Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

호스트 / 병원균 상호 작용의 연구는 세균 감염을 이해하고 전염성 질환에 대응하기 위해 대체 전략을 개발하는 놀라운 방법이 될 입증되었습니다. 그러나, 다른 병원성 세균에 의해 정교 전략의 다양성, 박테리아 독성 인자의 감염시 타겟팅 신호 경로 호스트의 식별 및 특성은 실제 도전을 나타낸다. 이것은 키 호스트 / 병원균 작용 허브 대규모 식별 새로운 접근법의 개발을 요구한다. 혁신적인, 높은 처리량과 높은 콘텐츠 스크리닝 기법의 최근의 개발은 세포 내 박테리아 병원균 (15)의 연구에 적용 할 수있는 귀중한 자원을 나타낸다. 여기서는 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석을 결합 스크리닝 방법을 개발하는 모델로 인수 공통 세균성 병원체 Coxiella burnetii에 사용 하였다. ImportanTLY이 스크리닝 방법은, 침략 복제하고 감염된 세포 내에서 유지하기 위해이 세균에 의해 개발 된 전략 개요를 제공하는 글로벌, Coxiella 세포주기의 여러 단계의 동시 모니터링을 허용한다. 여기에 설명 된 접근법을 성공적 세균성 병원균의 연구에 적용되어 두 개의 잘 확립 된 기법, 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석에 기초한다. 높은 처리량 / 높은 컨텐츠 화면의 문맥에서 이들 기술을 조합하면 우리는 이벤트의 매우 높은 번호 (세균의 돌연변이 당 전형적으로 15,000 감염된 세포 영상화 및 분석한다)를 분석함으로써 세균의 돌연변이 높은 수의 효과를 평가할 수있다. 이것은, 자연, 높은 변동 될 수 있습니다 숙주 세포 및 세포 내 복제의 세균 침입으로 사건의 중요한 통계 분석을 제공합니다. 이 EP 이외의 해당 셀 라인을 주목하는 것이 중요하다ithelial은이 유형의 스크리닝에 사용될 수있다. 숙주 세포 소기관 감지하기 쉽다 그러나, 편평 상피 세포 및 대형 이미지 분석을 위해 최적이다. 자동화 현미경의 대부분이 자동 판의 다수를 처리 할 수​​ 있기 때문에, 동시에 스크리닝 할 수있는 돌연변이의 수를 실질적으로 제한이 없다. 병원체에 따라 사용자 캔 특권 또는 표면 형광 공 초점 현미경의 사용. 화상 취득의 시간은 주로 웰 당 시야 당 획득 채널 수에 취득 된 필드의 수에, 현미경 카메라의 감도에 의존 할 것이다. 사용자는 선별 프로토콜을 최적화하기 위해 이러한 인자를 조절하는 방법을 결정할 수있다. 예로서, 우리는 5.1 포인트로 지시 한 조건을 이용하여 96 웰 플레이트 / 시간을 묘화. 이미지 분석은 주로 사용되는 기계 (또는 기계 클러스터)에 따라 달라집니다. 우리는 12 코어 (2 × 3.06 GHz의 6 코어) 48 기가 바이트 RAM의 워크 스테이션을 사용합니다. 이 기계는 approxi이 필요합니다후면부로 40 분 한 판에서 획득 된 영상을 분석합니다. 이러한 분석법을 개발하는 새로운 세트 업 (또는 기존의 최적화) 샘플들의 다수의 조작 및 처리를 허용하는 프로토콜 인 경우 중요한 측면이 고려되어야한다. 전형적인 예는 우리가 급속 증폭을 허용 단일 콜로니 PCR 프라이머 접근법의 개발은 매우 작은 샘플들로부터, 각각의 트랜스포존의 삽입 위치를 포함하는 서열 Coxiella DNA 단편. 우리의 경험에 기초하여, 고성능 폴리머 엄선하고 재현 가능한 결과를 수득하기 위해 테스트되어야한다. 이 방법의 유일한 제한은, 대부분의 경우에, 처리 된 샘플의 약 30 %가 악용되지 않으며, 관측 PCR 또는 서열 분석에 의한 단계를 숨길 수있다. 그러나, 새로운 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 체의 분리가 속도 - 제한 단계가 아님을 고려하면, 이는 파트 : 않는다주요 문제를 보냈습니다. 마찬가지로, 돌연변이 주식의 세균 농도를 정량화 할 수있는 신뢰할 수있는 분석의 개발이 방법의 핵심이었다. 서스펜션의 집계 Coxiella의 경향으로 인해, 광학 밀도 수치를 사용했다 Coxiella의 문화와 만 기존 대안의 농도 정량 PCR (qPCR에)을 계산하기 위해 적용 할 수 없습니다. 여기서, 형광 태그 DNA에 인터 제의 사용은 크게 박테리아 정량을 가속화. 이 접근법은 또한 사용될 병원체에 따라 여러 가지 세포 내 구획 용 형광 마커를 발현하는 안정한 세포주의 사용을 활용할 수있다. 또 다른 중요한 측면은 페놀 레드없는 세포 배양 배지의 사용이다. 우리는이 산도 표시등이 자동 형광 판독기에 기록 된 신호를 포화 빨간색과 녹색 스펙트럼에 걸쳐 자연 형광을 가지고 관찰했다. 티그는 여기에 제시된 전략은 임의 트랜스포존 돌연변이 유발에 의존한다. 관심의 돌연변이를 들어, 우리는 남부 얼룩과 트랜스포존 삽입 부위의 PCR의 증폭을 사용하여 고유의 트랜스 포지션의 유효성을 검사 (및 clonality) 좋습니다. 프로토콜 절에 설명 된 장치 외에, 여기에 제시된 스크리닝 방법을 사용하고자 팀, 데이터 수집, 데이터 저장을위한 서버 및 신속한 화상 분석 워크 스테이션 관계형 데이터베이스의 셋업에서 큰 장점을 취할 것이다. 중요한 것은, 여기에 다른 세포 내 세균 병원균의 연구를 위해 적합하다 기재된 방법은 무작위 돌연변이 유발 법은 병원체 존재 제공 세포주 병원체에 의해 감염 될 수 있으며,이 중 하나는 감염시 특정 표현형을 표시한다.

신흥, 풍토 박테리아 Coxiella burnetii는 Q의 발열, 심한 건강과 경제에 미치는 영향 1 쇠약 독감 등 인수 공통 질병의 대규모 발생에 대한 책임이 있습니다. Coxiella의 주요 저수지 국내 및 농장 동물, 이는 US의 젖소의 90 % 이상을 가지고 C. 것으로 추정되고 2 burnetii. 인간은 오염 된 에어로졸의 흡입에 의해 감염 우발적 호스트입니다. 인간의 Q 열이 명단 중 65 % 1,3에 도달 사망률과 치명적인 합병증을 가질 수있는 급성 또는 만성 질환, 등. (1)의 감염 복용량 - 10 생물, Coxiella 알려진 가장 전염성 병원체이며, 그것은 잠재적 인 생물 무기 (4)로 조사되었다. 네덜란드 (2,007에서 2,010 사이)에서 Q 열병의 최근 폭발 발생의 경우 연간 2,000에 182에서 확대와 함께,이 병원균의 심각한 독성의 예를 들어 서5. Coxiella 감염의 놀라운 효율은 가능성이 세포를 호스트하는 독특한 적응과 함께 환경 스트레스에 대한 저항과 관련이있다. 실제로, Coxiella 여러 가혹한 조건 (탈수, 온도 등)에 대한 내성이 현저하게 대사 비활성 소세포 변이체 (SCV) 형태의 환경에 존재한다. 비 식세포의 침윤이 Coxiella 접착 / 침입하는 OmpA 7 아직 미확인 수용체에 의해 매개되는 동안 SCVs 최대 3 인테그린 6 β α의 V를 통해 식세포에 의해 촬영된다. 흡수 후, Coxiella은 Rab5 및 EEA1 8 초기 엔도 좀 마커에 대한 긍정적 인 꽉 끼는 액포,에 있습니다. 박테리아는 도트 / ICM 4 형 분비 시스템 (T4SS) (9) 대사 활성 대 세포 변형 (상용차)로 변환하고 활성화하여 엔도 좀의 산성화에 응답, 레지오넬라 뉴모 필라 (10)의 고도로 상동. 도트 / ICM 이펙터의 분비 Coxiella 박테리아가 번성하고 적극적 아폽토시스 11에서 감염된 세포를 보호 할 수있는 활성 리소좀 효소를 포함하는 대형 LAMP1 양성 산성 칸을 생성 할 수있다. 따라서, Coxiella의 세포주기 세균성 이펙터 (12)의 도트 / ICM 매개 전위에 의해 제어된다, 그러나, 숙주 세포 침윤, 박테리아 복제 및 감염의 보급에 관련된 미생물의 미지의 요인이 크게 남아있다. 숙주 세포 내에서 1) 내재화, 2) 세포 내 복제, 3) 셀 간 전파 : 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석을 결합하여, 우리는 Coxiella 감염의 주요 단계에 관여하는 박테리아 인자의 동시 식별 공평 접근법을 개발 및 4) 지속성. 지금까지 우리는 1,000m에 걸쳐 상영 한Coxiella의 병인 (7)을 조절 호스트 병원체 상호 작용에 대한 전례없는 통찰력으로 우리를 제공하는 500 Coxiella 코딩 시퀀스에서 utations. 참고로,이 접근법은 Coxiella으로 세포 생물학 기능을 공유하는 다른 세포 내 병원체의 연구에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Iron sulfate</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax, without phenol red</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>For cell culture and infection</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>GE healthcare</td><td>SH30071</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Electroporation cuvette 0.1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; transformation</td></tr><tr><td>Trackmates screw top tubes with caps</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D barcoded screwcap</td></tr><tr><td>96-well microplate with black walls and bottom</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>96-well PCR microplate</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse free</td></tr><tr><td>96-well plate, deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; mutants infections</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>For single primer colony PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Anti-LAMP1 antibody</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence automated microscope Cellomics</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

내습 및 세균성 병원균에 의한 숙주 세포의 콜로니가 파괴 및 키 호스트 기능을 조작 할 수있는 독성으로 정의 원핵 인자 단백질의 다수의 활성에 의존한다. 호스트 / 병원균 상호 작용의 연구는 세균 감염을 이해하고 전염성 질환에 대응하기 위해 대체 전략을 개발하는 것이 매우 중요하다. 이 방법은 그러나, 세균 독성 결정의 편견, 자동 식별 및 특성화를위한 새로운 높은 처리량 분석의 개발이 필요합니다. 여기서는 트랜스포존 돌연변이 유발에 의해 GFP 표지 된 돌연변이 체 라이브러리를 생성하는 방법을 설명하고 높은 콘텐츠 스크리닝의 개발은 여러 트랜스포존 관련 표현형의 동시 식별에 접근한다. 우리의 작업은 SE 모델과 연관된 세포 내 세균 병원체 Coxiella burnetii의, Q의 동물 원성 감염증의 발열 병인 에이전트이며베르는 필연적 건강과 경제적 부담으로 발병이. 이 병원균의 의무적 세포 내 성격은, 최근까지 심각한 Coxiella의 높은 처리량 / 높은 콘텐츠 접근 방식의 구현을위한 이상적인 모델을 만들고, 호스트 병원체 상호 작용에 관여하는 세균 요인의 식별을 방해하고있다.

트랜스포존 돌연변이 체의 분리 후, 단일 콜로니 PCR 프라이머는 각 변이체에 대한 트랜스포존 삽입 부위를 식별하기 위해 강력하고 높은 처리량 방법이다. 이 접근법은 전형적인 중첩 PCR 프로토콜에서 유래하지만 여기에 단일 프라이머 어닐링 온도 (도 1a)의 엄격함에 따라 주형 DNA에 특이 적 및 / 또는 비 - 특이 적 혼성화. 전형적인 PCR 제품 고유 대부분 여러 DNA 단편 (도 1b)로 구성된다. 오른쪽 트랜스포존 ITR의 상류 및 증폭 프라이머에 의해 인식 서열의 하류 어닐링 다른 시퀀싱 프라이머의 사용은 시퀀싱 공정 (도 1C)에 대한 특이성을 제공한다. 서열 분석을위한 자동화 된 소프트웨어는 트랜스포존 삽입 (도 1C)의 정확한 위치를 제공 Coxiella 게놈에 얻어진 서열 정렬. 모든 트랜스포존 삽입은 앤 될 수 있습니다Coxiella 게놈 (그림 1D)에 otated. 각 Coxiella 돌연변이 격리 및 저장 중 또는 스크리닝 이전 ACCM -2- axenically 배지에서 증폭된다.이 16 도트 / ICM Coxiella 유전자 (도 2A)에서 38 트랜스포존 돌연변이의 예를 도시한다. Coxiella 돌연변이의 생존력을 평가하기 위해, 무균 성장 곡선은 1.5 (Figurie 2B)에 기재된 세균 농도 분석을 접종 후 7 일간 배양 박테리아를 샘플링하고 적용함으로써 얻어진다. 증폭 된 돌연변이 후 7 일간 중으로 96- 웰 플레이트에서, 상피 세포와 함께 배양한다. 생성 된 모든 Coxiella 돌연변이 GFP 표지 된 세포 내 성장 곡선은 물론, 매 24 시간을 매의 GFP의 형광 강도를 측정하고, 시간의 함수 (도 2C)로 측정 값을 플로팅하여 수득된다. INTR무 세포 성장 곡선 Coxiella 게놈의 모든 트랜스포존 삽입과 관련된 표현형의 정량 분석을 제공한다. 같은 트랜스포존 돌연변이에 대한 질적 정보를 추가하기 위해, 우리는 자동화 된 이미지 수집 및 분석을 선택했다. 이레는 매 4에 기재된 그러한 CellProfiler (넓음 연구소 5. 자동화 된 이미지 분석 소프트웨어에 기재된 자동화 표면 형광 현미경을 이용하여 분석으로 면역을 위해 처리, 고정, 게시물 감염 <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com를</a> 취득 채널을 처리) 독립적으로 세그먼트 비교 분석 (그림 3)에 대한 개체를 확인했다. 이 숙주 세포의 핵, 세포 윤곽, 리소좀과 Coxiella 식민지 (그림 3 상단 패널)의 식별 및 형태 학적 특성을 수 있습니다. 세포와 리소좀으로 Coxiella 식민지 상호 연계 identificati 수 있습니다에와 (긍정적 램프 1, 그림 3 왼쪽 하단 패널입니다) Coxiella 함유 액포의 특정 형태 학적 분석. 숙주 세포의 윤곽과 Coxiella 식민지를 상호 연계하는 식별 및 감염된 세포의 특정 형태 학적 분석 (그림 3 하단 중앙 패널을) 할 수 있습니다. 마지막으로, 4 채널은 그림과 품질 관리 목적으로 (그림 3 오른쪽 아래 패널)에 대한 병합됩니다. 자동화 된 이미지 분석에서 얻은 정보는 &quot;다중 표현형 산포도&quot;를 얻기 위해 서로에 대해 도시 될 수있다. 예로서, Coxiella 콜로니도 4a (μm의 2)의 평균 면적에 Coxiella (복제 표현형) 및 / 또는 세포 복제에 영향을주는 돌연변이를 확인하기 위해, 세포 (도 4a) 당 콜로니의 수에 대해 플롯 숙주 세포에 침입하는 세균의 용량 (INTERNA사용 효율 표현형). 통계 분석은 경증 (-4 &lt;Z 점수 ≤ -2) 및 중증 (Z 점수 ≤ -4) 표현형에 해당하는 결과 산포도의 영역을 정의하는 데 사용되었다. 돌연변이는 3 주 클러스터에서 관찰되었다 : Coxiella의 결함이있는 세포 내 성장의 결과 돌연변이가 플롯 (그림 4A, 핑크와 레드 도트)의 가장 왼쪽 부분에 그룹화 하였다 세포에서 Coxiella의 국제화에 영향을 돌연변이가 플롯의 하단 부분에 그룹화되었다 (그림 4a는, 빛과 어둠 파란색 점) 그리고 마지막으로, 플롯의 가장 오른쪽 지역에서 녹색 점 (비 상당한 표현형의 결과 돌연변이에 해당 Z 점수&gt; -2). 중요한 것은, 복제에 실패하지만 여전히 숙주 세포에 침입 할 수있는 돌연변이, 세포 핵 (그림 4C, 두 번째 패널) 호스트에 인접한 단일 박테리아, 또는 작은 식민지, 같은 감염 7 일 후에 검출된다. 따라서, Coxiella의 크기 &quot;콜로가 다진 &quot;가 크게 영향을 받게되지만 감염된 세포의 수는 WT Coxiella -infected 세포에 비해 차이가없는 것이다. 반면에, 숙주 세포에 침입 할 Coxiella의 용량에 영향을주는 돌연변이 콜로니 / 셀의 수의 감소를 초래한다. 이 값이 1보다 크게 될 때, 평균적으로, 감염된 세포의 총 수가 감소가 있음을 나타낸다. 대안 적으로, Coxiella 콜로니 (μm의 2)의 평균 면적은 Coxiella (세포 독성 표현형)에 세포 독성을 부여하는 돌연변이를 식별 감염 (도 4b)에 생존하는 숙주 세포의 수에 대해 도시 될 수있다. 상기와 같이, 통계 분석은 가벼운 (-4 &lt;Z 점수 ≤ -2) 및 중증 (Z 점수 ≤ -4) 표현형에 해당하는 결과 산포도에서 영역을 정의하는 데 사용되었다. 대부분의 돌연변이가 크게 숙주 박테리아 내에서 복제에 관계없이, 세포 생존에 영향을 미치지 않았다 스크리닝세포 (그림 3B 녹색 점). (37) 돌연변이 약간 영향을받는 숙주 세포의 생존 (그림 3B, 밝은 적색 점), 7 돌연변이는 세포 생존 (그림 3B, 어두운 붉은 점) 호스트 특히 해로운했다. 실험의 필요에 따라, 자동 화상 분석 방법에 의해 얻어진 부가적인 파라미터가 다른 차트를 유도하는데 이용 될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> 그림 1. 시퀀싱 및 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 주석 (A) 단일 콜로니 PCR 프라이머는 트랜스포존 삽입 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위해 사용된다. 증폭 프라이머 (앰프)를 어닐링 온도의 엄격도에 따라 특정 및 불특정 프라이머 모두를 사용한다. (B) 하나의 프라이머 식민지 PCR의 전형적인 결과. 각각의를 ReactiON은 트랜스포존 삽입 부위를 포함하는 일부는 가변 크기의 단편의 개수를 생성한다; 일부 다른 무작위 부산물 낮은 엄격 PCR 사이클로 증폭된다. (C) 트랜스 포슨 서열에 혼성화 시퀀싱 프라이머 (서열)의 사용은 관심의 단편의 서열 분석을 허용한다. (D) 서열 분석 소프트웨어는 세균 게놈에 트랜스포존 삽입의 자동 주석을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> 그림 2. 무균 및 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 체의 세포 성장 (A)의 파일럿 화면에서, 우리는 16 코어 38 g 트랜스포존 돌연변이 염기 서열을 단리시키고, 스크리닝 한Coxiella 점 / ICM 분비 시스템의 ENES는 (빨간색 표시). 각 트랜스포존 돌연변이의 생존력을 평가하기 위해, (B), 각각의 성장은 무균 배지에서 분리가이 형광 DNA에 인터 에이전트를 이용하여 태그 팔일 통해 모니터링된다. (C) 각 돌연변이 후 상피 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 트랜스포존은 GFP 카세트를 가지고로서, 세포 내 세균의 성장은 마이크로 플레이트 리더를 사용하여, Coxiella 복제와 관련된 GFP의 형광의 변화에 따라 감염의 7 일 이상을 모니터링합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> 그림 3 : Coxiella 감염의 자동화 된 이미지 분석 자동.메이트 표면 형광 현미경 이미지를 삼중으로 96 웰 플레이트의 웰 당 21의 위치를​​ 사용한다. 이미지 분석 소프트웨어 세그먼트 정량 분석​​을 위해 각 채널에서 오브젝트를 취득. 모든 경우에, 이미지의 경계를 터치 물체는 제외된다. (A) 훽스트 채널 (녹색 동그라미) 숙주 세포의 핵을 식별하는 데 사용된다. (B) 이들 채널을 Cy3에서 숙주 세포의 윤곽을 파악하기 위해 시드로서 사용되는이 (핵의 위치를 파란색으로 선회되어, 셀 등고선은 녹색이다). (C) Cy5의 채널 LAMP1 양성 구획을 식별하는 데 사용된다 (녹색 원); 만 (빨간색) 이전에 확인 된 세포 윤곽에 포함 된 객체는 이미지 분석을 위해 유지됩니다. (D) 채널은 GFP (녹색 동그라미) Coxiella 콜로니를 식별하는 데 사용된다. (E)는 램프 1 양성 구획으로 Coxiella 식민지 상호 연계하는 것은 Coxiella의 식별을 할 수 있습니다 </em&gt; 함유 액포 (CCVS); 만 (녹색) 이전에 확인 된 세포 윤곽에 포함 된 객체는 이미지 분석을 위해 유지됩니다. 세포 윤곽으로 Coxiella 식민지의 상관 관계 (F)는 감염된 세포 (모조 착색)의 식별을 할 수 있습니다. 4 형광 채널에서 획득 한 (G) 사진 (Coxiella 콜로니 (녹색), 숙주 세포의 핵 (파란색), 숙주 세포의 원형질막 (회색) LAMP1 양성 구획 (적색)에 대응하는) 병합 및 그림 품질을 위해 사용된다 제어 할 수 있습니다. 규모는 10 μm의 바. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> 도 4 : 호스트에 관여 Coxiella 인자 대규모 성분 / 병원균 인터랙트이온. (A) Coxiella 콜로니 (2 μm의) 세포 당 콜로니의 상대적인 수에 대해 플롯 팅 평균 면적은, 관심 복제 및 내재화 표현형 동정을 행 하였다. 녹색 점은 Z 점수&gt; -2 (중요하지 않음)에 의해 WT Coxiella에서 벗어나는 표현형을 나타낸다. 핑크와 밝은 파란색 점 -2 -4 (가벼운 표현형) 사이의 Z 점수로, 각각 복제 및 내재화 표현형을 나타냅니다. 빨간색과 진한 파란색 점은 Z-점수 ≤ -4 (강한 표현형)과 표현형을 나타냅니다. Coxiella 콜로니 (B) (2 μm의) 평균 면적은 트랜스포존의 삽입에 의한 세포 독성 효과를 추정하기 위해 감염 후 7 일 살아남은 세포 (감염과 감염되지 않은)의 총 수에 대해 도시 하였다. 녹색 점은 Z 점수&gt; -2 (중요하지 않음)에 의해 WT Coxiella에서 벗어나는 표현형을 나타낸다. 핑크 도트는 세포 독성 산도를 나타내는-2 -4 (가벼운 표현형) 사이의 Z-점수 enotypes. 빨간 점은 Z-점수 ≤ -4 (강한 표현형)와 세포 독성 표현형을 나타냅니다. 화살표 (C) (C)에 대응하는 소문자에 의해 설명 돌연변이 복제, 국제화 및 세포 독성 표현형의 대표 이미지를 나타냅니다. 모든 경우에있어서, 숙주 세포의 핵이 적색이고, Coxiella 콜로니는 녹색이다. 규모는 50 μm의 바. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii의는 인수 공통 질병 Q 열병에 대한 책임 의무적 세포 내 그람 음성 세균이다. 여기에서 우리는 Coxiella 형광 트랜스포존 돌연변이의 발생뿐만 아니라 자동 식별 및 결과 국제화, 복제 및 세포 독성 표현형의 분석 방법을 설명합니다.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.8K 조회수.  Université Montpellier.  Coxiella burnetii의는 인수 공통 질병 Q 열병에 대한 책임 의무적 세포 내 그람 음성 세균이다. 여기에서 우리는 Coxiella 형광 트랜스포존 돌연변이의 발생뿐만 아니라 자동 식별 및 결과 국제화, 복제 및 세포 독성 표현형의 분석 방법을 설명합니다. 

비디오: Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

연구

면역학 및 감염병학

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

의학

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

체외 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지 의 모든 생애주기 단계에 대한 약물 스크리닝

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

생화학

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

생물학

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

생성<em&gt; 엔테로 박터</em&gt; SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터