This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

El estudio de las interacciones huésped / patógeno ha demostrado ser un método notable de entender infecciones bacterianas y desarrollar estrategias alternativas para contrarrestar las enfermedades infecciosas. Sin embargo, debido a la diversidad de estrategias elaboradas por diferentes patógenos bacterianos, la identificación y caracterización de factores de virulencia bacterianos y del huésped vías de señalización que están dirigidos durante las infecciones representan un verdadero desafío. Esto requiere el desarrollo de nuevos enfoques para la identificación a gran escala de los centros principales de interacción huésped / patógeno. El reciente desarrollo de innovadores, de alto rendimiento y técnicas de selección de alto contenido representa un recurso muy valioso que se puede adaptar al estudio de patógenos bacterianos intracelulares 15. En este caso, hemos utilizado el zoonótica bacteriana Coxiella burnetii patógeno como modelo para desarrollar enfoques de cribado que combinan mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia. Importantly, este método de cribado permite la monitorización simultánea de múltiples pasos del ciclo intracelular Coxiella, proporcionando una visión global de las estrategias desarrolladas por esta bacteria invadir, replicarse y persistir en las células infectadas. El método descrito aquí se basa en dos técnicas bien establecidas, mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia, que se han aplicado con éxito para el estudio de patógenos bacterianos. La combinación de estas técnicas en el contexto de las pantallas de alto rendimiento / alto contenido nos permite evaluar los efectos de un elevado número de mutaciones bacterianas mediante el análisis de un número muy elevado de eventos (típicamente 15.000 células infectadas por mutaciones bacterianas son fotografiados y analizados). Esto proporciona un importante análisis estadístico de eventos tales como la invasión bacteriana de las células huésped y la replicación intracelular, que son, por naturaleza, sujetos a una alta variabilidad. Es importante tener en cuenta que las líneas celulares distintas de epithelial se puede utilizar para este tipo de cribado. Sin embargo, las células epiteliales planas y grandes son óptimas para análisis de imagen como orgánulos de la célula huésped son más fáciles de detectar. Debido a que la mayoría de los microscopios automatizados puede manejar automáticamente un gran número de platos, prácticamente no hay límites para el número de mutantes que se proyectará simultáneamente. Dependiendo del patógeno, la lata usuario privilegio el uso de un epifluorescencia o un microscopio confocal. El tiempo de adquisición de la imagen dependerá sobre todo de la sensibilidad de la cámara microscopio, en el número de campos adquiridos por pocillo y en el número de canales adquiridos por campo de visión. El usuario puede decidir cómo ajustar estos factores para optimizar el protocolo de cribado. Como ejemplo, tenemos fotografiado uno de 96 pocillos placa / hr utilizando las condiciones indicadas en el punto 5.1. Análisis de la imagen depende en gran medida de la máquina (o grupo de máquinas) que se utiliza. Utilizamos un 12 núcleos (2 x 3.06 GHz 6-Core), estación de trabajo de RAM 48 GB. Esta máquina requiere aproximadamente 40 minutos para analizar las imágenes adquiridas de una placa. Un aspecto importante a tener en cuenta en el desarrollo de estos ensayos es la puesta en marcha de nuevo (o la optimización de los existentes) protocolos para permitir la manipulación y el procesamiento de un gran número de muestras. Un ejemplo típico es el desarrollo del enfoque de PCR colonia único cebador, lo que nos permitió amplificar rápidamente y fragmentos de ADN Coxiella secuencia que contienen el sitio de inserción de cada transposón, desde muestras muy pequeñas. Basándonos en nuestra experiencia, la alta fidelidad de la polimerasa tiene que ser cuidadosamente seleccionados y probados a fin de obtener resultados reproducibles. La única limitación de este enfoque puede ocultar en la observación de que, en la mayoría de los casos, aproximadamente el 30% de las muestras procesadas no son explotables, ya sea debido a la PCR o los pasos de secuenciación. Sin embargo, teniendo en cuenta que el aislamiento de nuevos mutantes de transposón Coxiella no es un paso limitante de la velocidad, esto no repreenviado un problema importante. Del mismo modo, el desarrollo de un ensayo fiable para cuantificar la concentración bacteriana de las poblaciones de mutantes ha sido clave para este enfoque. Debido a la tendencia de Coxiella a agregarse cuando en suspensión, el uso de lecturas de densidad óptica no es aplicable para calcular la concentración de las culturas Coxiella y la única alternativa existente era PCR cuantitativa (qPCR). Aquí, el uso de un agente de intercalación de ADN marcado con fluorescencia aceleró significativamente bacterias cuantificación. Este enfoque también puede tomar ventaja de la utilización de líneas celulares estables que expresan marcadores fluorescentes para varios compartimentos intracelulares dependiendo del patógeno utilizado. Otro aspecto importante es el uso de medios de cultivo celular exento de rojo de fenol. Hemos observado que este indicador de pH tiene una fluorescencia natural que abarca el espectro rojo y verde que satura la señal grabada en el lector de fluorescencia automatizado. Tél estrategia que aquí se presenta se basa en la mutagénesis de transposones azar. Para los mutantes de interés, se recomienda validar transposiciones únicos (y clonalidad) mediante Southern blot y PCR amplificaciones de la zona de inserción del transposón. Además de los equipos descritos en la sección de protocolo, equipos interesados ​​en utilizar el enfoque de selección que aquí se presenta, se llevarán una gran ventaja en la puesta en marcha de una base de datos relacional para la recopilación de datos, un servidor de almacenamiento de datos y una estación de trabajo para el análisis de imágenes rápida. Es importante destacar que el método aquí descrito es adecuado para el estudio de otros patógenos bacterianos intracelulares siempre que exista un método de mutagénesis aleatoria para el patógeno, las líneas celulares pueden ser infectadas por el patógeno y éste muestra un fenotipo específico durante la infección.

