الفوارق عالية الإنتاجية في نماذج المناعة البريتونية preformed من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل استجابة osteoclast لالمواد الحيوية ونوع الاستجابة المناعية.
