Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
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This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Studie von Wirt / Pathogen-Interaktionen hat sich als bemerkenswert Verfahren, um bakterielle Infektionen zu verstehen und zu entwickeln alternative Strategien zur Infektionskrankheiten entgegenzuwirken. Aufgrund der Vielfalt der Strategien durch verschiedene bakterielle Erreger ausgearbeitet, die Identifizierung und Charakterisierung von bakteriellen Virulenzfaktoren und des Host-Signalwege, die bei Infektionen abzielen stellen jedoch eine echte Herausforderung. Dies erfordert die Entwicklung neuer Konzepte für die Groß Identifizierung von Schlüssel Wirt / Pathogen-Interaktion Hubs. Die jüngste Entwicklung von innovativen, Hochdurchsatz-und High-Content-Screening-Verfahren stellt eine wertvolle Ressource, die sich dem Studium der intrazelluläre bakterielle Erreger 15 angepasst werden kann. Hier haben wir die zoonotische bakteriellen Erreger Coxiella burnetii als Modell verwendet werden, um Screening-Ansätze, die Transposon-Mutagenese und fluoreszenzbasierte Tests zu kombinieren zu entwickeln. Importantly ermöglicht diese Screening-Verfahren die gleichzeitige Überwachung mehrerer Schritte des Coxiella intrazellulären Zyklus und bietet eine globale Übersicht über die durch dieses Bakterium entwickelt zu erobern, zu replizieren und bleiben in infizierten Zellen Strategien. Der hier beschriebene Ansatz basiert auf zwei etablierte Techniken, Transposon-Mutagenese und fluoreszenzbasierte Tests, die erfolgreich auf das Studium der bakteriellen Erreger angewendet wurden basierend. Die Kombination dieser Techniken, die in Zusammenhang mit der Hochdurchsatz / High-Content-Bildschirme ermöglicht es, die Auswirkungen einer Anzahl von Bakterien Mutationen durch die Analyse einer sehr hohen Anzahl von Ereignissen (typischerweise 15.000 infizierten Zellen pro Bakterien Mutationen werden abgebildet und analysiert) auszuwerten. Dies stellt eine wichtige statistische Analyse der Ereignisse, wie bakterielle Invasion von Wirtszellen und die intrazelluläre Replikation, die sind von Natur aus mit hoher Variabilität. Es ist wichtig zu beachten, dass Zelllinien mit Ausnahme epithelial können für diese Art von Screening verwendet werden. Allerdings sind flach und große Epithelzellen optimal für die Bildanalyse als Wirtszellorganellen sind leichter zu erkennen. Da die Mehrzahl der automatisierten Mikroskopen automatisch verarbeiten eine Vielzahl von Platten, gibt es praktisch keine Grenzen für die Anzahl von Mutanten, die gleichzeitig untersucht werden können. Abhängig von dem Pathogen, kann der Benutzer Berechtigung der Verwendung eines Epifluoreszenz oder einem konfokalen Mikroskop. Die Zeit der Bildaufnahme wird überwiegend abhängig von der Empfindlichkeit der Mikroskopkamera, auf die Anzahl der Felder pro Vertiefung und der Anzahl der Kanäle pro Sichtfeld erfasst erworben. Der Benutzer kann entscheiden, wie diese Faktoren anpassen, um die Screening-Protokoll zu optimieren. Als ein Beispiel abgebildet wir eine Platte mit 96 Vertiefungen / h unter Verwendung der in Punkt 5.1 genannten Bedingungen. Bildanalyse hängt weitgehend von der verwendeten