La bacteria Coxiella burnetii endémica emergente es responsable de grandes brotes de fiebre Q, una zoonosis parecida a la gripe debilitante con la salud graves e impacto económico 1. Los principales reservorios de Coxiella son animales domésticos y de granja, y se estima que más del 90% de las vacas lecheras en los EE.UU. llevar C. burnetii 2. Los seres humanos son huéspedes accidentales que están infectados por inhalación de aerosoles contaminados. Fiebre Q humano se manifiesta ya sea como una enfermedad aguda o crónica, que puede tener complicaciones fatales con una tasa de mortalidad de llegar a 65% de 1,3. Con una dosis infecciosa de 1 - 10 organismos, Coxiella es el patógeno más infecciosa conocida y ha sido investigado como un arma potencial bio 4. El reciente brote explosivo de la fiebre Q en los Países Bajos (2007 - 2010), con casos crecientes de 182 a más de 2.000 por año, se erige como un ejemplo de la severa virulencia de este patógeno5. La notable eficacia de infecciones Coxiella probablemente se asocie con su resistencia al estrés ambiental, combinado con su adaptación única a las células huésped. De hecho, Coxiella está presente en el medio ambiente en forma de pequeñas variantes metabólicamente inactivos celulares (SCV), que son notablemente resistentes a varias condiciones duras (desecación, temperatura, etc.). SCVs son hasta tomada por las células fagocíticas a través de α V β 3 integrinas 6 mientras que la invasión de células no fagocíticas está mediada por la Coxiella adhesión / invasión OmpA 7 y un receptor aún no identificado. Tras la absorción, Coxiella reside en vacuolas ajustados, positivos para los marcadores endosomales primeros Rab5 y EEA1 8. Las bacterias responden a la acidificación endosomal convirtiendo a las variantes de células grandes metabólicamente activas (LCV) y la activación de un sistema de secreción tipo 4 Dot / ICM (T4SS) 9, Altamente homóloga a la de Legionella pneumophila 10. La secreción de efectores Dot / ICM permite Coxiella para generar un compartimento ácida gran LAMP1-positivo que contiene enzimas lisosomales activos donde las bacterias pueden prosperar y proteger activamente las células infectadas de la apoptosis 11. Por lo tanto, el ciclo intracelular de Coxiella es controlado por la translocación mediada por Icm Dot / de efectores bacterianos 12, sin embargo, los factores microbianos implicados en la invasión de células huésped, la replicación bacteriana y la difusión de la infección siguen siendo en gran medida desconocido. Combinando mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia, estamos desarrollando métodos imparciales para la identificación simultánea de factores bacterianos implicados en los pasos principales de infecciones Coxiella: 1) la internalización en las células huésped, 2) la replicación intracelular, 3) de propagación de célula a célula y 4) la persistencia. Hasta la fecha, hemos proyectado más de 1.000 mutations en 500 secuencias Coxiella codificación, que nos proporcionaron conocimientos sin precedentes en las interacciones huésped-patógeno que regulan Coxiella patogénesis 7. De nota, este enfoque puede ser aplicado al estudio de otros patógenos intracelulares que comparten características de biología celular con Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

