This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

O estudo das interacções hospedeiro / agentes patogénicos tem provado ser um método notável compreender infecções bacterianas e desenvolver estratégias alternativas para combater doenças infecciosas. No entanto, devido à diversidade de estratégias elaboradas por diferentes agentes patogénicos bacterianos, a identificação e caracterização de factores de virulência da bactéria e do hospedeiro vias de sinalização que são alvo de infecções durante representam um verdadeiro desafio. Esta situação exige o desenvolvimento de novas abordagens para a identificação em larga escala de chave host / patógenos centros de interação. O desenvolvimento recente do inovador, de alto rendimento e técnicas de rastreio de alto conteúdo representa um recurso valioso que pode ser adaptado para o estudo de agentes patogénicos bacterianos intracelulares 15. Aqui, usamos o zoonótica bacteriana burnetii patógeno Coxiella como um modelo para desenvolver abordagens de triagem que combinam mutagénese por transposões e ensaios baseados em fluorescência. Importantly, este método de rastreio permite o monitoramento simultâneo de várias etapas do ciclo intracelular Coxiella, proporcionando uma visão global das estratégias desenvolvidas por esta bactéria para invadir, replicar e persistir dentro das células infectadas. A abordagem aqui descrita baseia-se em duas técnicas bem estabelecidas, mutagénese por transposões e ensaios baseados em fluorescência, que têm sido aplicados com sucesso para o estudo de agentes patogénicos bacterianos. Combinando estas técnicas no âmbito das telas de elevado rendimento / alto conteúdo permite-nos avaliar o efeito de um grande número de mutações bacterianas por meio da análise um número muito elevado de eventos (normalmente 15.000 células infectadas por mutações bacterianas são fotografados e analisados). Isso fornece uma análise estatística importante de eventos tais como a invasão bacteriana de células hospedeiras e replicação intracelular, que são, por natureza, sujeito a alta variabilidade. É importante notar que as outras linhas celulares que EPithelial pode ser utilizado para este tipo de rastreio. No entanto, as células epiteliais e planas grandes são adequados para a análise de imagem como organelos celulares hospedeiras são mais fáceis de detectar. Porque a maioria dos microscópios automatizados pode lidar automaticamente um grande número de placas, praticamente não há limites para o número de mutantes que podem ser rastreados simultaneamente. Dependendo do agente patogénico, o utilizador pode privilegiar a utilização de um epifluorescência ou um microscópio confocal. O tempo de aquisição de imagem irá principalmente depender da sensibilidade da câmara do microscópio, com o número de campos adquiridos por poço e sobre o número de canais adquiridos por campo de visão. O usuário pode decidir como ajustar esses fatores para otimizar o protocolo de triagem. Como um exemplo, que trabalhada uma placa de 96 poços / h utilizando as condições indicadas no ponto 5.1. A análise de imagem depende em grande parte da máquina (ou um conjunto de máquinas) utilizado. Nós usamos um 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM estação de trabalho. Esta máquina exige aproximadamente 40 min para analisar imagens obtidas a partir de uma placa. Um aspecto importante a ter em conta no desenvolvimento destes ensaios é a criação de novo (ou a optimização de protocolos existentes) para permitir a manipulação e processamento de um grande número de amostras. Um exemplo típico é o desenvolvimento da colónia única abordagem de PCR primário, o que nos permitiu amplificar rapidamente e fragmentos de sequência de ADN Coxiella contendo o local de inserção de transposão cada, a partir de amostras muito pequenas. Com base na nossa experiência, a polimerase de alta fidelidade tem de ser cuidadosamente seleccionados e testados a fim de obter resultados reprodutíveis. A única limitação desta abordagem podem esconder-se na observação de que, na maioria dos casos, cerca de 30% das amostras processadas não são exploráveis, quer devido ao PCR ou as etapas de sequenciação. No entanto, considerando que o isolamento de novos mutantes por transposões Coxiella não é um passo limitante da velocidade, isto não represenenviou uma questão importante. Do mesmo modo, o desenvolvimento de um ensaio fiável para a quantificação da concentração bacteriana de existências mutantes tem sido a chave para esta abordagem. Devido à tendência de Coxiella para agregar quando em suspensão, a utilização das leituras da densidade óptica não é aplicável para calcular a concentração de culturas e Coxiella a única alternativa existente foi de PCR quantitativa (qPCR). Aqui, a utilização de um agente intercalante de ADN fluorescente etiquetado acelerou significativamente bactérias quantificação. Esta abordagem também pode tomar vantagem da utilização de linhas de células estáveis ​​que expressam marcadores fluorescentes para vários compartimentos intracelulares, dependendo do agente patogénico utilizada. Outro aspecto importante é a utilização de meios de cultura celular isento de vermelho de fenol. Observou-se que este indicador de pH tem uma fluorescência natural que mede o espectro vermelho e verde que satura o sinal gravado no leitor de fluorescência automatizado. Tele estratégia aqui apresentada baseia-se na mutagénese de transposão aleatório. Para os mutantes de interesse, recomendamos validar transposições únicas (e clonalidade) utilizando transferência de Southern e amplificações de PCR do local de inserção do transposão. Além dos equipamentos descritos na seção de protocolo, equipes interessadas em usar a abordagem de triagem aqui apresentado, terá grande vantagem no set up de um banco de dados relacional para coleta de dados, um servidor para armazenamento de dados e uma estação de trabalho para análise de imagem rápida. Mais importante, o método aqui descrito é adequado para o estudo de outros agentes patogénicos bacterianos intracelulares proporcionado um método de mutagénese aleatória existe para o agente patogénico, as linhas celulares podem ser infectadas pelo agente patogénico e este exibe um fenótipo específico durante a infecção.

