This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן הוכיח להיות שיטה יוצאת דופן כדי להבין בזיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. עם זאת, בשל המגוון של אסטרטגיות הרחיבו על ידי חיידקים פתוגנים שונה, זיהוי והאפיון של גורמים ארסי חיידקים ושל מארח מסלולי איתות שממוקדים בזיהומים מייצגים אתגר אמיתי. זה קורא לפיתוח גישות החדשות לזיהוי בקנה מידה גדולה של רכזות אינטראקציה המארח / פתוגן מפתח. הפיתוח האחרון של, תפוקה גבוהה חדשנית וטכניקות הקרנה גבוהות תוכן מייצג משאב יקר שיכול להיות מותאם למחקר של חיידקים פתוגנים תאית 15. הנה, יש לנו בשימוש burnetii Coxiella פתוגן חיידקי zoonotic כמודל לפיתוח גישות הקרנה המשלבות mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת. Importantly, שיטת הקרנה זו מאפשרת ניטור סימולטני של שלבים מרובים של המחזור תאיים Coxiella, מתן סקירה עולמית של האסטרטגיות שפותחו על ידי חיידק זה לפלוש, לשכפל ולהתמיד בתאים נגועים. הגישה המתוארת כאן מבוססת על שתי טכניקות מבוססות היטב, mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוסס, שיושמו בהצלחה למחקר של חיידקים פתוגנים. שילוב טכניקות אלה בהקשר של מסכי תפוקה גבוהה / גבוה תוכן מאפשר לנו להעריך את ההשפעות של מספר גבוה של מוטציות חיידקים על ידי ניתוח מספר גבוה מאוד של אירועים (בדרך כלל 15,000 תאים נגועים למוטציות חיידקים הם צילמו וניתחו). זה מספק ניתוח סטטיסטי חשוב של אירועים כגון פלישת חיידקים של תאי מארח ושכפול תאיים, שהם, על ידי הטבע, כפופים לשונות גבוהות. חשוב לציין כי שורות תאים אחרות מאשר EPithelial יכול לשמש לסוג זה של הקרנה. עם זאת, תאי האפיתל שטוחים וגדולים הם אופטימליים לניתוח תמונה כאברונים תא המארח הם קלים יותר לזהות. מכיוון שרוב המיקרוסקופים אוטומטיים באופן אוטומטי יכול להתמודד עם מספר רב של צלחות, יש כמעט אין גבול למספר מוטציות שיכולות להיות מוקרן בו זמנית. בהתאם לפתוגן, זכות פחית משתמשים השימוש בepifluorescence או מיקרוסקופ confocal. זמן רכישה של תמונה יהיה בעיקר תלוי ברגישות של המצלמה מיקרוסקופ, על מספר תחומים שנרכשו בכל טוב ובמספר הערוצים שנרכשו לשדה הראייה. המשתמש יכול להחליט כיצד להתאים גורמים אלה כדי לייעל את פרוטוקול ההקרנה. כדוגמא, אנחנו צילמו צלחת / hr 96-גם אחד באמצעות התנאים שצוינו בשלב 5.1. ניתוח תמונה תלוי במידה רבה במחשב (או המקבץ של מכונות) משמש. אנו משתמשים 12 ליבות (2 x 3.06 GHz 6 ליבות), תחנת עבודה RAM 48 GB. מכונה זו דורשת approxiשלו של הדבר 40 דקות כדי לנתח תמונות שנרכשו מצלחת אחת. היבט חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ​​פיתוח מבחני אלה היא ההגדרה של חדש (או אופטימיזציה של קיימים) פרוטוקולים כדי לאפשר המניפולציה ועיבוד של מספר גדול של דגימות. דוגמא טיפוסית היא הפיתוח של הגישה אחת המושבה