Maschine (oder Gruppe von Maschinen). Wir verwenden eine 12-Core (2 x 3.06 GHz 6-Core), 48 GB RAM Workstation. Diese Maschine erfordert Angleirungsweise 40 Minuten, um Bilder von einer Platte erworben zu analysieren. Ein wichtiger Aspekt in Betracht gezogen werden, bei der Entwicklung dieser Assays ist die Menge von neuen (oder die Optimierung von bestehenden) Protokollen, um die Manipulation und Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben ermöglicht. Ein typisches Beispiel ist die Entwicklung der einzelnen Primer Kolonie-PCR-Ansatz, der uns schnell verstärken und erlaubt Sequenz Coxiella DNA-Fragmente, die die Stelle der Insertion jedes Transposon, aus sehr kleinen Proben. Basierend auf unserer Erfahrung, hat die High-Fidelity-Polymerase an sorgfältig ausgewählte und um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten getestet werden. Die einzige Begrenzung dieses Ansatzes kann in der Beobachtung, daß in den meisten Fällen etwa 30% der verarbeiteten Proben sind nicht ausnutzbar verbergen, entweder aufgrund der PCR oder Sequenzierungsschritten. Berücksichtigt man jedoch, daß die Isolierung neuer Coxiella Transposon-Mutanten keine geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist, bedeutet dies nicht REPREschickte ein wichtiges Thema. In ähnlicher Weise die Entwicklung eines zuverlässigen Test zur Bestimmung des Bakterienkonzentration von mutierten Bestände quantifizieren war der Schlüssel für diesen Ansatz. Aufgrund der Tendenz von Coxiella zu aggregieren, wenn sie in Suspension, ist die Verwendung von Ablesungen der optischen Dichte nicht anwendbar, um die Konzentration von Coxiella Kulturen und der einzigen Alternative war quantitative PCR (qPCR) zu berechnen. Hierbei ist die Verwendung einer fluoreszenzmarkierten DNA interkalierende Mittel signifikant Bakterioplankton Quantifizierung beschleunigt. Dieser Ansatz kann auch die Vorteile der Verwendung von stabilen Zelllinien, die Fluoreszenzmarker für mehrere intrazelluläre Kompartimente in Abhängigkeit von dem Erreger eingesetzt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Verwendung von Zellkulturmedien frei von Phenolrot. Wir beobachteten, dass dieser pH-Indikator hat eine natürliche Fluoreszenz überspannt den roten und grünen Spektrum, das die auf der automatisierten Fluoreszenzreader aufgezeichnete Signal sättigt. Ter hier vorgestellte Strategie beruht auf Zufalls Transposon-Mutagenese. Bei den Mutanten von Interesse, empfehlen wir die Validierung einzigartigen Trans (und Klonalität) mit Southern-Blot und PCR-Amplifikationen der Transposoninsertion Website. Neben der im Protokoll beschrieben Ausrüstung, Teams Interesse an der Nutzung der Screening-Ansatz hier präsentiert wird, werden große Vorteil in der Aufbau einer relationalen Datenbank für die Datensammlung, einem Server für die Datenspeicherung und einer Arbeitsstation für die schnelle Bildanalyse zu nehmen. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Methode ist für die Untersuchung von anderen intrazellulären bakteriellen Pathogenen geeignet vorgesehen eine zufällige Mutagenese-Verfahren für den Erreger vorhanden ist, können Zelllinien durch das Pathogen infiziert sein und diese zeigt einen spezifischen Phänotyp während der Infektion.