A bactéria endêmica emergente Coxiella burnetii é responsável por grandes surtos de febre Q, uma zoonose gripal debilitante com graves na saúde eo impacto económico 1. Os principais reservatórios de Coxiella são animais domésticos e de quinta, e estima-se que mais de 90% do gado leiteiro em os EUA realizar C. burnetii 2. Os seres humanos são hospedeiros acidentais que estão infectadas por inalação de aerossóis contaminados. Febre Q humana se manifesta seja como uma doença aguda ou crônica, que pode ter complicações fatais com uma taxa de mortalidade chegar a 65% 1,3. Com uma dose infecciosa de 1 - 10 organismos, Coxiella é o agente patogénico mais infecciosa, conhecida e tem sido investigado como uma potencial arma bio 4. O recente surto explosivo de febre Q nos Países Baixos (2007 - 2010), com os casos crescentes de 182 para mais de 2.000 por ano, se destaca como um exemplo da virulência grave deste patógeno5. A notável eficiência de infecções Coxiella é provável associada com a sua resistência ao estresse ambiental, combinada com a sua adaptação única para as células hospedeiras. Com efeito, Coxiella está presente no ambiente na forma de variantes de pequenas células metabolicamente inactivas (SCV), que são extremamente resistentes a várias condições adversas (dessecação, temperatura, etc.). VCEs são tomadas pelos células fagocíticas através α V β 3 integrinas 6 enquanto a invasão de células não fagocíticas é mediada pela adesão Coxiella / invasão OmpA 7 e um receptor ainda não identificado. Na sequência de captação, Coxiella reside em vacúolos apertadas, positivas para os marcadores endossomais primeiros Rab5 e EEA1 8. Bactérias responder aos endosomal acidificação através da conversão de grandes variantes de células metabolicamente ativas (VCL) e ativar um sistema Dot / Icm tipo 4 secreção (T4SS) 9, Altamente homóloga à de Legionella pneumophila 10. A secreção de effectors Dot / Icm permitir Coxiella para gerar um grande compartimento, LAMP1-positivo ácida contendo enzimas lisossomais activos onde as bactérias podem prosperar e ativamente protegem as células infectadas da apoptose 11. Assim, o ciclo intracelular de Coxiella é controlada pela translocação Dot / Icm-mediada de efectores bacterianas 12, no entanto, os factores microbianas envolvidas na invasão de célula hospedeira, a replicação bacteriana e a disseminação da infecção permanecem em grande parte desconhecida. A combinação de mutagénese de transposões e ensaios baseados em fluorescência, que estão a desenvolver abordagens imparciais para a identificação simultânea de factores bacterianos envolvidos nas principais etapas de infecções Coxiella: 1) internalização dentro das células hospedeiras, 2) replicação intracelular, 3) propagação de célula-a-célula , e 4) de persistência. Até à data, temos selecionados mais de 1.000 mutations em 500 sequências codificantes Coxiella, que nos forneceram com insights sem precedentes sobre as interações patógeno-hospedeiro que regulam Coxiella patogênese 7. De notar que esta abordagem pode ser aplicada ao estudo de outros agentes patogénicos intracelulares que compartilham características da biologia celular com Coxiella.

