Name: co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein
Uploaded: 2015-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein at JoVE.com

Bu çalışma FWO-Vlaanderen, IOF projesi IOF10 / StarTT / 027 ve Gent Üniversitesi Özel Araştırma Hibe BOF12 / GOA / 014 tarafından desteklenmiştir.

Not: Aşağıdaki transfeksiyon ve ko-immünopresipitasyon protokolü 9 cm Petri kabı biçimi için kurulur. Diğer formatlar protokolü ölçekleme sonra da mümkündür. 1. Tohum insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri <ol><li> % 10 fetal dana serumu, 2 mM L-glutamin, 0.4 mM Na-piruvat ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 12 ml 9 cm&#39;lik petri tabağı başına 1.2 x 10 6 hücre transfeksiyondan önce HEK293T hücreleri bir gün Seed, 0.1 mM temel olmayan amino asit, 100 U / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin. </li><li> Hücreler, 37 ° C&#39;de 16 saat ve% 5 CO2 büyütün. </li><li> Görme transfeksiyondan önce ters ışık mikroskobu ile morfoloji ve hücrelerin canlılığını kontrol edin. Hücreler uygun transfeksiyon etkinliği için alt konfluent olması gerekir. </li></ol> HEK293T Hücreler 2. Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu Not: Kullanım 0.5-1 pCAXL-NP veya 9 cm tabak başına pCAXL-MX1 1-3 mikrogram ile birlikte boş pCAXL plazmid ug. Tüm örneklerde toplam plazmid DNA eşit miktarda kullanmak; Boş plazmid gerekirse ayarlayın. <ol><li> Aşağıdaki transfeksiyon tamponlar hazırlanması: <ol><li> 1.0 mM Tris-HCI, pH 8.0 ve 0.1 mM EDTA pH 8.0 konsantrasyonda Tris-EDTA (TE) hazırlayın. </li><li> 25 mM HEPES konsantrasyonlarda BS / HEPES hazırlayın (5.96 g / L, 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit), 274 mM NaCI (16 g / L), 10 mM KCI (0.74 g / L), 1.5 mM NaHPO 4 · 12H H2O (0.5 gr / L) ve 11.1 mM dekstroz (2 g / L). 7,05 pH ayarlayın. </li><li> 1.25 M CaCI2 · 2H 2 O (183.8 g / L) ve 125 mM HEPES (29,79 g / L) arasında dağılım gösterebilir ve CaCl2 / HEPES hazırlayın. NaOH ile 7,05 pH ayarlayın. </li></ol></li><li> Kullanımdan önce 37 ° C &#39;de transfeksiyon tamponlar ısıtın. </li><li> TE 600 ul plazmid DNA seyrelterek plazmid örnekleri hazırlanır.6 gözlü bir levhanın gözleri içine bu karışımları hazırlayın. </li><li> Plazmid örnekleri damla damla şekilde CaCl2 / HEPES 150 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı 3 kez pipetleme karıştırın. </li><li> (750 ul TE + DNA + CaCl2 / HEPES) taze 6-çukurlu plaka içindeki Resim BS / HEPES tamponu 750 ul damla plazmid çözeltisi eklenerek damla transfeksiyon çözelti hazırlayın. Tam da içeren BS / HEPES tamponu üzerinde eşit plazmid çözümü dağıtın. </li><li> 1000 RPM&#39;de 90 sn için, bir plaka karıştırıcısı üzerinde transfeksiyon solüsyonu çalkalayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> Transfeksiyon solüsyonu (1.5 mi) hücrelere damla damla ekleyin. Hücreler üzerinde transfeksiyon solüsyonu damla P1000 mikropipet kullanın. Tam 9 cm Petri kabı üzerine karışımı dağıtılır ve çok yavaşça plaka sallayın. </li><li> 6 st için CO 2, 37 ° C&#39;de kuluçkaya bırakılır ve% 5. Sonra aspirasyon orta kaldırmak ve hemen wi yerine12 ml taze, önceden ısıtılmış orta inci. Yavaşça hücre ayrışması önlenmiş, hücrelere taze ortam ilave edin. Bunun için, kuyunun kenarına pipet ucu tutun ve yavaşça orta dışarı itmek. </li><li> 37 ° C&#39;de ilave bir 16 saat daha kuluçkaya bırakılır ve% 5 CO2. </li></ol> 3. ko-immünopresipitasyon Not: transfeksiyondan sonra eş-immunoprecipitation 24 saat gerçekleştirin. <ol><li> Düşük tuz liziz tamponuyla yıkandı ve yüksek tuzlu yıkama tamponu hazırlanması. <ol><li> NEM miktarının tartılması ve mutlak etanol içinde çözülmesiyle 2 M, N-etilmaleimit (NEM) bir stok çözeltisi hazırlandı. Kullanmadan önce taze NEM stok çözeltisi hazırlayın. DİKKAT: NEM, çok toksik hazırlamak ve davlumbaz, bu stok solüsyonu kullanın. </li><li> 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 1 NP-40 ve bir proteaz inhibitör kokteyli konsantrasyonlarda düşük tuz liziz tamponu (1 tablo çözülür50 ml lisiz tampon maddesi içinde) ihtiva eder. 25 mM (örneğin, 1:80 seyreltilir), bir son konsantrasyon elde edecek NEM ekleyin. Proteaz inhibitörleri ve NEM ekledikten sonra buz üzerinde tutun. Not: Kullanmadan önce her zaman taze proteaz inhibitörleri ve NEM ekleyin. </li><li> 50 mM Tris-HCI, pH 8, 500 mM NaCI, 5 mM EDTA ve% 1 NP40 konsantrasyonlarda yüksek tuzlu yıkama tamponu hazırlayın. Yüksek tuz yıkama tamponu NEM içermediğini unutmayın. </li></ol></li><li> Hücre lizatlarının Hazırlanması. <ol><li> Ortamı çıkarın ve buz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su, 2 ml (PBS) ile hücreleri yıkayın. HEK293T hücreleri kolayca ayırmak gibi çok nazikçe, yıkama tamponu ekleyin. </li><li> PBS çıkarın ve 9 cm Petri başına buz soğuk düşük tuz lizis tamponu 600 ul ekleyin. </li><li> Buz üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edin. Plakalar yatay tutulur lizis tamponu ile plaka yüzeyinin tam kapsama sağlamak için, emin olun. Yavaşça her 5 dk plakaları sallayın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj hücre lizat toplayın4 ° C&#39;de 3 dakika 16,000 x g&#39;de için boru ve santrifüj çözünmeyen fraksiyonu pelet haline getirmek üzere. </li><li> Yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre lizatı, yani çözünür fraksiyonu aktarın ve buz üzerinde tutun. Hemen etkileşim proteinlerin ayrışma önlemek için, ko-immünopresipitasyon protokolü ile devam edin. Lizatlarında proteolitik etkinliğini sınırlamak için buz üzerinde mümkün olduğu kadar ya da 4 ° C &#39;de, aşağıdaki adımları. </li></ol></li><li> Bağışıklık-komplekslerinin Nesil. Not: Bu adımda, ilgi konusu bir protein, uygun antikor ile bağlıdır. NP MX1 etkileşimini incelemek için bir fare anti-NP monoklonal antikor kullanılır. <ol><li> Her numune için, bir anti-NP monoklonal antikorun 2 ul ve düşük tuz lisiz tamponu (250 ul toplam hacim) 113 ul lizat 135 ul karıştırın. , Örneğin batı beneklemesi gibi daha fazla analiz için -20 ° C&#39;de, kalan lisat saklayın edebilmiş Intera ifade seviyelerini belgeTransfekte edilmiş hücrelerde ölü m işbirliği yapmaktadır. Not: Alternatif olarak, her bir lizattan için, örneğin, 400 ug (Bradford reaktifi ile, örneğin) lizat proteini konsantrasyonunu ölçmek ve toplam proteinin sabit bir miktar kullanılır. </li><li> 4 ° C&#39;de bir döner tekerlek üzerinde 3 saat süre ile, antikor lizat karışımı inkübe edin. Bu aşama, bir gece boyunca inkübasyon için genişletilebilir. </li></ol></li><li> Protein G, tanelerin hazırlanması. Not: Protein G, boncuk sevk ve korunması için% 20 etanol içinde saklanır. Boncuk bulamaç normal olarak% 50 tanecikleri içerir ve immün komplekslerin immünopresipitasyon için kullanılmadan önce, bu boncuklar yıkandı gerekmektedir. <ol><li> Her bir örnek için, örneğin, boncuklar, 50 ul, boncuk çamurunun 100 ul kullanın. Bir tüp içinde ko-immünopresipitasyon deneyinde bütün örnekler için gerekli olan tanelerin miktarının yıkayın. Boncuk-bulamaç pipetlenmesini kolaylaştırmak için 1 ml pipet ucu kesin. </li><li> 8.000 x G proteini boncuk bulamaç santrifüjg ve 30 saniye süreyle 4 ° C&#39;de. Etanol çözeltisi çıkarın ve düşük tuz lisis tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin. Santrifüj protein G 8000 xg&#39;de boncuk bulamaç ve 30 saniye süreyle 4 ° C&#39;de yavaşça süpernatant kaldırmak. Bu yıkama adımı 3 kez tekrarlayın. Not: proteaz inhibitörleri ya da NEM içermesi gerekmez boncuk yıkamak için kullanılan düşük tuz lizis tamponu. </li><li> Protein G, tanelerin hacim tahmin ve düşük tuz lisis tampon maddesinin eşit hacmi düşük tuz liziz tamponu içinde yeni bir% 50 boncuk bulamaç ekleyin. </li><li> Her numune için, yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, boncuk çamurunun 100 ul transfer edilir ve kullanıma kadar buz üzerinde muhafaza edin. Bu boncuklar hızla tüpün dibine sediment gibi, bölünmeden önce boncuk bulamaç tekrar süspansiyon dikkatli olun. </li></ol></li><li> Protein G, boncuk ve bunların elüsyon ile immün komplekslerin immünopresipitasyonu. <ol><li> Santrifüj tüm boruları 30 sn 8,000 xg&#39;de ve 4 ° C ve immunoprecipitation protein G boncuklar kullanmadan önceTüm örneklerde mevcut olan tanelerin eşit miktarda olduğu görsel inceleme ile kontrol edin. Gerekirse yeniden örneklerin ve santrifüj bazı tanelerin miktarını ayarlar. Süpernatantlar atın. Peletlendi protein G boncuk rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Kısaca immün kompleksleri santrifüj (örn., Bir antikor, 250 ul ile lizatları) 8000 x g, 30 saniye ve 4 ° C&#39;de borunun alt kısmında tamamen örnek toplamak için. Protein G, boncuklar (50 ul) ile immün kompleksleri aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de bir döner tekerlek üzerinde 60 dakika kuluçkalayın. G proteini tanelerine proteinlerin spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için, bu immün kompleksleri boncuklar ile daha uzun bir süre 75 dakika inkübe etmeyin. </li><li> 8,000 x g&#39;de 30 saniye için (bağlı immün kompleksleri ile), protein G boncuk santrifüj ve 4 ° C ve süpernatantlar çıkarın. Peletlendi protein G boncuk rahatsız etmemek için dikkatli olun. İsteğe bağlı: veya -20, daha sonra analiz için C, 4 ° C &#39;de bu süpernatantlar depolamakÖrneğin, bağlanmamış protein miktarını tahmin etmek. </li><li> Yüksek tuzlu liziz tamponu içinde 900 ul, yaklaşık 5 dakika boyunca, protein G boncuk yıkayın. Boncuklar bütünüyle optimal yıkama için, yıkama tampon maddesi içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş olduğundan emin olun. 8,000 x g&#39;de 30 saniye için, protein G boncuk santrifüj ve 4 ° C ve süpernatantlar atın. Bu yıkama adım 4 kez tekrarlayın. Çökeltilir malzeme kaybını önlemek için topaklandı protein G boncuk rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Son yıkama aşamasından sonra, boncuklara 2x Laemmli numune tampon maddesi 50 ul ve (ko) imüno proteinleri elüte etmek için 95 ° C&#39;de 10 dakika boyunca bir süspansiyon ısıtın. <ol><li> Sodyum dodesil sülfat, 1 g, gliserol ve 3.5 ml 1 M Tris-HCI pH 6.8 ve β-merkaptoetanol ve 420 ul 3.5 ml 6x Laemmli tampon maddesi 10 ml hazırlayın. Damıtılmış su ilave edilerek, 10 ml toplam hacim için ayarlayın. 2x Laemmli tamponu elde etmek üzere distile su içinde 3 kez seyreltilir. DİKKAT: &amp;# 946; mersaptoetanol toksik, hazırlamak ve davlumbaz Laemmli tampon kullanabilirsiniz. </li></ol></li><li> Isıtıldıktan sonra, 8.000 xg&#39;de 30 saniye protein G boncuk santrifüj ve 4 ° C (kısa vadeli) ya da -20 ° C (uzun vadede) ° örnekleri saklamak. </li></ol></li></ol> 4. immunopresipite Proteinler (co-) analiz <ol><li> SDS-PAGE 20 ve 21,22 lekeleme batı hücre lizatı ve ko-immunoprecipitation eluatını mevcut proteinleri gözünüzde canlandırın. Tipik jel üzerinde Laemmli elüatın yarısını yükleyin. Jel yükleme için numune alırken topaklandı protein G boncuk rahatsız etmemek için dikkatli olun. Mx1 ve NP ifade, anti-MX1 ve anti-NP antikoru, sırasıyla 14, bir ile ortaya çıkarılmıştır. bantlar HRP-tabanlı chemiluminescence ve bir X-ışını filmi geliştirici ile tespit edilmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mx+proteins:+antiviral+gatekeepers+that+restrain+the+uninvited.">Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).</li><li>Goujon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+MX2+is+an+interferon-induced+post-entry+inhibitor+of+HIV-1+infection.">Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).</li><li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MX2+is+an+interferon-induced+inhibitor+of+HIV-1+infection.">MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+MxB+protein+inhibits+HIV-1+infection.">The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection.</a> Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+human+MxA+GTPase+blocks+nuclear+import+of+Thogoto+virus+nucleocapsids.">Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).</li><li>Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+interactive+region+of+human+MxA+GTPase+is+involved+in+GTPase+activation+and+interaction+with+viral+target+structures.">The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+(Orthomyxoviridae).">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution-guided+identification+of+antiviral+specificity+determinants+in+the+broadly+acting+interferon-induced+innate+immunity+factor+MxA.">Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).</li><li>Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+antiviral+activity+of+the+human+MxA+protein+against+Thogoto+and+influenza+A+virus.">Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus.</a> J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).</li><li>Turan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+MxA+proteins+form+a+complex+with+influenza+virus+NP+and+inhibit+the+transcription+of+the+engineered+influenza+virus+genome.">Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome.</a> Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).</li><li>Dittmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+strains+differ+in+sensitivity+to+the+antiviral+action+of+Mx-GTPase.">Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase.</a> J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).</li><li>Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viral+nucleoprotein+determines+Mx+sensitivity+of+influenza+A+viruses.">The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses.</a> J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).</li><li>Manz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+influenza+A+viruses+escape+from+restriction+by+human+MxA+through+adaptive+mutations+in+the+nucleoprotein.">Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein.</a> PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).</li><li>Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-inducible+protein+Mx1+inhibits+influenza+virus+by+interfering+with+functional+viral+ribonucleoprotein+complex+assembly.">Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly.</a> J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).</li><li>Brewer, C. F., Riehm, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+possible+nonspecific+reactions+between+N-ethylmaleimide+and+proteins.">Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins.</a> Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).</li><li>Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+ribonucleotide+reductase+M1-gemcitabine+interaction+in+vivo+by+N-ethylmaleimide.">Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide.</a> Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).</li><li>Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dimerization+of+human+MxA+promotes+GTP+hydrolysis,+resulting+in+a+mechanical+power+stroke.">Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke.</a> Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).</li><li>Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+metal-ion-binding+properties+of+the+Ca2+-binding+helix-loop-helix+EF-hand+motifs.">Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs.</a> Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+mouse+Mx+proteins+inhibit+different+steps+of+the+influenza+virus+multiplication+cycle.">Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle.</a> J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Antiviral proteinler ve bunların viral hedeflere arasındaki etkileşimi incelemek bu proteinlerin antiviral mekanizmasının ayrıntılarını anlaşılması çok önemlidir. Bu yeni antiviral stratejilerin geliştirilmesi için temel virüsler ve onların ana-evrimleşmiş eş nasıl yeni anlayışlar vermek ve olabilir. Burada anlatılan optimize ko-immünopresipitasyon protokol fare MX1 protein ve viral hedef, grip NP proteini arasındaki etkileşimi incelemek için izin verir. NP-MX1 etkileşimi NEM (Şeki...

Myxovirus direnci (Mx) proteinler, viral patojenlere karşı doğal bağışıklık savunma önemli bir parçasıdır. Bu proteinler tip I ve tip III interferonlar tarafından indüklenen büyük Dynamin benzeri GTPazlar bulunmaktadır. karşılık gelen Mx genleri, bir ya da birden çok kopya halinde hemen hemen tüm omurgalıların içinde bulunmaktadır ve bunların gen ürünleri Ortomiksoviridae (örn., influenza virüsü), Rhabdoviridae (örn., veziküler stomatit virüsü), Bunyaviridae (örneğin, de dahil olmak üzere, virüslerin bir geniş inhibe eder. la crosse virüsü) ve (örneğin, insan bağışıklık eksikliği virüsü-1), 1-4 Retroviridae. Bu proteinler virüslerin böyle geniş bir dizi tanımak nasıl görünürde herhangi paylaşılan birincil dizisi bu virüsler, motiflerin olmadan, belli değil. Potansiyel, onların viral hedefleri ile Mx proteinlerinin etkileşimi analiz diğer ana hücre faktörleri ile yüksek mertebeden kompleksleri içeren, t moleküler mekanizmalarını anlamak için yardımcı olacaktırşapka virüs ve ev sahipleri arasında silahlanma yarışında gelişmiştir. Memeli Mx proteinleri ve viral hedefler arasındaki etkileşim, insan mxa için en yaygın çalışılmıştır. İnsan MxA ortomiksovirüsler influenza A ve Thogoto virüsü de dahil olmak üzere pek çok virüslerin çoğalmasını inhibe edebilmektedir. MxA böylece enfeksiyon 5 blok sonuçlanır nükleer girişini engelleyen Thogoto virüs ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) bağlanmaktadır. MxA ve Thogoto virüs vRNPs arasındaki bu etkileşim, eş çökeltme ve ko-immünopresipitasyon deneyleri 6-9 ile gösterilmiştir. Mx proteinleri influenza A virüsleri engel Nasıl daha az açıktır. Önemli bir sorun, bir MX proteini ve bir grip gen ürünü arasındaki bir etkileşimi göstermek için açık değildir olmasıdır. Bir rapor influenza A virüs bulaşmış hücreleri 10 insan mxa ve NP proteini arasında bir etkileşim göstermiştir. Bu etkileşim sadece eş-immunopr tarafından gösterilen olabilirecipitation hücre etkileşimi, geçici ve / veya zayıf olduğunu düşündürmektedir, liziz önce çapraz bağlanma belirteci ditiyobis (sukkinimidil propiyonat) ile muamele edilmiş olsaydı. Daha yeni çalışmalar, farklı grip A suşları ayırıcı Mx duyarlılığı NP proteininin 11,12 kökeni ile tespit edildiğini göstermiştir. Bu doğrultuda, influenza A virüsleri kısmen NP proteini 13 özel kalıntıları mutasyona Mx kontrolünden kaçabilir. Böylece, ana Mx için influenza A virüs temel hedefi, büyük olasılıkla NP vRNP kompleksleri monte NP protein olduğunu göstermektedir. Ancak, bu daha yeni çalışmaların hiçbiri grip NP veya vRNPs ve ya insan mxa veya fare MX1 arasında bir etkileşim göstermiştir. Yakın zamanda ilk kez gösterdi burada ayrıntılı olarak tarif edilen bir optimize edilmiş ko-immünopresipitasyon protokolü 14 ile grip NP ve fare MX1 proteini arasındaki etkileşim. Genel co-immunoprecipitation, protein-protein etkileşimi araştırmak için en sık kullanılan biyokimyasal yaklaşımlardan biridir. Bu doğal ortamda, protein-protein etkileşimlerini incelemek sağlar çünkü bu teknik, çoğu zaman, alternatif teknikler, örneğin, maya iki hibrid tercih edilir. Ilgi konusu olan proteinlerin karşı antikorların olup olmadığını ko-immünopresipitasyon endojen olarak ifade edilen proteinleri ile gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, ilgi duyulan proteinlerin transfeksiyon ya da enjeksiyon aracılığıyla hücre içinde eksprese edilebilir ve bir afinite etiketi kullanılabilir. Yukarıda belirtilen avantajlara ilave olarak, tarif edilen ko-immünopresipitasyon protokolü zayıf ve / veya geçici protein etkileşimleri saptanmasını sağlar. Bu optimize edilmiş protokolde ana bileşeni hücre parçalama tamponu içinde, N-etilmaleimit (NEM) eklenmesidir. NEM 6,5-7,5 arasında bir pH değerinde, örneğin sistein, mevcut serbest tiyol grupları ile reaksiyona giren bir alkile edici bir madde, sabit bir tiyo-ester oluşturmak üzere(Şekil 1). Yüksek bir pH&#39;de, NEM da amino grupları ile reaksiyona giren ya da hidroliz 15 uğrayabilir. NEM tipik haliyle disülfid bağı oluşumunu önlemek ya da enzimatik aktivitesini inhibe etmek için, serbest tiyol gruplarını bloke etmek için kullanılır. Örneğin, NEM, genellikle sistein proteazlarıdır, ki desumoylating enzimler, bloke edilmesi için kullanılmaktadır. Grip proteinleri sumoylation viral proteinlere 16 arasındaki etkileşimi etkileyebileceği bildirilmiştir çünkü tarif edilen ko-immünopresipitasyon protokolde, NEM ilk liziz tamponuna dahil edildi. Beklenmedik, Milli Ekonomi Modeli&#39;nde eklenmesi eş immunopresipitasyon influenza NP ve fare MX1 arasındaki etkileşimi belgelemek için anahtar olduğunu kanıtladı. Milli Ekonomi Modeli&#39;nde eklenmesi NP-MX1 etkileşimini tespit etmek önemlidir nedeni belli değildir. Muhtemelen etkileşim çok geçici ve / veya zayıf. NEM MX1 belirli bir konformasyon, bir viral protein ya da bilinmeyen bir üçüncü alçı koruyarak, örneğin etkileşimi, stabilize olabilirDaimi. NEM gibi bir stabilize edici etkisi ribonükleotid redüktaz M1 ve inhibitör gemsitabin (F2dC) 17 arasındaki etkileşim için, örneğin, daha önce tespit edilmiştir. MX1 ve NP hem NEM tarafından değiştirilebilir çoklu sistein artıklarını ihtiva etmektedir. Örneğin, Rennie&#39;yle ve ark. Tarafından yapılan bir çalışmada, sapsız MxA varyantı iyodoasetamit ile modifiye edilebilir, üç çözücüye maruz kalan sistein artıklarını ihtiva ettiğini ortaya çıkarmıştır. Serinler, bu kalıntıların mutasyona tâbi mXA enzimatik aktivitesini etkileyebilir fakat disülfitin aracı toplanmasını 18 engelledi değildi. Bu sisteinler MX1 ​​muhafaza edilir, bu MX1 analog sisteinler NEM tarafından, bu etkinin de uyum ve çözünürlük gibi modifiye edilebileceğini de önermektedir. Buna ek olarak, NEM da MX1 anti-influenza aktivitesi için gerekli olan MX1, bir GTPaz aktivitesini etkiler ve böylece MX1 ve NP arasındaki etkileşimi sabitleme olabilir. Ancak, GTPaz acti tarihinde NEM doğrudan etkisiNEM grip NP ve GTPaz MX1 proteininin 14 inaktif mutantlar arasındaki etkileşimi tespit etmek için gerekli olduğu gibi MX1 ve vite, olası değildir. Açıkçası, daha fazla araştırma NP-MX1 etkileşim NEM etkisini çözülmeye ihtiyaç vardır. Özet olarak, tarif edilen ko-immünopresipitasyon protokolü antiviral MX1 proteini ve bunun viral hedef influenza NP proteininin etkileşimini çalışma sağlar. Bu protokol, aynı zamanda, belirli protein şeklindeki stabilizasyonu bağımlı olan diğer zayıf ya da geçici etkileşimler üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Belirli düzenlemelere bağlı protein-protein etkileşimi gibi kalmodulin 19 kalsiyum-bağlayıcı proteinler, örneğin, daha önce tarif edilmiştir. Son olarak, NEM uygun rolü, aynı zamanda, eş çökeltme tahlilleri gibi protein-protein etkileşimlerini tespit diğer yöntemler de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>DMEM high glucose</td><td>Gibco</td><td>52100-047</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E-3876</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I-30212</td><td>also known as NP40</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>anti-NP monoclonal antibody</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-4282</td><td>ascites blend of clones A1 and A3</td></tr><tr><td>anti-RNP polyclonal serum</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-3133</td><td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4FF</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9068-36</td><td></td></tr><tr><td>ECL western blotting substrate</td><td>Pierce</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-etilmaleimit sistein proteazlarını geri dönülmez (Şekil 1) önlenmesi için, örneğin, serbest tiyol gruplarını düzenlemek için kullanılabilecek bir organik bileşiktir. Antiviral MX1 proteini influenza virüs nükleoprotein ile etkileşerek bir virüs çoğalmasını engeller. Burada anlatılan optimize ko-immünopresipitasyon protokolü bu NP-MX1 etkileşim çalışma sağlar. HEK293T hücreleri grip NP proteininin varlığı veya yokluğu antiviral M...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein at JoVE.com

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

co-immunoprecipitation-mouse-mx1-protein-with-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Görüntüleme.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Video: Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Biyokimya

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biyoloji

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

Virüs subtypes arasında serum antikorların genişliğini ölçmek için bir Influenza antijen microarray kullanımı

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.