이 작품은 FWO - 데런, IOF 프로젝트 IOF10 / StarTT / 027 및 겐트 대학교 특별 연구비 BOF12 / GOA / 014에 의해 지원되었다.

참고 : 다음 형질과 공동 면역 프로토콜 9cm 페트리 접시의 형식이 설정됩니다. 다른 포맷은 프로토콜들을 스케일링 한 후도 가능하다. 1. 시드 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 및 2 mM L- 글루타민, 0.4 mM의 나트륨 피루 베이트로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 12 ㎖ 중의 9cm 페트리 접시 당 1.2 × 106 세포에 형질 감염 전에 HEK293T 세포 하루 시드 0.1 mM 비 필수 아미노산, 100 U / ml의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신. </li><li> 세포를 37 ℃에서 16 시간, 5 % CO 2를 성장. </li><li> 시각적으로 형질 전환 전에 거꾸로 광학 현미경으로 형태 및 세포의 생존 능력을 검사합니다. 세포는 최적의 효율을위한 형질 서브 컨 플루 언트가 될 필요가있다. </li></ol> HEK293T 세포 2. 칼슘 - 포스페이트 형질 주의: 사용 0.5 pCAXL-NP 또는 9cm 접시 당 pCAXL-MX1의 1-3 μg의와 함께 빈 pCAXL 플라스미드의 μg의. 모든 시료에서 총 플라스미드 DNA의 동일한 양을 사용하여; 빈 플라스미드 필요하다면 조정합니다. <ol><li> 다음 형질 버퍼를 준비합니다 <ol><li> 1.0 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0와 0.1 mM의 EDTA의 pH 8.0의 농도 트리스 EDTA (TE)를 준비합니다. </li><li> 25 mM의 HEPES 농도와 BS / HEPES 준비 (5.96 g / L, 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산), 274 mM의 염화나트륨 (16g / L), 10 mM의 KCl을 (0.74 g / L), 1.5 mM의 NaHPO 4 · 12H 2 O (0.5 g / L) 11.1 MM의 포도당 (2g / ℓ). 7.05의 pH를 조정합니다. </li><li> 1.25 M 염화칼슘 2 · 2H 2 O (183.8 g / L), 125 mM의 HEPES (29.79 g / L)의 농도의 염화칼슘 2 / HEPES를 준비합니다. NaOH로 7.05의 pH를 조정합니다. </li></ol></li><li> 사용 전에 37 ℃에서 형질 버퍼 따뜻한. </li><li> TE 600 μL의 플라스미드 DNA를 플라스미드 희석하여 샘플을 준비한다.6 잘 판의 우물에서 이러한 혼합물을 준비합니다. </li><li> 플라스미드 샘플에 적가 방식으로 염화칼슘 2 / HEPES 150 μl를 추가하고 위아래로 3 회 피펫 팅하여 혼합한다. </li><li> (750 ㎕의 TE + DNA + 염화칼슘 2 / HEPES) 신선한 6 웰 플레이트에 제공 BS / HEPES 완충액 750 μL에 현명한 플라스미드 용액을 첨가 강하에 의한 형질 전환 솔루션을 준비합니다. 전체도 포함 BS / HEPES 버퍼 고르게 플라스미드 솔루션을 배포합니다. </li><li> 1,000 RPM에서 90 초 동안 플레이트 진탕에 형질 전환 솔루션을 흔들어. </li><li> 실온에서 5 분 동안 혼합물을 배양한다. </li><li> 형질 용액 (1.5 ml)을 세포에 적가를 추가합니다. 세포에 형질 전환 솔루션을 물방울 P1000의 마이크로 피펫을 사용합니다. 전체 9cm 페트리 접시 위에 혼합물을 분산 매우 부드럽게 판을 흔들어. </li><li> 6 시간 동안 CO (2)을 37 ° C에서 배양 한 세포를 5 %. 그런 열망으로 매체를 제거하고 즉시 위스콘신 교체12 ml의 신선한, 예열 매체 번째. 부드럽게 세포 박리를 방지하기 위해 세포에 새로운 배지를 추가한다. 이를 위해, 잘의 측면에 피펫의 끝을 잡고 부드럽게 매체를 밀어. </li><li> 37 ℃에서 추가로 16 시간 동안 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO 2. </li></ol> 3. 