פריימר PCR, אשר אפשרה לנו להגביר ומהירות שברי רצף ה- DNA המכילים Coxiella האתר של החדרה של כל transposon, מדוגמאות קטנות מאוד. בהתבסס על הניסיון שלנו, פולימראז באיכות גבוהה צריך להיות שנבחר בקפידה ונבדק על מנת לקבל תוצאות לשחזור. המגבלה היחידה של גישה זו עשויה להסתיר בתצפית ש, ברוב המכריע של המקרים, כ -30% מהדגימות מעובד אינם ניצול, או בשל PCR או צעדי הרצף. עם זאת, בהתחשב בכך שהבידוד של מוטציות transposon Coxiella החדשות הוא לא צעד שער הגבלה, זה לא repreנשלח לנושא מרכזי. באופן דומה, הפיתוח של assay אמין לכמת את ריכוז החיידקים של מניות מוטציה היה מפתח לגישה זו. בשל הנטייה של Coxiella כדי לצבור כאשר בהשעיה, השימוש בקריאת צפיפות אופטית אינו ישימה לחישוב הריכוז של תרבויות Coxiella והחלופה היחידה הקיימת היה PCR כמותית (QPCR). כאן, שימוש סוכן intercalating DNA מתויג fluorescently של האיץ באופן משמעותי את quantitation חיידקים. גישה זו יכולה גם לנצל את השימוש בשורות תאי יציבות להביע סמני ניאון לכמה תאים תאיים בהתאם לפתוגן בשימוש. היבט חשוב נוסף הוא השימוש בתרבית תאי תקשורת נטולת פנול אדום. הבחנו כי יש אינדיקטור pH זה הקרינה טבעית המשתרעת הספקטרום האדום וירוק שמרווה את האות נרשמה על קורא הקרינה האוטומטית. Tהוא האסטרטגיה שהוצגה כאן מסתמכת על mutagenesis transposon האקראי. למוטציות של עניין, אנו ממליצים אימות חילופים וייחודיים (וclonality) באמצעות כתם הדרום וamplifications PCR של אתר הכנסת transposon. מלבד הציוד שתואר בסעיף הפרוטוקול, צוותי המעוניינים להשתמש בגישת ההקרנה שהוצגה כאן, ינצלו גדול בהקמה של מסדי נתונים יחסיים לאיסוף נתונים, שרת לאחסון נתונים ותחנת עבודה לניתוח תמונה מהיר. חשוב לציין, בשיטה שתוארה כאן מתאים למחקר של חיידקים פתוגנים תאיים אחרים הניתנת על שיטת mutagenesis אקראית קיימת לפתוגן, יכולות להיות נגועות שורות תאים על ידי פתוגן וזה אחד מציג פנוטיפ ספציפי בזיהום.

החיידק מתעוררים, אנדמי Coxiella burnetii אחראי להתפרצויות גדולות של קדחת Q, zoonosis דמוית שפעת מתישה עם בריאות חמורה והשפעה כלכלית 1. המאגרים העיקריים של Coxiella הם חיות בית ומשק, וההערכה היא כי יותר מ -90% מבקר לחלב בארה&quot;ב לשאת ג burnetii 2. בני אדם הם מארחים מקריים שנגועים על ידי שאיפה של אירוסולים מזוהמים. קדחת Q האנושית באה לידי ביטוי גם כמחלה אקוטית או כרונית, שעשויה להיות לי סיבוכים קטלניים עם שיעור תמותה מגיע 65% 1,3. עם מינון זיהומיות של 1 - 10 אורגניזמים, Coxiella הוא הפתוגן זיהומיות הידועים ביותר והוא נחקר כנשק ביו פוטנציאל 4. ההתפרצות האחרונה הנפץ של קדחת Q בהולנד (2007 - 2010), במקרי הסלמה מ-182 ליותר מ 2,000 בשנה, עומדת כדוגמא לאלימות הקשה של הפתוגן5. היעילות המדהימה של זיהומי Coxiella הוא צפוי הקשורים להתנגדותה ללחץ סביבתי, בשילוב עם