Die Schwellen, endemische Bakterium Coxiella burnetii ist für große Ausbrüche von Q-Fieber, eine schwächende Grippe-ähnliche Zoonose mit schweren gesundheitlichen und wirtschaftlichen Auswirkungen 1 verantwortlich. Die wichtigsten Lagerstätten von Coxiella sind Haus- und Nutztieren, und es wird geschätzt, dass mehr als 90% der Milchviehhaltung in den USA durchzuführen C. burnetii 2. Der Mensch ist ein versehentliches Hosts, die durch Inhalation kontaminierter Aerosole infiziert sind. Menschen Q-Fieber manifestiert entweder als akute oder chronische Krankheit, die tödlichen Komplikationen mit einer Mortalitätsrate erreichte 65% 1,3 haben. Mit einer infektiösen Dosis von 1 - 10 Organismen ist Coxiella das infektiöse Pathogen bekannt und es hat sich als potentielle biologische Waffe 4 untersucht worden. Die jüngste explosive Ausbruch von Q-Fieber in den Niederlanden (2007 - 2010), mit Fällen Eskalation von 182 auf mehr als 2.000 pro Jahr, steht als Beispiel für die schwere Virulenz des Erregers5. Die bemerkenswerte Effizienz Coxiella Infektionen wird wahrscheinlich mit seiner Resistenz gegen Umweltstress, kombiniert mit seiner einzigartigen Anpassung an Wirtszellen verbunden. Tatsächlich ist Coxiella in der Umgebung, in der Form von metabolisch inaktiven kleinzelligem Varianten (SCV), das bemerkenswert beständig gegenüber mehreren harten Bedingungen (Austrocknung, Temperatur, etc.) vorhanden sind. SCVs werden von Fresszellen via α V β 3 Integrin 6 genommen, während Invasion nicht-Fresszellen wird durch die Coxiella Adhäsion / Invasion OmpA 7 und einer noch nicht identifizierten Rezeptor vermittelt. Im Anschluss an die Aufnahme, wohnt Coxiella in eng anliegenden Vakuolen, positiv für den frühen endosomalen Marker Rab5 und EEA1 8. Bakterien reagieren auf endosomalen Ansäuerung durch die Umstellung auf metabolisch aktiven großen Zellvarianten (leichte Nutzfahrzeuge) und Aktivieren eines Dot / Icm Sekretionssystem vom Typ 4 (T4SS) 9, Hoch homolog zu der Legionella pneumophila 10. Die Sekretion von Dot / Icm Effektoren ermöglichen Coxiella, um eine große, LAMP1-positive sauren Raum mit aktiven lysosomalen Enzymen in denen sich Bakterien gedeihen können und aktiv infizierte Zellen vor Apoptose 11 zu erzeugen. Daher wird die intrazelluläre Zyklus Coxiella vom Dot / Icm vermittelte bakterielle Translokation Effektoren 12 gesteuert werden jedoch die mikrobielle Faktoren in Wirtszellinvasion, bakterielle Replikation und Verbreitung der Infektion beteiligt sind heute noch weitgehend unbekannt. Kombinieren Transposon-Mutagenese und Fluoreszenz-basierte Assays, entwickeln wir unvoreingenommene Ansätze zur gleichzeitigen Identifizierung von bakteriellen Faktoren in den Hauptschritten des Coxiella Infektionen beteiligt: ​​1) Internalisierung in Wirtszellen, 2) die intrazelluläre Replikation, 3) Zelle-zu-Zell-Ausbreitung und 4) Ausdauer. Bis heute haben wir mehr als 1.000 m geschirmtutations in 500 Coxiella kodierenden Sequenzen, die uns mit noch nie da gewesenen Einblick in die Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Coxiella Pathogenese 7 zu regulieren. Zu beachten ist, kann dieser Ansatz auf die Untersuchung von anderen intrazellulären Krankheitserreger, die Zellbiologie Funktionen mit Coxiella gemeinsam angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Iron sulfate</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax, without phenol red</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>For cell culture and infection</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>GE healthcare</td><td>SH30071</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Electroporation cuvette 0.1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; transformation</td></tr><tr><td>Trackmates screw top tubes with caps</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D barcoded screwcap</td></tr><tr><td>96-well microplate with black walls and bottom</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>96-well PCR microplate</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse free</td></tr><tr><td>96-well plate, deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; mutants infections</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>For single primer colony PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Anti-LAMP1 antibody</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence automated microscope Cellomics</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion und Kolonisierung von Wirtszellen, die durch bakterielle Pathogene, hängt von der Aktivität einer Vielzahl von prokaryotischen Proteinen, definiert als Virulenzfaktoren, die unterwandern und zu manipulieren Schlüsselaufnahmefunktionen. Die Studie von Wirt / Pathogen-Interaktionen ist daher äußerst wichtig, um bakterielle Infektionen zu verstehen und zu entwickeln alternative Strategien zur Infektionskrankheiten entgegenzuwirken. Dieser Ansatz erfordert jedoch die Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Assays für die unvoreingenommene, automatisierte Identifizierung und Charakterisierung von bakteriellen Virulenzfaktoren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung eines GFP-markierten Mutantenbibliothek durch Transposon-Mutagenese und der Entwicklung von High-Content-Screening-Ansätze für die gleichzeitige Identifizierung mehrerer Transposon-assoziierten Phänotypen. Unser Arbeitsmodell ist die intrazellulären bakteriellen Erreger Coxiella burnetii, der Erreger des Q-Fiebers Zoonose, die mit se verbunden istvere Ausbrüche mit einer daraus resultierenden gesundheitlichen und wirtschaftlichen Belastung. Die obligat intrazelluläre Natur des Erregers hat bis vor kurzem stark behindert die Identifizierung von bakteriellen Faktoren in Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen beteiligt, so dass von Coxiella das ideale Modell für die Umsetzung von Hochdurchsatz / High-Content-Ansätze.