<table><tbody><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Iron sulfate</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax, without phenol red</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>For cell culture and infection</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>GE healthcare</td><td>SH30071</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Electroporation cuvette 0.1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; transformation</td></tr><tr><td>Trackmates screw top tubes with caps</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D barcoded screwcap</td></tr><tr><td>96-well microplate with black walls and bottom</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>96-well PCR microplate</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse free</td></tr><tr><td>96-well plate, deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; mutants infections</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>For single primer colony PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Anti-LAMP1 antibody</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence automated microscope Cellomics</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasão e colonização de células hospedeiras por agentes patogénicos bacterianos depender da actividade de um grande número de proteínas procarióticas, definida como factores de virulência, que pode subverter e manipular funções principais hospedeiras. O estudo das interações hospedeiro / agente patogénico é, portanto, extremamente importante compreender infecções bacterianas e desenvolver estratégias alternativas para combater as doenças infecciosas. Esta abordagem, no entanto, requer o desenvolvimento de novos ensaios de alto rendimento para a imparcial, identificação e caracterização automatizado de determinantes de virulência da bactéria. Aqui, nós descrevemos um método para a geração de uma biblioteca mutante marcadas com GFP através de mutagénese de transposões e o desenvolvimento de rastreio de alto conteúdo-abordagens para a identificação simultânea de vários fenótipos associada-transposões. O nosso modelo de trabalho é o agente patogénico bacteriano burnetii Coxiella intracelular, o agente etiológico da febre zoonose Q, que está associada com o SEvere surtos, com o consequente saúde e dos custos económicos. A natureza intracelular obrigatório deste patógeno, até recentemente, severamente prejudicado a identificação de fatores bacterianos envolvidos na interação patógeno anfitrião, fazendo de Coxiella o modelo ideal para a implementação de abordagens de alto rendimento / alto conteúdo.

Após o isolamento de mutantes por transposões, única colónia de iniciadores de PCR é um método robusto, de alto rendimento para identificar o local de inserção de transposões para cada mutante. Esta abordagem deriva de um protocolo típico de PCR aninhada, mas aqui uma única escorva híbrida especificamente e / ou não-especificamente ao ADN molde, dependendo da severidade da temperatura de emparelhamento (Figura 1A). Os produtos de PCR típicas consistem de vários fragmentos de DNA, a maioria dos quais são específicos (Figura 1B). O uso de um iniciador de sequenciação diferentes que emparelha direito a montante da ITR de transposões, e a jusante da sequência reconhecida pelo iniciador de amplificação fornece especificidade para o passo de sequenciação (Figura 1C). Automated software para análise da sequência alinha as sequências obtidas para o genoma Coxiella proporcionando o local exacto de inserções de transposões (Figura 1C). Todas as inserções de transposões pode ser, em seguida, Annotated no genoma Coxiella (Figura 1D). Cada mutante Coxiella é isolado e amplificado em culturas puras ACCM-2 antes ou meio de armazenamento ou de rastreio. A Figura 2 ilustra um exemplo de 38 mutantes por transposões em 16 pontos / genes Coxiella ICM (Figura 2A). Para avaliar a viabilidade de mutantes Coxiella, curvas de crescimento axénicos são obtidos por amostragem culturas bacterianas durante 7 dias após a inoculação e a aplicação do ensaio de concentração de bactérias descrito em 1.5 (Figurie 2B). Mutantes amplificados foram então incubadas com as células epiteliais, em triplicado em placas de 96 cavidades durante 7 dias. Todos os mutantes gerados Coxiella sendo marcado com GFP, as curvas de crescimento intracelulares são obtidos através da medição da intensidade de fluorescência da GFP de todos os poços, a cada 24 horas, e traçando os valores medidos como uma função do tempo (Figura 2C). IntrAs curvas de crescimento acelulares fornecer uma análise quantitativa dos fenótipos associados com cada inserção de transposão no genoma Coxiella. Para adicionar informações qualitativas sobre os mesmos mutantes por transposões, optamos por aquisição de imagem automatizada e análise. Sete dias após a infecção, as placas são fixos, processado por imunofluorescência como descrito em 4 e analisados ​​utilizando um sistema automatizado, microscópio de epifluorescência, conforme descrito no 5. automatizado software de análise de imagem, tais como CellProfiler (Instituto Broad, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) processa os canais adquiridos de forma independente e os segmentos identificados objectos de análise comparativa (Figura 3). Isto permite a identificação e caracterização morfológica dos núcleos de células hospedeiras, os contornos celulares, lisossomas e Coxiella colónias (Figura 3 painéis superiores). Correlacionando colônias Coxiella com células e permite que os lisossomos identificatie na análise morfológica específica de Coxiella vacúolos molecular contendo (que são LAMP1 positivo, a Figura 3 painel inferior esquerdo). Correlacionando colônias Coxiella com contornos célula hospedeira permite a identificação e análise morfológica específica de células infectadas (Figura 3 painel central inferior). Finalmente, os quatro canais são mesclados para fins de controle de qualidade e ilustração (Figura 3 painel inferior direito). Os dados obtidos a partir de análise de imagem automatizada pode ser representada graficamente contra o outro para se obter &quot;diagramas de dispersão de multi-fenotípicas&quot;. A título de exemplo, na Figura 4A a área média (em uM 2) de colónias Coxiella é representada em função do número de colónias por células (Figura 4A), a fim de identificar mutações que afectam a replicação intracelular de Coxiella (fenótipo de replicação) e / ou a capacidade das bactérias para invadir as células hospedeiras (internazação fenótipo). A análise estatística foi utilizado para definir as regiões no gráfico de dispersão resultante correspondendo a leve (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenótipos. Os mutantes foram observadas em três grupos principais: as mutações que resultaram em um crescimento intracelular defeituoso de Coxiella foram agrupados na parte mais à esquerda do gráfico (Figura 4A, rosa e pontos vermelhos); mutações que afetaram internalização Coxiella em células foram agrupados na parte inferior do gráfico (Figura 4A, luz e azul escuro pontos) e, finalmente, pontos verdes no mais à direita região da trama correspondem a mutações, resultando em fenótipos não-significativos ( Z-score&gt; -2). É importante ressaltar que os mutantes que não conseguem replicar, mas ainda são capazes de invadir as células hospedeiras, são detectados após 7 dias de infecção como bactérias individuais ou pequenas colónias adjacentes, para sediar núcleos celulares (Figura 4C, segundo painel). Assim, o tamanho de Coxiella &quot;Colosas &quot;será significativamente afectada, mas o número de células infectadas não irá variar, em comparação com as células infectadas pelo WT Coxiella. Pelo contrário, as mutações que afectam a capacidade de Coxiella de invadir células hospedeiras resultar numa diminuição do número de colónias / célula. Quando este número é significativamente inferior a 1, que indica que, em média, há uma diminuição no número total de células infectadas. Em alternativa, a área média (em uM 2) de colónias Coxiella pode ser registada em função do número de células hospedeiras sobreviventes infecção (Figura 4B), para identificar mutações que conferem citotoxicidade para Coxiella (fenótipo citotóxico). Como acima, a análise estatística foi utilizado para definir as regiões no gráfico de dispersão resultante correspondendo a leve (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenótipos. Mais rastreados mutações não afecta significativamente a sobrevivência das células, independentemente da replicação bacteriana dentro hospedeirocélulas (Figura 3B pontos verdes). 37 mutações sobrevivência da célula hospedeira levemente afetado (Figura 3B, pontos de luz vermelha), e 7 mutações foram particularmente prejudicial para sediar a sobrevivência das células (Figura 3B, pontos vermelho escuro). Por favor note que os parâmetros adicionais obtidos pelo processo automatizado de análise de imagem pode ser usada para derivar outras tabelas, de acordo com as necessidades experimentais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. A sequenciação e anotação dos mutantes por transposões Coxiella (A) colónia único iniciador de PCR é utilizado para amplificar fragmentos de DNA contendo o local de inserção de transposão. Um iniciador de amplificação (AMP) é utilizado tanto como um iniciador específico e não específico, dependendo da severidade da temperatura de recozimento. (B) resultado típico da única colónia de iniciadores de PCR. Cada Reactiem produz um número de fragmentos de tamanho variável, algumas das quais contêm o local de inserção do transposão; alguns outros, são amplificados ao acaso como subprodutos do ciclo de PCR de baixa restringência. (C) O uso de um iniciador de sequenciação (Seq) que hibrida com a sequência de transposões permite a sequenciação dos fragmentos de interesse. Software (D) A análise da seqüência permite a anotação automática de inserções de transposões no genoma bacteriano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Axenic e crescimento intracelular de Coxiella mutantes por transposões (A) Na tela de piloto, temos isolado, sequenciado e rastreados 38 mutantes por transposões em 16 g de núcleoenos o sistema de secreção de pontos / icm Coxiella (indicados a vermelho). (B) A fim de avaliar a viabilidade de cada mutante de transposão, o crescimento de cada isolado em meio de cultura axénica é monitorizado ao longo de 8 dias, utilizando um agente fluorescente intercalante com etiquetas de ADN. (C) Cada mutante é então utilizado para infectar as células epiteliais. Como o transposon possui uma cassete de GFP, o crescimento bacteriano intracelular é monitorado mais de 7 dias de infecção, seguindo as variações de fluorescência da GFP associada à replicação Coxiella, usando um leitor de microplacas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: automatizado de análise de imagem de infecções Coxiella Um auto.Acoplado microscópio de epifluorescência, é utilizado para a imagem 21 posições por poço em triplicado de placas de 96 poços. Os segmentos de software de análise de imagem objetos em cada canais adquiridos para a quantificação e análise. Em todos os casos, os objetos que tocam a fronteira das imagens são excluídos. (A) O canal Hoechst é usado para identificar os núcleos de células hospedeiras (circulado em verde). (B) Estes são utilizados como sementes para identificar os contornos da célula hospedeira no canal Cy3 (a posição dos núcleos é circulado em azul, contornos celulares estão em verde). (C) O canal Cy5 é usado para identificar os compartimentos LAMP1-positivo (circulado em verde); apenas os objetos incluídos nos contornos de células previamente identificadas (em vermelho) são retidas para análise de imagens. (D) O canal de GFP é utilizada para identificar colónias Coxiella (circulado em verde). (E) Correlacionando colônias Coxiella com compartimentos LAMP1-positivo permite a identificação de Coxiella </em&gt; vacúolos molecular contendo (CCVS); apenas os objetos incluídos nos contornos de células previamente identificadas (em verde) são retidas para análise de imagens. (F) correlacionar a colónias Coxiella com contornos celulares permite a identificação de células infectadas (pseudocolored). (G) Imagens adquiridos nos 4 canais de fluorescência (correspondendo a colônias Coxiella (verde), núcleos de células hospedeiras (azul), membrana plasmática da célula hospedeira (cinza), compartimentos LAMP1-positivo (vermelho)) são fundidas e usado para a ilustração e qualidade ao controle. Escala de barras 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: identificação em larga escala de fatores Coxiella envolvidas no host / interagem patógenoíons. (A) A área média (em mm 2) de colônias Coxiella é plotado contra o número relativo de colônias por célula, para identificar de replicação e de internalização fenótipos de interesse. Pontos verdes representam fenótipos que se afastam do WT Coxiella por um Z-score&gt; -2 (não significativa). Rosa e os pontos azuis representam luz de replicação e de internalização fenótipos respectivamente, com um escore Z entre -2 e -4 (fenótipos leves). Vermelho e pontos azuis escuras representam fenótipos com uma ≤ Z-score (-4 fenótipos fortes). (B) A área média (em uM 2) de colónias Coxiella foi representada graficamente em função do número total de células (infectados e não infectados) que sobreviveram 7 dias após a infecção para calcular o efeito citotóxico resultante de inserções de transposões. Pontos verdes representam fenótipos que se afastam do WT Coxiella por um Z-score&gt; -2 (não significativa). Pontos cor de rosa representam citotóxica phenotypes com um Z-score entre -2 e -4 (fenótipos leve). Pontos vermelhos representam fenótipos citotóxicos com uma ≤ Z-score (-4 fenótipos fortes). As setas indicam os mutantes ilustrados pela letra minúscula correspondente em C. (C) Imagens representativas de replicação, internalização e fenótipos citotóxicos. Em todos os casos, os núcleos de células hospedeiras estão em vermelho, Coxiella colónias estão a verde. Escala de barras de 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K visualizações.  Université Montpellier.  Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes. 

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Imunologia e Infecção

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medicina

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Avaliação visual e microscópica de Streptomyces mutantes do desenvolvimento

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

The Lambda Select cII Mutation Detection System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of these, transgenic mice and the Lambda (&#955;) Select cII Mutation Detection System have been employed for mutagenicity experiments by many research groups worldwide. Here, we describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay, which can be applied to cultured cells of transgenic mice/rats or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. The protocol consists of the following steps: (1) isolation of genomic DNA from the cells or organs/tissues of transgenic animals treated in vitro or in vivo, respectively, with a test compound; (2) recovery of the lambda shuttle vector carrying a mutational reporter gene (i.e., cII transgene) from the genomic DNA; (3) packaging of the rescued vectors into infectious bacteriophages; (4) infecting a host bacteria and culturing under selective conditions to allow propagation of the induced cII mutations; and (5) scoring the cII-mutants and DNA sequence analysis to determine the cII mutant frequency and mutation spectrum, respectively.

The Lambda Select cII Mutation Detection System

We describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. This approach has been widely used for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells.

O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

Abordagem genética de frente de células vivas para identificar e isolar mutantes do desenvolvimento em trachomatis de clamídia

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Geração de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de

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