ההתאמה הייחודית שלה לארח תאים. ואכן, Coxiella נמצא בסביבה בצורה של גרסאות מטבולית פעילה קטנות תא (SCV), אשר להפליא עמידים במספר תנאים קשים (התייבשות, טמפרטורה, וכו &#39;). SCVs נתפס על ידי תאי phagocytic באמצעות V α β 3 integrins 6 תוך פלישה של תאים שאינם phagocytic מתווכת על ידי ההדבקה / פלישת Coxiella 7 OmpA וקולט עדיין לא מזוהה. בעקבות ספיגה, Coxiella מתגורר בvacuoles ההדוק, חיובי לסמני endosomal המוקדמים Rab5 וEEA1 8. חיידקים להגיב להחמצת endosomal ידי המרה לגרסות מטבולית פעילה גדולות תא (LCVs) והפעלת מערכת דוט / ICM סוג 4 הפרשה (T4SS) 9, הומולוגי מאוד לזה של Legionella pneumophila 10. הפרשת effectors דוט / ICM תאפשר Coxiella ליצור תא גדול, LAMP1 חיובי חומצי המכיל אנזימי lysosomal פעילים בי חיידקים יכולים לשגשג ופעיל בהגנה על תאים נגועים מאפופטוזיס 11. לפיכך, המחזור תאיים של Coxiella נשלט על ידי טרנסלוקציה תיווך ICM דוט / של effectors חיידקי 12, לעומת זאת, גורמי החיידקים מעורבים בפלישת מארח תא, שכפול והפצה של חיידקי הזיהום יישארו במידה רבה לא ידועים. שילוב mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת, אנו מפתחים גישות משוחדת לזיהוי בו זמני של גורמי חיידקים מעורבים בשלבים העיקריים של זיהומי Coxiella: 1) הפנמה בתוך תאי מארח, 2) שכפול תאיים, 3) התפשטות תא אל התא , ו 4) התמדה. עד כה, יש לנו יותר מ -1,000 מטר הוקרנוutations ב500 רצפי Coxiella קידוד, אשר סיפק לנו תובנות חסרות תקדים לתוך אינטראקציות מארח הפתוגן המסדירות פתוגנזה Coxiella 7. ראוי לציין, גישה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של פתוגנים תאיים אחרים שחולקים תכונות ביולוגיה של תא עם Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

פלישה והתישבות של תאי מארח על ידי חיידקים פתוגנים תלויה בפעילות של מספר רב של חלבוני פרוקריוטים, שהוגדר כגורמים ארסי, שיכול לערער ולשנות פונקציות מארח מפתח. המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן לכן חשוב מאוד להבין זיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. גישה זו לעומת זאת, דורשת הפיתוח של מבחני תפוקה גבוהה החדשים לזיהוי משוחד, אוטומטי והאפיון של גורמי אלימות חיידקים. כאן, אנו מתארים שיטה לייצור ספריית מוטציה מתויג GFP ידי mutagenesis transposon ופיתוח גבוה הקרנת תוכן גישות לזיהוי בו זמני של פנוטיפים הקשורים transposon מרובים. מודל העבודה שלנו הוא burnetii תאית חיידקי Coxiella הפתוגן, סוכן etiological של קדחת Q zoonosis, אשר מזוהה עם seVere התפרצויות עם בריאות כתוצאה מכך וניטל כלכלי. הטבע תאיים לחייב של הפתוגן זה, עד לאחרונה, הקשה מאוד על זיהוי של גורמי חיידקים מעורבים באינטראקציות הפתוגן מארח, מה שהופך את של Coxiella המודל האידיאלי ליישום תפוקה גבוהה / גבוה תוכן גישות.