Nach Isolierung der Transposon-Mutanten, ist Einzelprimer-Kolonie-PCR eine robuste, Hochdurchsatzverfahren, um die Website von Transposoninsertion für jede Mutante zu identifizieren. Dieser Ansatz beruht auf einem typischen nested PCR-Protokoll aber hier ein einzelner Primer hybridisiert spezifisch und / oder unspezifisch an der Matrizen-DNA in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur (1A). Die typischen PCR-Produkte bestehen aus mehreren DNA-Fragmenten, von denen die meisten spezifisch sind (1B). Die Verwendung eines unterschiedlichen Sequenzierungsprimer, die direkt stromaufwärts des Transposons ITR, und stromabwärts des durch den Amplifikationsprimer erkannte Sequenz annealt bietet Spezifität für die Sequenzierungsschritt (Figur 1C). Automatisierte Software für die Sequenzanalyse richtet die erhaltenen Sequenzen an die Coxiella Genom Bereitstellung der genaue Ort der Transposoninsertionen (Abbildung 1c). Alle Transposoninsertionen kann dann annauf der Coxiella Genom (1D) otated. Jedes Coxiella Mutante isoliert und axenisch in ACCM-2-Medium entweder vor der Lagerung oder Screening amplifiziert. 2 zeigt ein Beispiel eines 38-Transposon-Mutanten in 16 Punkten / ICM Coxiella Gene (2A). Um die Lebensfähigkeit von Coxiella Mutanten zu beurteilen, werden axenischen Wachstumskurven durch Abtasten Bakterienkulturen für 7 Tage nach der Inokulation und Anwenden des in 1.5 (Figurie 2B) beschriebenen Bakterienkonzentration Assay erhalten. Amplifizierten Mutanten werden dann mit Epithelzellen für 7 Tage inkubiert, in dreifacher Platten mit 96 Vertiefungen. Alle Coxiella Mutanten erzeugt, die GFP-markierten, intrazellulären Wachstumskurven werden durch Messung der Fluoreszenzintensität der GFP jeden gut, alle 24 Stunden, und Aufzeichnen der Messwerte als Funktion der Zeit (2C) erhalten. Intrazellulären Wachstumskurven stellen die quantitative Analyse der Phänotypen mit jedem Transposoninsertion im Coxiella Genom assoziiert. Um qualitative Informationen zu den gleichen Transposonmutanten hinzuzufügen, haben wir uns für die automatisierte Bildaufnahme und Analyse. Sieben Tage nach der Infektion, Platten befestigt sind, verarbeitet für Immunfluoreszenz, wie in 4 beschrieben und mit Hilfe eines automatisierten, Epifluoreszenzmikroskop wie in 5. Automatisierte Bildanalyse-Software beschrieben, wie CellProfiler (Broad Institute, analysiert <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) verarbeitet die erfassten Kanäle unabhängig und Segmente Objekten für eine vergleichende Analyse (Figur 3) identifiziert. Dies ermöglicht die Identifikation und morphologische Charakterisierung von Wirtszellkerne, Zellen Konturen, Lysosomen und Coxiella Kolonien (Abbildung 3 oberen Felder). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellen und ermöglicht die Lysosomen Bestandtauf und spezifische morphologische Analyse von Coxiella enthaltenden Vakuolen (die LAMP1 positive, 3 unteren linken Bereich sind). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Wirtszelle Konturen ermöglicht die Identifizierung und spezifische morphologische Analyse von infizierten Zellen (Abbildung 3 unten Mitte). Schließlich werden die 4 Kanäle zur Veranschaulichung und Qualitätskontrolle (Abbildung 3 unten rechts) zusammengeführt. Von der automatisierten Bildanalyse erhaltenen Daten können gegeneinander aufgetragen werden, um &quot;Mehr phänotypische Streudiagramme&quot; zu erhalten. Als ein Beispiel in Figur 4A die mittlere Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Kolonien pro Zelle (4A) aufgetragen wird, um Veränderungen, die die intrazelluläre Replikation des Coxiella (Replikationsphenotyp) und / oder beeinflussen zu identifizieren die Fähigkeit von Bakterien an Wirtszellen eindringen (internasierung Phänotyp). Die statistische Analyse wurde verwendet, um Regionen in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 &lt;Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Mutanten