공동 면역 침전 참고 : 형질 전환 후 공동 면역 24 시간을 수행합니다. <ol><li> 저염 용해 완충액과 염분 세척 완충액의 제조. <ol><li> NEM의 양을 계량하고 무수 에탄올에 용해시켜 2 M-N 에틸 말레이 미드 (NEM)의 스톡 용액을 준비한다. 사용하기 전에 신선한 NEM 주식 솔루션을 준비합니다. 주의 : NEM은 매우 독성이 준비하고 흄 후드에서이 원액을 사용합니다. </li><li> 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 % NP40 및 프로테아제 저해제 칵테일의 농도에서 저염 용해 완충액을 제조 (표 1을 용해50 ml의 용해 완충액 t). 25 mM의 (즉, 1:80 희석)의 최종 농도 NEM을 추가합니다. 프로테아제 억제제 및 NEM을 추가 한 후 얼음에 보관하십시오. 참고 : 항상 사용 전에 갓 프로테아제 억제제 및 NEM을 추가합니다. </li><li> 50 mM 트리스 - 염산의 pH 8, 500 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA와 1 % NP40의 농도에서 높은 소금 세척 버퍼를 준비합니다. 높은 소금 세척 버퍼가 NEM을 포함하지 않습니다. </li></ol></li><li> 세포 용 해물의 준비. <ol><li> 매체를 제거하고 차가운 얼음 인산염 완충 생리 식염수 2 ㎖ (PBS)와 세포를 씻으십시오. HEK293T 세포가 쉽게 분리로 아주 부드럽게 세척 버퍼를 추가합니다. </li><li> PBS를 제거하고 9cm 페트리 접시 당 차가운 얼음 낮은 소금 용해 버퍼 600 μl를 추가합니다. </li><li> 얼음에 20 분 동안 접시를 품어. 플레이트가 수평 유지되도록 용해 버퍼와 함께 접시 표면의 완전한 범위를 보장하기 위해, 확인하십시오. 부드럽게 5 분마다 판을 흔들. </li><li> 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리에 세포 용 해물을 모아서4 ° C에서 3 분 16,000 XG 용 튜브와 원심 분리기는 불용성 부분을 펠렛. </li><li> 신선한 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 용 해물 즉, 가용 분을 전송하고 얼음에 보관하십시오. 즉시 상호 작용 단백질의 분리를 방지하기 위해, 공동 면역 침전 프로토콜에 계속. 해물에서 단백질 분해 활동을 제한하기 위해 얼음에 가능한 한 많이 또는 4 ° C에서 다음의 모든 단계를 수행합니다. </li></ol></li><li> 면역 복합체의 생성. 주 :이 단계에서, 관심있는 단백질이 적절한 항체에 의해 결합된다. NP-MX1 상호 작용을 연구하기 위해, 마우스 항 NP 모노클로 날 항체를 사용한다. <ol><li> 각 샘플에 대해, 항 NP 모노클로 날 항체와 2㎕의 저염 용해 완충액 (250 ㎕의 총 부피) 113 μL와 해물을 135 μL를 혼합한다. 같은 서양 모래 바닥으로 추가 분석을 위해 -20 ° C에서 나머지 해물을 저장 추측 INTERA의 발현 수준을 문서화형질 감염된 세포에서 ction의 파트너. 주 : 대안 적으로, 각각의 파쇄물을 위해, 예를 들어, 400 μg의를 (브래드 포드 (Bradford) 시약 등) 용 해물의 단백질 농도를 측정하고, 전체 단백질의 정량을 사용한다. </li><li> 4 ° C에서 회전 바퀴에 3 시간 동안 항체 해물 믹스를 품어. 이 단계는 밤새 인큐베이션로 확장 될 수있다. </li></ol></li><li> 단백질 G 비즈의 준비. 주 : 단백질 G 비드 배송 및 보존은 20 % 에탄올에 저장된다. 비드 슬러리는 일반적으로 50 %의 구슬로 구성되어 있으며이 면역 복합체를 면역 침전 사용하기 전에이 구슬을 세척 할 필요가있다. <ol><li> 각 샘플에 대해, 즉 구슬, 50 μL, 비드 슬러리 100 μl를 사용합니다. 하나의 튜브에서 공동 면역 침전 분석에서 모든 샘플에 필요한 비드의 양을 씻는다. 비드 슬러리의 피펫을 완화하기 위해 1 ML의 피펫 팁의 끝을 잘라. </li><li> 8000 X에서 단백질 G의 비드 슬러리를 원심 분리기g 30 초 동안 4 ° C. 에탄올 용액을 제거하고 낮은 소금 용해 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다. 