עם הבידוד של מוטציות transposon, המושבה פריימר היחידה PCR הוא שיטה לזיהוי האתר של הכנסת transposon לכל מוטציה חזקה, תפוקה גבוהה. גישה זו נובעת מפרוטוקול PCR מקונן טיפוסי אבל כאן פריימר יחיד hybridizes ו / או שאינו ספציפי במיוחד לתבנית ה- DNA בהתאם לחומרה של חישול בטמפרטורה (איור 1 א). מוצרי ה- PCR הטיפוסיים מורכבים ממספר רב של שברי ה- DNA, שרובם ספציפיים (איור 1). השימוש בפריימר רצף שונה שanneals תקין במעלה הזרם של ITR transposon, ומורד זרם של הרצף מוכר על ידי פריימר ההגברה מספק סגוליות לצעד הרצף (איור 1 ג). תוכנה אוטומטית לניתוח רצף מיישרת את הרצפים שהתקבלו לגנום Coxiella מתן האתר של הוספות transposon (איור 1 ג) המדויק. כל הוספות transposon יכולות להיות אז אןotated על הגנום Coxiella (1D איור). כל מוטציה Coxiella מבודדת ומוגברת axenically בACCM-2 בינוניים לפני או אחסון או הקרנה. איור 2 מדגים דוגמא של 38 מוטציות transposon בנקודת 16 / גני Coxiella ICM (איור 2 א). כדי להעריך את הכדאיות של מוטציות Coxiella, עקומות גדילת axenic מתקבלות על ידי דגימת תרבויות חיידקים למשך 7 ימים לאחר חיסון ויישום assay ריכוז החיידקים מתואר ב1.5 (Figurie 2B). אז מוטציות מוגברות מודגרת עם תאי אפיתל, ב96-גם צלחות בשלושה עותקים למשך 7 ימים. כל מוטציות Coxiella נוצרו להיות מתויג GFP, עקומות גדילה תאיות מתקבלות על ידי מדידת עוצמת הקרינה GFP של כל טוב, בכל שעה 24, וקשירת קשר לערכים שנמדדו כפונקציה של זמן (איור 2 ג). Intrעקומות גדילה תאיות לספק ניתוח כמותי של פנוטיפים הקשורים כל הכנסת transposon בגנום Coxiella. כדי להוסיף מידע איכותי על אותו מוטציות transposon, בחרנו לרכישת תמונה אוטומטית וניתוח. שבעה ימים שלאחר זיהום, צלחות קבועות, מעובד לimmunofluorescence כמתואר ב 4 ונותחו באמצעות מיקרוסקופ, כמתואר ב5. תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית כגון CellProfiler (Broad Institute, אוטומטי, epifluorescence <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com)</a> מעבד את הערוצים שנרכשו באופן עצמאי ומגזרים מזוהים אובייקטים לניתוח השוואתי (איור 3). זה מאפשר זיהוי ואפיון מורפולוגי של גרעיני מארח תא, קווי המתאר תא, lysosomes ומושבות Coxiella (איור 3 פנלים העליונים). התאמת מושבות Coxiella עם תאים ומאפשר lysosomes identificatiובניתוח צורני ספציפי של vacuoles המכיל Coxiella (שהם LAMP1 החיובי, איור 3 פנל שמאלי תחתון). התאמת מושבות Coxiella עם קווי המתאר תא מארח מאפשר זיהוי וניתוח צורני ספציפי של תאים נגועים (איור 3 פנל מרכז תחתון). לבסוף, 4 הערוצים ימוזגו להמחשה ולמטרות בקרת איכות (איור 3 פנל ימני תחתון). נתונים שהתקבלו מניתוח תמונה אוטומטית ניתן להתוות אחד נגד השני כדי להשיג &quot;מגרשי פיזור רב פנוטיפי&quot;. כדוגמא, באיור 4 א השטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella זממו נגד מספר מושבות לכל תא (איור 4 א), על מנת לזהות מוטציות המשפיעות על שכפול תאיים של Coxiella (פנוטיפ שכפול) ו / או היכולת של חיידקים לפלוש תאי מארח (internaפנוטיפ lization). ניתוח סטטיסטי המשמש להגדרת אזורים בעלילת פיזור וכתוצאה מכך המתאימה ולחמור (Z-ציון ≤ -4) פנוטיפים קלים (Z-ציון ≤ -2 -4 &lt;). מוטציות נצפו ב 3 אשכולות עיקריים: מוטציות שגרמו לצמיחה תאית פגומה של Coxiella קובצו בחלק השמאלי ביותר של העלילה (איור 4 א, ​​ורוד ונקודות אדומות); מוטציות שהשפיעו על הפנמת Coxiella בתאים קובצו בחלק התחתון של העלילה (איור 4 א, ​​נקודות אור והצבע כחולים כהה) ולבסוף, נקודות ירוקות בימני ביותר באזור של העלילה מתאימות למוטציות וכתוצאה מכך פנוטיפים שאינם משמעותיים ( Z-ציון&gt; -2). חשוב לציין, מוטציות שאינן מצליחין לשכפל אבל עדיין מסוגל לפלוש לתאי מארח, מזוהות לאחר 7 ימים של זיהום חיידקים בודדים, או מושבות קטנות, סמוכים לארח תא גרעינים (איור 4C, פנל שני). לפיכך, קולו הגודל של Coxiella &quot;nies &quot;יושפע באופן משמעותי, אך מספר התאים נגועים לא להשתנות בהשוואה לתאי -infected WT Coxiella. להיפך, מוטציות המשפיעות על היכולת של Coxiella לפלוש תאי מארח לגרום לירידה במספר מושבות / תא. כאשר מספר זה הוא נמוך משמעותי 1, הוא מציין כי, בממוצע, יש ירידה במספר הכולל של תאים נגועים. לחלופין, השטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella ניתן להתוות נגד מספר תאי מארח שרדו זיהום (איור 4), לזהות מוטציות המעניקות רעיל לCoxiella (פנוטיפ ציטוטוקסיות). כאמור לעיל, ניתוח סטטיסטי המשמש להגדרת אזורים בעלילת פיזור וכתוצאה מכך המתאימה ולחמור (Z-ציון ≤ -4) פנוטיפים קלים (Z-ציון ≤ -2 -4 &lt;). רוב הוקרן מוטציות לא השפיעו באופן משמעותי הישרדות תא, ללא קשר לשכפול חיידקים בתוך מארחתאים (נקודות ירוקות איור 3). 37 מוטציות הישרדות תא מארח מושפעת במתינות (איור 3, נקודות אדומות אור), ו- 7 מוטציות היו הרסניות, במיוחד לארח הישרדות תא (איור 3, נקודות אדומות כהות). שים לב שפרמטרים נוספים שהושגו על ידי הליך ניתוח תמונה האוטומטי יכולים לשמש כדי להפיק תרשימים אחרים, בהתאם לצרכי ניסוי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1:. המושבה פריימר יחידה רצף וביאור של מוטציות transposon Coxiella () PCR משמש כדי להגביר קטעי DNA המכילים את האתר של הכנסת transposon. פריימר הגברה (AMP) משמש גם כפריימר ספציפי ולא ספציפי, בהתאם לחומרה של חישול בטמפרטורה. תוצאה אופיינית של המושבה פריימר היחידה PCR (B). כל Reactiבמייצר מספר שברים בגודל משתנה, שחלקם מכילים את אתר הכנסת transposon; כמה אחרים הם מוגברים באופן אקראי כתוצרי לוואי של מחזור PCR חומרה הנמוכה. (ג) השימוש בפריימר רצף (Seq) שhybridizes לרצף transposon מאפשר הרצף של שברים של עניין. תוכנת ניתוח (ד &#39;) רצף מאפשרת ביאור האוטומטי של הוספות transposon על הגנום של החיידקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2:. Axenic וצמיחה תאית של מוטציות transposon Coxiella (א) במסך הטייס, יש לנו מבודד, רצף והוקרנו 38 מוטציות transposon בגרם ליבה 16Enes של מערכת הפרשת הנקודה / ICM Coxiella (מצויינים באדום). (ב) על מנת להעריך את הכדאיות של כל מוטציה transposon, הצמיחה של כל הבודד במדיום תרבות axenic מנוטר על 8 ימים באמצעות מתויג fluorescently סוכן intercalating DNA. (ג) כל מוטציה משמשת אז כדי להדביק תאי אפיתל. כtransposon בעל קלטת GFP, התפתחות חיידקים תאית היא פיקוח על 7 ימים של זיהום על ידי ביצוע השינויים של הקרינה GFP קשורה לשכפול Coxiella, באמצעות קורא microplate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> איור 3: אוטומטי ניתוח תמונה של זיהומי Coxiella אוטומטי.מיקרוסקופ epifluorescence הזדווגו משמש לתמונה 21 עמדות בכל טוב של 96-גם צלחות בשלושה עותקים. מגזרי תוכנת ניתוח תמונת אובייקטים בכל ערוצים שנרכשו לכימות וניתוח. בכל המקרים, חפצים נוגעים בגבול של התמונות אינם נכללים. () ערוץ Hoechst משמש לזיהוי גרעין תא מארח (מוקף בעיגול ירוק). (ב) אלה משמשים כגרעינים לזהות קווי המתאר תא מארח בערוץ Cy3 (העמדה של גרעינים היא בעיגול כחול, קווי המתאר תא נמצאים בירוק). (C) ערוץ Cy5 משמש לזיהוי תאי LAMP1-חיובי (בעיגול ירוק); רק האובייקטים כלולים בקווי מתאר התא זוהה בעבר (באדום) נשמרים לניתוח תמונה. ערוץ ה- GFP (ד) משמש לזיהוי מושבות Coxiella (מוקף בעיגול ירוק). (ה) התאמת מושבות Coxiella עם תאי LAMP1 חיובי מאפשרת זיהוי של Coxiella </em&gt; Vacuoles המכיל (CCVs); רק האובייקטים הכלולים בקווי מתאר התא זוהה בעבר (בירוק) נשמרים לניתוח תמונה. (F) התאמת מושבות Coxiella עם קווי המתאר תא מאפשר זיהוי של תאים נגועים (pseudocolored). תמונות (G) שנרכשו בערוצי הקרינה 4 (המקביל למושבות Coxiella (ירוק), גרעיני תאי מארח (כחול), קרום פלזמה תא מארח (אפור), תאי LAMP1-חיובי (אדום)) ימוזגו ומשמש להמחשה ואיכות שליטה. בקנה מידה מונעת 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> איור 4: זיהוי בקנה מידה גדולה של גורמים המעורבים בCoxiella מארח / אינטראקציה הפתוגןהשטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella זממו נגד המספר היחסי של מושבות לכל תא יונים. (א), לזהות פנוטיפים שכפול והפנמה של עניין. נקודות ירוקות מייצגות פנוטיפים שחורגים מWT Coxiella על ידי Z-ציון&gt; -2 (לא משמעותי). ורוד ונקודות בצבע תכלת מייצגים פנוטיפים שכפול והפנמת בהתאמה, עם Z-ציון בין -2 ו -4 (פנוטיפים קלים). אדום ונקודות בצבע כחולות כהות מייצגים פנוטיפים עם ≤ Z-ציון -4 (פנוטיפים חזקים). השטח הממוצע (במיקרומטר 2) (ב) למושבות Coxiella היה זמם נגד המספר הכולל של תאים (נגוע ולא נגוע) ששרדו 7 ימים של זיהום להעריך את ההשפעה הרעילה לתאים וכתוצאה מהוספות transposon. נקודות ירוקות מייצגות פנוטיפים שחורגים מWT Coxiella על ידי Z-ציון&gt; -2 (לא משמעותי). נקודות הוורודות מייצגות ph ציטוטוקסיותenotypes עם Z-ציון בין -2 ו -4 (פנוטיפים קלים). נקודות אדומות מייצגות פנוטיפים ציטוטוקסיות עם ≤ Z-ציון -4 (פנוטיפים חזקים). חצים מצביעים על מוטציות מאוירות על ידי האות קטנה המקבילה בג (ג) נציג תמונות של שכפול, הפנמה ופנוטיפים ציטוטוקסיות. בכל המקרים, גרעיני תא מארח הם באדום, מושבות Coxiella נמצאות בירוק. בקנה מידה מונעת 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K Views.  Université Montpellier.  burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך. 

Video: Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...