wurden in 3 Hauptcluster beobachtet: Mutationen, die zu einer fehlerhaften intrazelluläre Wachstum von Coxiella Folge wurden in der äußersten linken Teil der Handlung (4A, rosa und rote Punkte) gruppiert sind; Mutationen, die Coxiella Internalisierung in Zellen betroffen waren im unteren Teil des Grundstücks gruppiert (4A, helle und dunkle blaue Punkte) und schließlich grünen Punkten in der äußersten rechten Bereich des Grundstücks entsprechen Mutationen in nicht-signifikanten Phänotypen ( Z-Score&gt; -2). Wichtig ist, dass Mutanten, die zur Replikation ausfallen, aber noch in der Lage, um Wirtszellen eindringen, werden nach 7 Tagen der Infektion als einzelne Bakterien oder kleinen Kolonien, angrenzend an Zellkernen (4C, zweite Grafik) Wirt erkannt. Daher ist die Größe der Coxiella &quot;Colomen &quot;wird erheblich beeinflusst werden, aber die Anzahl der infizierten Zellen werden nicht im Vergleich zu WT Coxiella infizierten Zellen variieren. Im Gegenteil, Mutationen, die die Fähigkeit von Coxiella, Wirtszellen eindringen beeinflussen zu einer Abnahme in der Anzahl von Kolonien / Zelle. Wenn diese Zahl deutlich unterhalb von 1 ist, zeigt dies, dass, im Durchschnitt, gibt es eine Abnahme in der Gesamtzahl der infizierten Zellen. Alternativ kann die Durchschnittsfläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Wirtszellen, die die Infektion (4B), aufgetragen werden, um Mutationen, die Zytotoxizität Coxiella (zytotoxische Phänotyp) verleihen identifizieren. Wie oben wurde die statistische Analyse verwendet, um Bereiche in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 &lt;Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Die meisten Mutationen gescreent nicht signifikant auf das Überleben der Zelle, unabhängig von bakteriellen Replikations im WirtsZellen (3B grüne Punkte). 37 Mutationen leicht betroffen Wirtszelle Überleben (3B, leicht rote Punkte) und 7 Mutationen waren besonders schädlich für das Überleben der Zellen (3B, dunkle rote Punkte) hosten. Bitte beachten Sie, dass durch die automatisierte Bildanalyseverfahren erhalten zusätzliche Parameter können verwendet werden, um den übrigen Diagrammen abgeleitet werden, je nach experimentellen Anforderungen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Abb. 1: Die Sequenzierung und Annotation von Coxiella Transposon-Mutanten (A) Einzelprimer Kolonie-PCR wird verwendet, um DNA-Fragmente, die die Stelle der Transposon-Insertion zu verstärken. Amplifikationsprimer (Amp) sowohl als spezifische und unspezifische Primer in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur verwendet. (B) Typische Ergebnis der Einzelprimer-Kolonie-PCR. Jede Reactiauf produziert eine Anzahl von Fragmenten unterschiedlicher Größe, von denen einige das Transposon Insertionsstelle enthält; einige andere zufällig als Nebenprodukte der PCR-Zyklus niedriger Stringenz amplifiziert. (C) Die Verwendung eines Sequenzierungsprimer (Seq), der auf einem Transposon-Sequenz hybridisiert, kann die Sequenzierung der Fragmente von Interesse. (D) Die Sequenzanalyse-Software ermöglicht die automatische Annotation von Transposoninsertionen auf das bakterielle Genom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Abb. 2: Axenic und intrazelluläre Wachstum von Coxiella Transposon-Mutanten (A) In der Pilotschirm haben wir in 16 Kern g isoliert, sequenziert und abgeschirmt 38 Transposon-Mutantenenen der Coxiella dot / icm-Sekretionssystem (rot gekennzeichnet). (B) Um die Rentabilität der einzelnen Transposon-Mutante zu bewerten, das Wachstum je Isolat in axenischen Kulturmedium wird über 8 Tage mit einem fluoreszenzmarkierten DNA-Interkalationsmittel überwacht. (C) jede Mutante wird dann verwendet, um Epithelzellen zu infizieren. Wie das Transposon besitzt eine GFP Kassette wird intrazellulären Bakterienwachstum mehr als 7 Tage nach der Infektion, indem Sie die Variationen der GFP-Fluoreszenz mit Coxiella