원심 분리기 단백질 G의 8000 XG에 비드 슬러리를 30 초 동안 4 ° C 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 이 세척 단계를 3 번​​ 반복합니다. 주 : 프로테아제 억제제 또는 NEM을 포함 할 필요가없는 비드 세척하는데 사용 저염 용해 완충액. </li><li> 단백질 G 비드의 양을 추정하고 저염 용해 완충액 중 동일한 부피는 저염 용해 버퍼에 새로운 50 % 비드 슬러리를 만들기 위해 추가. </li><li> 각 샘플의 경우, 신선한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 비드 슬러리 100 μl를 전송하고 사용할 때까지 얼음에 저장합니다. 이 구슬 신속하게 튜브의 바닥에 침전으로, 분할하기 전에 비드 슬러리를 재현 탁주의하십시오. </li></ol></li><li> 단백질 G 비즈과 용출에 의한 면역 복합체의 면역. <ol><li> 원심 분리기 모든 튜브 30 초 8,000 XG에 4 ° C와에게 면역의 단백질 G 비즈를 사용하기 전에모든 샘플에 존재하는 비드의 동일한 양이 있는지 육안으로 확인한다. 필요한 경우 다시 샘플 및 원심 분리기의 일부에 비드의 양을 조정한다. 상층 액을 버린다. 펠렛 단백질 G 비즈를 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 간단히 면역 복합체를 원심 분리 (예., 항체, 250 μL와 해물) 8,000 XG에 30 초, 4 ° C에 대한 튜브의 하단에 전체 샘플을 수집합니다. 단백질 G 비즈 (50 μL)에 면역 복합체를 전송합니다. </li><li> 4 ° C에서 회전 휠에 60 분을 품어. 단백질 G 비즈에 단백질의 비특이적 결합을 줄이기 위해 이러한 면역 복합체에게 구슬 이상 75 분을 배양하지 마십시오. </li><li> 8000 XG에 30 초 (결합 된 면역 복합체와) 단백질 G 비즈를 원심 분리기 4 ° C와 상층 액을 제거합니다. 펠렛 단백질 G 비즈를 방해하지 않도록주의하십시오. 선택 사항 : -20 나중에 분석을위한 ° C ~ 41 ° C에서이 상층 액을 저장,예를 들면, 결합되지 않은 단백질의 양을 추정한다. </li><li> 높은 소금 용해 버퍼 900 μL와 약 5 분 동안 단백질 G 비즈를 씻으십시오. 구슬이 완전히 최적의 세척 세척 완충액되어 있는지 확인합니다. 8000 XG에 30 초 동안 단백질 G 비즈를 원심 분리기 4 ° C와 상층 액을 버린다. 이 세척 단계를 4 회 반복한다. 면역 물질의 손실을 방지하기 위해 펠렛 단백질 G 비즈를 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 마지막 세척 단계 후, 비드에 배를 Laemmli 샘플 완충액 50 μL를 추가 한 (공) 면역 침전 된 단백질을 용리 95 ° C에서 10 분 동안 현탁액을 가열한다. <ol><li> 도데 실 황산나트륨 1g의 글리세롤 3.5 ㎖, 1 M 트리스 -HCl pH를 6.8 및 β 머​​ 캅토 에탄올 420 ㎕를 3.5 ml의 6 배를 Laemmli 완충액 10 ㎖를 준비한다. 증류수를 첨가하여 10 ㎖의 전체 부피로 조정한다. 배를 Laemmli 완충액을 얻었다 증류수 3 회 희석. 주의 : &amp;# 946; 머 캅토 에탄올은 독성이 준비하고 흄 후드에서 램 믈리 버퍼를 사용합니다. </li></ol></li><li> 가열 후, 8000 XG에 30 초 동안 단백질 G 비즈를 원심 분리기 4 ° C (단기) 또는 -20 C (장기) °에서 샘플을 저장합니다. </li></ol></li></ol> 4. 면역 단백질을 (공을) 분석 <ol><li> SDS-PAGE (21, 22) (20) 및 웨스턴 블 롯팅에 의한 세포 용 해물과 공동 면역 침전의 용출 물에 존재하는 단백질을 시각화. 일반적으로 겔에 램 믈리 용출의 절반을로드합니다. 젤 로딩 샘플을 채취 할 때 펠렛 단백질 G 비즈를 방해하지 않도록주의하십시오. MX1과 순이익 발현은 안티 MX1 및 안티 NP 항체, 각각 14와 함께 공개했다. 밴드 계 화학 발광 HRP 및 X 선 필름 현상액으로 검출 하였다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

바이러스 단백질 및 바이러스 표적 사이의 상호 작용을 연구하는 이들 단백질의 항 바이러스기구의 상세를 이해하는 것이 매우 중요하다. 이 새로운 항 바이러스 전략의 개발을위한 기초를 바이러스 및 그들의 호스트가 진화 공동 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 최적화 공동 면역 침전 프로토콜 마우스 MX1 단백질 및 그 대상 바이러스, 인플루엔자 NP 단백질 사?...

믹소 바이러스 저항 (MX) 단백질은 바이러스 성 병원체에 대한 선천성 면역 방어의 중요한 부분입니다. 이 단백질은 유형 I 및 유형 III 인터페론에 의해 유도되는 큰 dynamin 같은 GTP 아제 있습니다. 대응 MX 유전자는 하나 또는 여러 복사본 거의 모든 척추 동물에 존재하고 이들 유전자 산물은 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae) (예., 인플루엔자 바이러스), Rhabdoviridae (예., 수 포성 구내염 바이러스), Bunyaviridae (예를 포함한 광범위한 바이러스를 억제한다. , 라크로스 바이러스)와 (예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스 1) 1-4 Retroviridae. 이 단백질은 바이러스와 같은 광범위한 인식 방법 명백한 공유 기본 순서가이 바이러스에 모티브없이 그것은 불분명하다. 잠재적으로 그들의 타겟을 갖는 MX 바이러스 단백질의 상호 작용을 분석하는 다른 숙주 세포 인자 고차 복합체를 포함하는, t 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 것모자는 바이러스 및 호스트 사이의 군비 경쟁에 진화했다. MX 포유류 단백질과 바이러스 표적 사이의 상호 작용은 인간 MXA 위해 가장 광범위하게 연구되어왔다. 인간의 MXA는 orthomyxoviruses 인플루엔자 A와 Thogoto 바이러스를 포함한 많은 바이러스의 복제를 억제 할 수 있습니다. MXA하여 감염 5 블록 결과 핵 항목을 방지 Thogoto 바이러스 리보 핵산 단백질 복합체 (vRNPs)를 결합한다. MXA 및 Thogoto 바이러스 vRNPs 간의 상호 작용은 공동 침전 및 공동 면역 침전 실험 6-9으로 증명되었다. MX 단백질은 인플루엔자 바이러스를 방해하는 방법이 명확하지 않을 수도 있습니다. 하나의 주요 문제는 MX 단백질 및 인플루엔자 유전자 생성물 간의 상호 작용을 보여주기 위해 간단하지 않다는 것이다. 한 보고서는 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포 (10) 인간의 MXA 및 NP 단백질 사이의 상호 작용을 보여 주었다. 이러한 상호 작용은 공동 immunopr으로 표시 할 수있다ecipitation 세포 상호 작용이 과도 및 / 또는 약한 것을 시사 용해 전의 가교 시약 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)로 처리 된 경우. 보다 최근의 연구는 다른 인플루엔자 균주 차동 MX 감도 11,12 NP 단백질의 기원에 의해 결정된다는 것을 보여 주었다. 이와 라인에서, 인플루엔자 바이러스는 부분적으로 NP 단백질 (13)의 특정 잔류 물을 돌연변이에 의해 MX 컨트롤에서 탈출 할 수 있습니다. 이것은 호스트 MX 대 인플루엔자 바이러스의 주요 목표는 NP는 아마도 vRNP 착체에 조립 NP 단백질임을 시사한다. 그러나 이러한 최근의 연구 중 어느 것도 인플루엔자 NP 또는 vRNPs 및 중 인간의 MXA 또는 마우스 MX1 사이의 상호 작용을 보여 주었다 없습니다. 최근 우리가 처음으로 보여, 여기에 상세하게 설명되어 최적화 된 공동 면역 침전 프로토콜 (14)을 가진 인플루엔자 NP 및 마우스 MX1 단백질 사이의 상호 작용. 일반적으로, 공동 난에서mmunoprecipitation은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 가장 자주 사용되는 생화학 적 방법 중 하나이다. 그들의 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사 할 수 때문에이 기술은 종종 다른 기술, 예를 들면, 효모 두 하이브리드보다 선호된다. 관심의 단백질에 대한 항체를 사용할 수있는 경우 공동 면역 침전은 내생 발현 된 단백질에서 수행 될 수있다. 대안 적으로, 관심있는 단백질은 형질 감염 또는 감염을 통해 세포 내에서 발현 될 수 있으며, 친 화성 태그가 사용될 수있다. 상술 한 이점 이외에, 설명한 공동 면역 침전 프로토콜 약한​​ 및 / 또는 과도 단백질 상호 작용의 검출을 허용한다. 이 프로토콜의 최적화 된 주성분은 세포 용해 완충액에서 N-에틸 말레이 미드 (NEM)의 추가이다. NEM가 6.5-7.5의 pH에​​서, 예컨대 시스테인의 존재 자유 티올 기와 반응하여 알킬화 시약, 안정한 티오 에스테르를 형성(그림 1). 더 높은 pH에서, NEM은 아미노기와 반응하여 가수 분해를 15 겪을 수있다. NEM는 통상적으로 다이 설파이드 결합 형성을 방지 또는 효소 활성을 억제하기 위해, 자유 티올기를 차단하는 데 사용된다. 예를 들어, NEM은 종종 시스테인 프로테아제 desumoylating 효소를 차단하는 데 사용됩니다. 이 인플루엔자의 단백질은 바이러스 단백질 sumoylation (16) 사이의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 것으로 알려져 있었기 때문에 기재된 공동 면역 침전 프로토콜에서, NEM는 초기 용해 완충액에 포함시켰다. 예기치 않게, NEM의 첨가는 동시 면역에 의한 인플루엔자 NP MX1 및 마우스의 상호 작용을 문서화 키 것으로 판명. NEM의 첨가는 NP-MX1 상호 작용을 검출하는 것이 중요한 이유는 불분명하다. 아마도 상호 작용이 너무 과도 및 / 또는 약합니다. NEM MX1은 특정 형태의, 바이러스 단백질 또는 알 셋째 콤포넌트를 보존함으로써, 예를 들면 상호 작용을 안정화 할 수NENT. NEM 그러한 안정화 효과는 M1, 리보 뉴클레오티드 리덕 타제 억제제 및 젬시 타빈 (F2dC) (17) 사이의 상호 작용, 예를 들면, 이전에 관찰되었다. MX1과 순이익은 모두 NEM에 의해 수정 될 수있는 여러 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 레니 외.의 최근 연구는 stalkless MXA-변형 요오도 아세트 아미드에 의해 수정 될 수있는 세 가지 용매에 노출 시스테인 잔기를 포함 보여 주었다. 세린 이러한 잔류 돌연변이은 MXA의 효소 활성에 영향을 미칠하지만, 이황화 매개 응집 (18)을 방해하지 않았다. 이들 시스테인이 MX1에 보존되기 때문에, 이것은 MX1에서 유사한 시스테인 NEM으로 이러한 영향의 형태 또는 용해도 같이 변형 될 수 있음을 시사한다. 또한,도 NEM MX1의 항 인플루엔자 활성에 필수적이다 MX1,는 GTPase의 활성에 영향을 주며 이에 MX1과 NP 사이의 상호 작용을 안정화 할 수 있습니다. 그러나,는 GTPase ACTI에 NEM의 직접적인 영향NEM 또한 인플루엔자 NP와는 GTPase MX1 단백질 돌연변이 체 (14)의 비활성 상태 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 요구되는대로의 MX1 vity는 어렵다. 분명히, 더 많은 연구가 NP-MX1 NEM에 상호 작용의 효과를 해명하는데 필요하다. 요약하면, 상술 한 공동 면역 침전 프로토콜 MX1 바이러스 단백질 및 그 대상 바이러스, 인플루엔자 NP 단백질 사이의 상호 작용을 연구 할 수있다. 이 프로토콜은 또한 특정 단백질의 입체 형태에 의존하는 다른 안정화 약하거나 과도 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다. 입체 형태에 의존하는 특정 단백질 - 단백질 상호 작용은 칼 모둘 린 (19) 칼슘 결합 단백질, 예를 들면, 이전에 설명되었다. 마지막으로, NEM의 유익한 역할은 또한 공동 침전 분석법 등의 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 다른 방법에서 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM high glucose</td><td>Gibco</td><td>52100-047</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E-3876</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I-30212</td><td>also known as NP40</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>anti-NP monoclonal antibody</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-4282</td><td>ascites blend of clones A1 and A3</td></tr><tr><td>anti-RNP polyclonal serum</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-3133</td><td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4FF</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9068-36</td><td></td></tr><tr><td>ECL western blotting substrate</td><td>Pierce</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N - 에틸 말레이 비가 역적 시스테인 프로테아제 (도 1)를 억제하는 예를 자유 티올기를 수정할 수있다 유기 화합물이다. 바이러스 MX1 단백질은 인플루엔자에게 바이러스의 핵 단백질과 상호 작용하여 바이러스 복제를 억제한다. 여기에 설명 된 최적화 된 공동 면역 프로토콜이 NP-MX1의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. HEK293T 세포는 인플루엔자 NP 단백질?...

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K 조회수.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

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Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

연구

생화학

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

면역학 및 감염병학

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

생물학

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.