La invasión y la colonización de las células huésped por patógenos bacterianos dependen de la actividad de un gran número de proteínas procariotas, definido como factores de virulencia, que puede subvertir y manipular las funciones de acogida clave. El estudio de las interacciones huésped / patógeno tanto, es extremadamente importante comprender las infecciones bacterianas y desarrollar estrategias alternativas para hacer frente a las enfermedades infecciosas. Este enfoque, sin embargo, requiere el desarrollo de nuevos ensayos de alto rendimiento para el, la identificación automatizada imparcial y caracterización de determinantes de virulencia bacteriana. A continuación, describimos un método para la generación de una biblioteca mutante GFP-etiquetados por mutagénesis de transposones y el desarrollo de cribado de alto contenido de enfoques para la identificación simultánea de múltiples fenotipos transposón-asociado. Nuestro modelo de trabajo es la bacteriano patógeno intracelular Coxiella burnetii, el agente etiológico de la fiebre Q zoonosis, que se asocia con severe brotes con la consiguiente carga sanitaria y económica. La naturaleza intracelular obligado de este patógeno ha, hasta hace poco, obstaculizado gravemente la identificación de los factores bacterianos implicados en las interacciones de patógenos de acogida, por lo que de Coxiella el modelo ideal para la implementación de enfoques de alto rendimiento / alto-contenido.

Tras el aislamiento de mutantes de transposón, sola colonia cebador de PCR es un método robusto y de alto rendimiento para identificar el sitio de inserción del transposón para cada mutante. Este enfoque se deriva de un protocolo típico PCR anidada pero aquí un único cebador hibrida específicamente y / o no específicamente a la plantilla de ADN dependiendo de la rigurosidad de la temperatura de recocido (Figura 1A). Los productos típicos de PCR consisten en múltiples fragmentos de ADN, la mayoría de los cuales son específicos (Figura 1B). El uso de un cebador de secuenciación diferente que hibrida aguas arriba derecha de la ITR transposón, y aguas abajo de la secuencia reconocida por el cebador de amplificación proporciona especificidad para la etapa de secuenciación (Figura 1C). Software automatizado para el análisis de secuencias alinea las secuencias obtenidas en el genoma Coxiella proporcionar el sitio exacto del transposón inserciones (Figura 1C). Todas las inserciones de transposones pueden ser entonces annotated sobre el genoma Coxiella (Figura 1D). Cada mutante Coxiella se aísla y se amplifica axénicamente en ACCM-2 medio antes de su almacenamiento o de detección. La Figura 2 ilustra un ejemplo de 38 mutantes de transposón en 16 puntos / icm genes Coxiella (Figura 2A). Para evaluar la viabilidad de los mutantes de Coxiella, curvas de crecimiento axénicos se obtienen mediante el muestreo de cultivos bacterianos durante 7 días después de la inoculación y aplicando el ensayo de concentración bacteriana se describe en 1.5 (Figurie 2B). Mutantes amplificados se incuban a continuación con las células epiteliales, por triplicado en placas de 96 pocillos durante 7 días. Todos los mutantes generados Coxiella siendo GFP-etiquetados, las curvas de crecimiento intracelular se obtienen mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de GFP de cada pozo, cada 24 horas, y el trazado de los valores medidos como una función del tiempo (Figura 2C). Intrcurvas de crecimiento acelulares proporcionan un análisis cuantitativo de los fenotipos asociados con cada inserción del transposón en el genoma Coxiella. Para agregar información cualitativa sobre los mismos mutantes transposón, se optó por la adquisición de imágenes y análisis automatizado. Siete días después de la infección, las placas son fijos, procesado por inmunofluorescencia como se describe en 4 y se analizaron usando un microscopio de epifluorescencia automatizado como se describe en 5. automatizada de software de análisis de imágenes como CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) procesa los canales adquiridos independientemente y segmentos identificados objetos para el análisis comparativo (Figura 3). Esto permite la identificación y caracterización morfológica de núcleos de células huésped, los contornos de células, lisosomas y Coxiella colonias (Figura 3 paneles superiores). La correlación de colonias Coxiella con las células y permite que los lisosomas identificatiy el análisis morfológico específico de Coxiella vacuolas -Con (que son LAMP1 positivo, Figura 3 panel inferior izquierdo). La correlación de colonias Coxiella con contornos célula huésped permite la identificación y el análisis morfológico específico de las células infectadas (Figura 3 panel central inferior). Por último, los 4 canales se combinan para fines de control de calidad y la ilustración (Figura 3 panel de abajo a la derecha). Los datos obtenidos de análisis de imagen automatizado se pueden trazar uno contra el otro para obtener &quot;gráficos de dispersión multi-fenotípicos&quot;. Como ejemplo, en la Figura 4A, el área media (en m 2) de las colonias de Coxiella se representa gráficamente frente al número de colonias por célula (Figura 4A), con el fin de identificar mutaciones que afectan a la replicación intracelular de Coxiella (fenotipo de replicación) y / o la capacidad de las bacterias para invadir las células huésped (internafenotipo lización). Se utilizó el análisis estadístico para definir las regiones en el gráfico de dispersión resultante correspondiente a (-4 &lt;Z-score ≤ -2) y grave (Z-score ≤ -4) fenotipos leves. Se observaron mutantes en 3 grupos principales: mutaciones que dieron como resultado un crecimiento intracelular defectuosa de Coxiella fueron agrupados en la parte más a la izquierda de la parcela (Figura 4A, rosa y puntos rojos); mutaciones que afectaban internalización Coxiella en las células se agruparon en la parte inferior de la parcela (Figura 4A, azul claro y oscuro puntos) y, finalmente, puntos verdes en el extremo derecho de la región de la trama corresponden a mutaciones que resultan en fenotipos no significativas ( Z-score&gt; -2). Es importante destacar que los mutantes que no logran replicar, pero todavía son capaces de invadir las células huésped, se detectan después de 7 días de la infección como bacterias individuales o pequeñas colonias, junto a la sede de los núcleos celulares (Figura 4C, segundo panel). Por lo tanto, el tamaño de Coxiella &quot;coloempre- &quot;se verá afectado de manera significativa, pero el número de células infectadas no variará en comparación con las células infectadas WT Coxiella. Por el contrario, las mutaciones que afectan a la capacidad de Coxiella para invadir las células huésped resultan en una disminución en el número de colonias / célula. Cuando este número es significativamente inferior a 1, indica que, en promedio, hay una disminución en el número total de células infectadas. Alternativamente, el área media (en m 2) de las colonias de Coxiella puede registrarse en el número de células huésped sobrevivían a la infección (Figura 4B), para identificar mutaciones que confieren citotoxicidad para Coxiella (fenotipo citotóxico). Como el anterior, se utilizó el análisis estadístico para definir las regiones en el gráfico de dispersión resultante correspondiente a (-4 &lt;Z-score ≤ -2) y grave (Z-score ≤ -4) fenotipos leves. La mayoría examinados mutaciones no afectó significativamente la supervivencia celular, independientemente de la replicación bacteriana dentro de anfitrióncélulas (Figura 3B puntos verdes). 37 mutaciones supervivencia de la célula huésped ligeramente afectada (Figura 3B, puntos rojos de luz), y 7 mutaciones fueron particularmente perjudiciales para el anfitrión de la supervivencia celular (Figura 3B, puntos de color rojo oscuro). Tenga en cuenta que los parámetros adicionales obtenidos por el procedimiento de análisis de imágenes automatizado se pueden utilizar para derivar otros apartados, de acuerdo a las necesidades experimentales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Secuenciación y anotación de los mutantes de transposón Coxiella (A) sola colonia cebador de PCR se utiliza para amplificar fragmentos de ADN que contienen el sitio de inserción del transposón. Un cebador de amplificación (Amp) se utiliza tanto como un cebador específico y no específico dependiendo de la rigurosidad de la temperatura de recocido. (B) Resultado Típico de colonia única cebador de PCR. Cada Reactien produce una serie de fragmentos de tamaño variable, algunos de los cuales contienen el sitio de inserción del transposón; algunos otros son amplificadas al azar como subproductos del ciclo de PCR de baja rigurosidad. (C) El uso de un cebador de secuenciación (SEC) que se hibrida con la secuencia de transposón permite la secuenciación de los fragmentos de interés. Software (D) Análisis de secuencias permite la anotación automática de transposón inserciones en el genoma bacteriano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Axénicas y crecimiento intracelular de mutantes transposón Coxiella (A) En la pantalla del piloto, hemos aislado, secuenciado y apantallado 38 mutantes transposón en 16 g núcleoenes del sistema de secreción dot / icm Coxiella (indican en rojo). (B) A fin de evaluar la viabilidad de cada mutante de transposón, el crecimiento de cada aislamiento en medio de cultivo axénicos se monitoriza durante 8 días utilizando un marcado con fluorescencia agente de intercalación de ADN. (C) Cada mutante se utiliza entonces para infectar a las células epiteliales. A medida que el transposón posee un cassette GFP, el crecimiento de bacterias intracelulares se controla más de 7 días de la infección siguiendo las variaciones de la fluorescencia de GFP asociada con la replicación Coxiella, utilizando un lector de microplacas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: automatizado de análisis de imágenes de infecciones Coxiella Un auto.microscopio de epifluorescencia acoplado se utiliza para la imagen 21 posiciones por pocillo por triplicado de placas de 96 pocillos. Los segmentos de software de análisis de imágenes de objetos en cada uno de los canales adquiridos para la cuantificación y el análisis. En todos los casos, se excluyen los objetos que tocan la frontera de las imágenes. (A) El canal de Hoechst se utiliza para identificar los núcleos de la célula huésped (en el círculo en verde). (B) Estos son utilizados como semillas para identificar los contornos de la célula huésped en el canal de Cy3 (la posición de los núcleos es un círculo en azul, los contornos celulares están en verde). (C) El canal de Cy5 se utiliza para identificar compartimentos LÁMPARA1-positivo (un círculo en verde); Sólo los objetos incluidos en los contornos celulares previamente identificados (en rojo) se conservan para el análisis de imágenes. (D) El canal de GFP se utiliza para identificar colonias Coxiella (en el círculo en verde). (E) correlacionar colonias Coxiella con compartimentos LÁMPARA1-positivo permite la identificación de Coxiella </em&gt; vacuolas -Con (CCV); Sólo los objetos incluidos en los contornos celulares previamente identificados (en verde) se conservan para el análisis de imágenes. (F) correlacionar colonias Coxiella con contornos celulares permite la identificación de células infectadas (pseudocoloreada). (G) Imágenes adquiridas en los 4 canales de fluorescencia (que corresponde a las colonias Coxiella (verde), núcleos de las células huésped (azul), membrana plasmática de la célula huésped (gris), compartimentos LÁMPARA1-positivo (rojo)) se fusionan y se utiliza para la ilustración y la calidad control. Escala de Barras 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: la identificación a gran escala de los factores que intervienen en Coxiella huésped / patógeno interactúaniones. (A) La zona media (en m 2) de las colonias de Coxiella se traza contra el número relativo de colonias por células, para identificar de replicación y de internalización fenotipos de interés. Los puntos verdes representan fenotipos que se desvían de WT Coxiella por un Z-score&gt; -2 (no significativo). Rosa y puntos azules claros representan replicación y de internalización fenotipos respectivamente, con una puntuación Z entre -2 y -4 (fenotipos leves). Puntos azules oscuros Roja y representan fenotipos con un Z-score ≤ -4 (fenotipos fuertes). (B) El área media (en m 2) de las colonias de Coxiella se representó frente al número total de células (infectadas y no infectadas) que sobrevivieron 7 días de la infección para estimar el efecto citotóxico resultante de las inserciones de transposones. Los puntos verdes representan fenotipos que se desvían de WT Coxiella por un Z-score&gt; -2 (no significativo). Los puntos rosados ​​representan ph citotóxicaenotypes con una puntuación Z entre -2 y -4 (fenotipos leves). Los puntos rojos representan fenotipos citotóxicos con un Z-score ≤ -4 (fenotipos fuertes). Las flechas indican mutantes ilustrados por la letra minúscula correspondiente en C. (C) Imágenes representativas de la replicación, la internalización y fenotipos citotóxicos. En todos los casos, los núcleos de células huésped están en rojo, Coxiella colonias son de color verde. Escala de Barras 50 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K vistas.  Université Montpellier.  Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes. 

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Investigación

Inmunología e Infección

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Uso de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; La mutagénesis mediada por transposón Mariner

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Evaluación visual y microscópica de mutantes desarrollo de Streptomyces

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...