Replikation verbunden ist, unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader überwacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3: Automatisierte Bildanalyse von Coxiella Infektionen Ein Auto.Zusammengesetzte Epifluoreszenzmikroskop wird zur Abbildung 21 Positionen pro Loch von dreifachen 96-Well-Platten. Die Bildanalyse-Software Segmente Objekten in jeder erworbenen Kanäle für die Quantifizierung und Analyse. In allen Fällen werden die Gegenstände berühren den Rand der Bilder ausgeschlossen. (A) Die Hoechst-Kanal wird verwendet, um Wirtszellkerne zu identifizieren (in grün markiert). (B) Diese werden als Keime verwendet werden, um Wirtszellkonturen im Cy3-Kanal zu identifizieren (die Position der Kerne blau eingekreist sind Zellkonturen in grün). (C) Das Cy5-Kanal wird verwendet, um LAMP1-positive Fächer zu identifizieren (in grün eingekreist); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen (in rot) enthalten Objekte für die Bildanalyse erhalten. (D) Die GFP-Kanal wird verwendet, um Coxiella Kolonien zu identifizieren (in grün markiert). (E) Korrelieren Coxiella Kolonien mit LAMP1 positive Abteilen ermöglicht die Identifizierung von Coxiella </em&gt; Enthaltenden Vakuolen (CCV); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen enthalten Objekte (in grün) für die Bildanalyse erhalten. (F) Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellkonturen ermöglicht die Identifizierung von infizierten Zellen (pseudocolored). (G) in den 4 Fluoreszenzkanälen erworbene Bilder (entsprechend Coxiella Kolonien (grün), Wirtszellkerne (blau), Wirtszellplasmamembran (grau), LAMP1-positive Fächer (rot)) werden zusammengeführt und für die Darstellung und Qualität verwendet Kontrolle. Maßstabsbalken 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Abbildung 4: Groß Identifizierung von Coxiella Faktoren in Wirts Mitmachen / Pathogen interagierenIonen. (A) Die durchschnittliche Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die relative Anzahl der Kolonien pro Zelle aufgetragen ist, um die Replikation und Internalisierung Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score&gt; -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa und Hellblau Punkte stehen für die Replikation und Internalisierung Phänotypen jeweils mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rot und dunkelblau Punkte stellen Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). (B) Die mittlere Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien wurde an der Gesamtzahl von Zellen (infiziert und nicht infiziert), dass 7 Tage nach der Infektion auf die zytotoxische Wirkung von Transposoninsertionen resultierende Schätzung lebten aufgetragen. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score&gt; -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa Punkte stellen zytotoxische phenotypes mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rote Punkte stehen für zytotoxische Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). Die Pfeile zeigen die Mutanten durch den entsprechenden Kleinbuchstaben in C (C) veranschaulicht repräsentative Bilder der Replikation, Internalisierung und zytotoxische Phänotypen. In allen Fällen sind Wirtszellkerne in rot, sind Coxiella Kolonien in grün. Maßstabsbalken 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.8K Aufrufe.  Université Montpellier.  Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen. 

Serie: Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medizin

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Biochemie

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologie

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Erzeugung<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening

Zusammenfassung

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Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Erzeugung

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz