עבודה זו נתמכה על ידי FWO-Vlaanderen, פרויקט צבא IOF10 / StarTT / 027 ואוניברסיטת גנט מיוחדת מענק מחקר BOF12 / גואה / 014.

הערה: פרוטוקול transfection ושיתוף immunoprecipitation הבא נקבע לפורמט צלחת פטרי 9 סנטימטרים. פורמטים אחרים גם אפשריים לאחר שטפס על הפרוטוקול. 1. הכליה העוברית האנושי תאי 293T זריעה (HEK) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי יום אחד תאי HEK293T לפני transfection 1.2 x 10 6 תאים לכל 9 סנטימטר צלחת פטרי ב 12 מיליליטר של המדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 0.4 מ&quot;מ Na-פירובט, 0.1 מ&quot;מ חומצות אמינו שאינו חיוניים, 100 U / ml פניצילין ו 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התאים 16 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק את המורפולוגיה ויכולת קיום של התאים עם מיקרוסקופ אור הפוכה לפני transfection. התאים צריכים להיות תת-ומחוברות ליעילות transfection אופטימלית. </li></ol> 2. Transfection סידן-פוספט של תאי HEK293T הערה: השתמש 0.5-1 מיקרוגרם של pCAXL-NP או פלסמיד pCAXL הריק בשילוב עם 1-3 מיקרוגרם של pCAXL-MX1 לכל צלחת סנטימטר 9. השתמש בכמות שווה של DNA פלסמיד הכולל בכל הדגימות; להתאים עם פלסמיד הריק במידת צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מאגרי transfection הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-EDTA (TE) עם ריכוזים של 1.0 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.0 ו -0.1 מ&quot;מ EDTA pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BS / HEPES עם ריכוזים של 25 מ&quot;מ HEPES (5.96 גר &#39;/ ליטר, 4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic), 274 מ&quot;מ NaCl (16 גר&#39; / ל &#39;), 10 מ&quot;מ KCl (0.74 גר&#39; / ליטר), 1.5 מ&quot;מ NaHPO 4 · 12H 2 O (0.5 g / L) ודקסטרוז 11.1 מ&quot;מ (L / 2 ז). התאם ל- pH 7.05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CaCl 2 / HEPES עם ריכוזים של 1.25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183.8 g / L) ו- 125 מ&quot;מ HEPES (29.79 g / L). התאם ל- pH 7.05 עם NaOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את מאגרי transfection על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את דגימות פלסמיד על ידי דילול DNA פלסמיד ב600 μl של TE.הכן תערובות אלה בבארות של צלחת 6-גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl של CaCl 2 / HEPES באופן מושכל ירידה לדגימות פלסמיד ומערבבים על ידי pipetting 3 פעמים למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון transfection אחר טיפה חכמה הוספת פתרון פלסמיד (TE + DNA + CaCl 2 / HEPES; 750 μl) 750 μl של חיץ BS / HEPES ניתן בצלחת 6-גם טרי. להפיץ את הפתרון באופן שווה על פלסמיד BS החיץ / HEPES המכיל גם המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את פתרון transfection על שייקר צלחת למשך 90 שניות ב 1000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את פתרון transfection (1.5 מיליליטר) שחרר חכם לתאים. השתמש micropipet P1000 לטפטף פתרון transfection בתאים. לפזר את התערובת על צלחת פטרי 9 סנטימטרים השלם ולנער את הצלחת בעדינות רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 6 שעות. לאחר מכן להסיר את המדיום על ידי שאיפה ולהחליף wi מיידה בינונית טרי, מחומם מראש 12 מיליליטר. בעדינות להוסיף בינוני הטרי לתאים כדי למנוע ניתוק תא. לשם כך, מחזיק את קצה pipet נגד הצד השני של הבאר ודחף בעדינות את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 16 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 3. Co-immunoprecipitation הערה: בצע את שיתוף immunoprecipitation 24 שעות לאחר transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר תמוגה מלח הנמוך ולשטוף חיץ מלח גבוה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של 2 M N-ethylmaleimide (Nem) על ידי שקילת הסכום של nem ופירוקה באתנול המוחלט. הכן את פתרון מניות nem הטרי לפני השימוש. זהירות: nem הוא רעיל מאוד, להכין ולהשתמש בפתרון זה המניה במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה מלח נמוך בריכוזים של 50 מ&quot;מ טריס pH-HCl 8, 150 מ&quot;מ NaCl, חומצת ethylenediaminetetraacetic 5 מ&quot;מ (EDTA), 1% NP40 ומעכבי פרוטאז קוקטייל (לפזר שולחן 1t במאגר תמוגה 50 מיליליטר). להוסיף nem לריכוז סופי של 25 מ&quot;מ (כלומר, לדלל 1:80). שמור על קרח לאחר הוספת מעכבי פרוטאז וnem. הערה: תמיד להוסיף מעכבי פרוטאז וnem טריים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף חיץ מלח גבוה בריכוזים של 50 מ&quot;מ טריס pH-HCl 8, 500 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ EDTA וNP40 1%. שים לב שהחיץ לשטוף מלח הגבוה אינו מכיל nem. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת lysates תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט הקר כקרח (PBS). מאוד בעדינות להוסיף את החיץ לשטוף, כמו תאי HEK293T לנתק בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ולהוסיף 600 μl של חיץ נמוך קר כקרח תמוגה מלח ל9 סנטימטר צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות במשך 20 דקות על קרח. לוודא כי הצלחות נשמרות אופקית, כדי להבטיח כיסוי של פני השטח הצלחת עם חיץ תמוגה מלא. נער בעדינות את הצלחות כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את lysate התא בmicrocentrifuge 1.5 מיליליטרצינור ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 4 ° C ו16,000 XG כדי גלולה חלק בלתי הפתיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת החלק המסיס, כלומר lysate לתא צינור microcentrifuge טרי 1.5 מ&quot;ל ולשמור על קרח. מייד להמשיך בפרוטוקול שיתוף immunoprecipitation, כדי למנוע ניתוק של חלבוני האינטראקציה. לבצע את כל השלבים עד כמה שניתן על קרח או על 4 מעלות צלזיוס הבאות כדי להגביל את פעילות מפרקי חלבונים בlysates. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דור של חיסון-מתחמים. הערה: בשלב זה, החלבון של עניין קשור בנוגדן המתאים. כדי לחקור את האינטראקציה NP-MX1, להשתמש נוגדן חד שבטי עכבר אנטי-NP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, לערבב 135 μl של lysate עם 2 μl של נוגדנים חד שבטיים אנטי-NP וμl 113 של חיץ הנמוך תמוגה מלח (נפח כולל של 250 μl). אחסן את lysate שנותר ב -20 ° C לניתוח נוסף כגון מערבי סופג, כדי לתעד את רמות הביטוי של Intera ניחששותפי ction בתאי transfected. הערה: לחלופין, למדוד את ריכוז החלבון של lysate (למשל עם מגיב ברדפורד) ולהשתמש בסכום קבוע של חלבון כולל, למשל, 400 מיקרוגרם, עבור כל lysate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תמהיל הנוגדנים lysate במשך 3 שעות על גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס. צעד זה יכול להתארך עד דגירה לילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חרוזים חלבון G. הערה: חרוזים החלבון G נשלחים ומאוחסנים ב -20% אתנול לשימור. חרוז-slurry בדרך כלל מורכב מחרוזי 50% וחרוזים האלה צריכים לשטוף לפני שהם משמשים לimmunoprecipitate חיסוניים-מתחמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 50 μl של חרוזים, כלומר, של חרוז-slurry 100 μl, עבור כל דגימה. שטוף את הסכום של חרוזים הנדרשים לכל הדגימות בassay שיתוף immunoprecipitation בצינור אחד. חותך את הקצה של קצה פיפטה 1 מיליליטר כדי להקל pipetting של חרוז-התרחיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוז-slurry החלבון G ב 8000 xg ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. הסר את פתרון אתנול ולהוסיף נפח שווה של חיץ תמוגה מלח נמוך. צנטריפוגה חלבון חרוז-slurry G ב 8000 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ולהסיר את supernatant בעדינות. חזור על שלב זה לשטוף 3 פעמים. הערה: מאגר תמוגה מלח הנמוך המשמש ללשטוף את החרוזים לא צריך לכלול מעכבי פרוטאז או nem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמוד את היקף חרוזים חלבון G ולהוסיף נפח שווה של חיץ תמוגה מלח נמוך כדי להפוך 50% חרוז-זבל חדש במאגר תמוגה מלח נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, העברת חרוז-slurry 100 μl בצינור microcentrifuge טרי 1.5 מיליליטר ולאחסן על קרח עד לשימוש. להיות זהיר כדי resuspend חרוז-slurry לפני החלוקה, כחרוזים אלה משקעים במהירות לחלק התחתון של הצינור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunoprecipitation של חיסון-המתחמים ידי חלבון G חרוזים וelution. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש בחרוזי החלבון G לimmunoprecipitation, צנטריפוגה כל הצינורות 30 שניות ב 8000 XG ו -4 ° C ולוודא על ידי בדיקה ויזואלית שיש כמות שווה של חרוזים נוכחת בכל הדגימות. אם יש צורך להתאים את כמות חרוזים בחלק מהדגימות ו צנטריפוגות שוב. מחק את supernatants. היזהר שלא להפריע את חרוזים חלבון G pelleted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות חיסוניים-המתחמים (כלומר., Lysates עם נוגדן, 250 μl) למשך 30 שניות ב 8000 XG ו4 ° C כדי לאסוף את המדגם המלא בחלק התחתון של הצינור. העבר את החיסון-הקומפלקסים לחרוזי חלבון G (50 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 60 דקות על גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס. אל דגירה מתחמים חיסוניים אלה דקות ארוכות מ -75 עם חרוזים כדי להפחית מחייב ספציפי של חלבונים לחרוזי חלבון G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוזים חלבון G (עם חיסון מתחמים מאוגדים) למשך 30 שניות ב 8000 XG ו4 ° C ולהסיר supernatants. היזהר שלא להפריע את חרוזים חלבון G pelleted. אופציונאלי: לאחסן זה supernatants על 4 מעלות צלזיוס או -20 ° C לניתוח מאוחר יותר,לדוגמא, כדי לאמוד את כמות החלבון מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את חרוזי חלבון G לכ 5 דקות עם 900 μl של חיץ תמוגה מלח גבוה. ודא שהחרוזים הם resuspended לחלוטין בחיץ לשטוף שטיפה אופטימלית. צנטריפוגה חלבון G חרוזים למשך 30 שניות ב 8000 XG ו4 ° C וזורקים את supernatants. חזור על שלב זה לשטוף 4 פעמים. היזהר שלא להפריע את חרוזים החלבון G pelleted כדי למנוע אובדן של חומר immunoprecipitated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב לשטוף האחרון, להוסיף 50 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x לחרוזים ולחמם את ההשעיה למשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס לelute חלבונים (במשותף) immunoprecipitated. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיליליטר של חיץ 6x Laemmli עם 1 גרם של סולפט dodecyl נתרן, 3.5 מיליליטר של גליצרול, 3.5 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 6.8 ו 420 μl של β-mercaptoethanol. להסתגל להיקף כולל של 10 מיליליטר על ידי הוספת מים מזוקקים. לדלל 3 פעמים במים מזוקקים כדי להשיג חיץ 2x Laemmli. זהירות: &amp;# 946; -mercaptoethanol הוא רעיל, להכין ולהשתמש חיץ Laemmli במנדף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חימום, צנטריפוגות חלבון G חרוזים למשך 30 שניות ב 8000 XG ולאחסן הדגימות ב 4 ° C (לטווח קצר) או -20 ° C (לטווח ארוך). </li></ol></li></ol> 4. ניתוח (שיתוף) החלבונים immunoprecipitated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את החלבונים המצויים בlysate התא וeluate של שיתוף immunoprecipitation על ידי SDS-PAGE 20 ומערביים סופג 21,22. בדרך כלל נטען במחצית eluate Laemmli על ג&#39;ל. היזהר שלא להפריע את חרוזים חלבון G pelleted כאשר לוקחים דגימות לטעינת ג&#39;ל. MX1 וביטוי NP נחשפו עם אנטי-MX1 ונוגדן אנטי-NP, בהתאמה 14. הלהקות התגלו עם chemiluminescence מבוססת HRP ומפתחי סרט X-ray. </li></ol>

<ol>
	<li>Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mx+proteins:+antiviral+gatekeepers+that+restrain+the+uninvited.">Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).</li><li>Goujon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+MX2+is+an+interferon-induced+post-entry+inhibitor+of+HIV-1+infection.">Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).</li><li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MX2+is+an+interferon-induced+inhibitor+of+HIV-1+infection.">MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+MxB+protein+inhibits+HIV-1+infection.">The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection.</a> Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+human+MxA+GTPase+blocks+nuclear+import+of+Thogoto+virus+nucleocapsids.">Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).</li><li>Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+interactive+region+of+human+MxA+GTPase+is+involved+in+GTPase+activation+and+interaction+with+viral+target+structures.">The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+(Orthomyxoviridae).">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution-guided+identification+of+antiviral+specificity+determinants+in+the+broadly+acting+interferon-induced+innate+immunity+factor+MxA.">Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).</li><li>Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+antiviral+activity+of+the+human+MxA+protein+against+Thogoto+and+influenza+A+virus.">Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus.</a> J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).</li><li>Turan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+MxA+proteins+form+a+complex+with+influenza+virus+NP+and+inhibit+the+transcription+of+the+engineered+influenza+virus+genome.">Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome.</a> Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).</li><li>Dittmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+strains+differ+in+sensitivity+to+the+antiviral+action+of+Mx-GTPase.">Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase.</a> J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).</li><li>Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viral+nucleoprotein+determines+Mx+sensitivity+of+influenza+A+viruses.">The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses.</a> J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).</li><li>Manz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+influenza+A+viruses+escape+from+restriction+by+human+MxA+through+adaptive+mutations+in+the+nucleoprotein.">Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein.</a> PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).</li><li>Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-inducible+protein+Mx1+inhibits+influenza+virus+by+interfering+with+functional+viral+ribonucleoprotein+complex+assembly.">Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly.</a> J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).</li><li>Brewer, C. F., Riehm, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+possible+nonspecific+reactions+between+N-ethylmaleimide+and+proteins.">Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins.</a> Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).</li><li>Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+ribonucleotide+reductase+M1-gemcitabine+interaction+in+vivo+by+N-ethylmaleimide.">Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide.</a> Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).</li><li>Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dimerization+of+human+MxA+promotes+GTP+hydrolysis,+resulting+in+a+mechanical+power+stroke.">Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke.</a> Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).</li><li>Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+metal-ion-binding+properties+of+the+Ca2+-binding+helix-loop-helix+EF-hand+motifs.">Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs.</a> Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+mouse+Mx+proteins+inhibit+different+steps+of+the+influenza+virus+multiplication+cycle.">Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle.</a> J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

לומד את האינטראקציה בין חלבונים אנטי ויראלי והמטרות שלהם הוא מאוד חשוב להבין את פרטי המנגנון אנטי של החלבונים האלה. זה יכול לתת לי תובנות חדשות על איך וירוסים ומארחיהם התפתחו יחד ולהיות הבסיס לפיתוח אסטרטגיות אנטי חדשות. פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation מותאם המתואר כאן מא...

חלבוני התנגדות Myxovirus (MX) הם חלק חשוב של ההגנה החיסונית המולדת נגד פתוגנים נגיפיים. חלבונים אלה הם GTPases כמו dynamin-גדול הנגרמים על ידי הסוג I וסוג III אינטרפרונים. גני Mx המקבילים נמצאים כמעט בכל בעלי חוליות בעותקים אחד או מספר המוצרים והגן לעכב מגוון רחב של וירוסים, כולל Orthomyxoviridae (למשל., וירוס שפעת), Rhabdoviridae (למשל., וירוס stomatitis שלפוחי), Bunyaviridae (למשל. , וירוס LA CROSSE) וRetroviridae (למשל, וירוס כשל חיסוני אנושי-1) 1-4. לא ברור כיצד חלבונים אלה להכיר מגוון רחב כל כך של וירוסים, ללא כל רצף ראשוני משותף לכאורה מוטיבים בוירוסים אלה. ניתוח האינטראקציה של חלבוני MX עם המטרות נגיפיות שלהם, שעלול להיות כרוכות במתחמים מסדר גבוהים יותר עם גורמי תא מארח אחרים, יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים tכובע התפתח במרוץ החימוש בין וירוסים ומארחיהם. האינטראקציה בין חלבוני Mx יונקים ומטרות נגיפיות נחקרה בצורה נרחבת ביותר לMXA האנושי. MXA האדם יכול לעכב את השכפול של וירוסים רבים, כוללים שפעת orthomyxoviruses ווירוס Thogoto. MXA נקשר מתחמי Thogoto ribonucleoprotein הווירוס (vRNPs), ובכך למנוע הכניסה הגרעינית שלהם, וכתוצאה מכך הבלוק של זיהום 5. אינטראקציה זו בין vRNPs וירוס MXA וThogoto הודגמה בניסויי שיתוף שקיעה ושיתוף immunoprecipitation 6-9. איך חלבוני Mx לעכב נגיפי שפעת הוא פחות ברור. אחת בעיות עיקריות הוא שזה לא פשוט להפגין אינטראקציה בין חלבון מושלם וזה מוצר גן השפעת. דו&quot;ח אחד הפגין אינטראקציה בין MXA אדם וחלבון NP בשפעת תאים נגועים בוירוס 10. אינטראקציה זו יכולה להיות מוצגת רק על ידי שיתוף immunoprecipitation אם טופלו התאים עם dithiobis cross-linking מגיב (propionate succinimidyl) לפני תמוגה, המצביע על כך האינטראקציה היא חולפת ו / או חלשה. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי רגישות Mx ההפרש של זני שפעת שונים נקבעת על ידי המקור של חלבון NP 11,12. בקנה אחד עם זו, נגיפי שפעת יכולים לברוח בחלק משליטת Mx על ידי מוטציה שאריות ספציפיות בחלבון NP 13. הדבר מצביע על כך היעד העיקרי של וירוסי שפעת למארח MX הוא חלבון NP, ככל הנראה NP התאסף במתחמי vRNP. עם זאת, אף אחד מהמחקרים שנעשה לאחרונה הראה יותר אלה אינטראקציה בין השפעת NP או vRNPs וגם MXA אדם או לעכבר MX1. לאחרונה הראו, בפעם הראשונה, אינטראקציה בין השפעת NP וחלבון MX1 עכבר עם פרוטוקול מותאם שיתוף immunoprecipitation 14, שתואר כאן בהרחבה. בשיתוף i הכללית,mmunoprecipitation הוא אחת הגישות הנפוצות ביותר בשימוש ביוכימיים לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. טכניקה זו לעתים קרובות עדיפה על טכניקות חלופיות, למשל, שמרי שתי היברידיים, שכן הוא מאפשר לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בסביבתם הטבעית. Co-immunoprecipitation יכול להתבצע על חלבונים הביעו endogenously אם נוגדנים נגד חלבוני עניין זמינים. לחלופין, חלבוני עניין יכולים לבוא לידי ביטוי בתא דרך transfection או זיהום ותג זיקה ניתן להשתמש. בנוסף ליתרונות שהוזכר לעיל, פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation המתואר מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון חלשות ו / או חולפות. המרכיב העיקרי בפרוטוקול מותאם זה הוא התוספת של N-ethylmaleimide (Nem) במאגר תמוגה התא. Nem הוא מגיב אלקילציה שמגיבה עם קבוצות תיאול חופשיות כמו הווה בcysteines, בpH של 6.5-7.5, כדי ליצור thio-אסתר יציבה(איור 1). ב- pH גבוה יותר, nem יכול גם להגיב עם קבוצות אמינו או לעבור הידרוליזה 15. Nem משמש בדרך כלל כדי לחסום קבוצות תיאול חופשיות, על מנת למנוע היווצרות קשר דיסולפיד או לעכב פעילות האנזימטית. לדוגמא, nem משמש לעתים קרובות כדי לחסום אנזימי desumoylating, אשר פרוטאזות ציסטאין. בפרוטוקול שיתוף immunoprecipitation תאר, nem תחילה כלול במאגר תמוגה משום שכבר דווחו כי sumoylation של חלבוני שפעת יכולה להשפיע על האינטראקציה בין חלבונים נגיפיים 16. באופן בלתי צפוי, התוספת של nem הוכיחה להיות מפתח ללתעד את האינטראקציה בין השפעת NP ועכבר MX1 על ידי שיתוף immunoprecipitation. לא ברור מדוע התוספת של nem היא חיונית כדי לזהות את האינטראקציה NP-MX1. אולי האינטראקציה מדי חולפת ו / או חלשה. Nem יכול לייצב את האינטראקציה, למשל, על ידי שמירת קונפורמציה ספציפית של MX1, חלבון נגיפי או אפילו compo שלישי לא ידועnent. כגון השפעה מייצבת של nem נצפתה לפני, למשל, לאינטראקציה בין reductase ribonucleotide M1 וgemcitabine המעכב (F2dC) 17. MX1 וNP שניהם מכילים שאריות ציסטאין מרובות אשר יכול להיות שונה על ידי nem. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה על ידי רני et al. הוכיח כי stalkless MXA-variant מכיל שלוש שאריות ציסטאין נחשפו ממס שניתן לשנות על ידי iodoacetamide. מוטציה שאריות אלה לserines לא השפיעה על הפעילות האנזימטית של MXA, אבל מנעה צבירה בתיווך דיסולפיד 18. כcysteines אלה נשמרים בMX1, זה מצביע על כך cysteines המקביל בMX1 ניתן לשנות על ידי nem וכקונפורמציה השפעה כזו או מסיסות. בנוסף, nem עשוי להשפיע גם על פעילות GTPase של MX1, שהוא חיוני לפעילות נגד השפעת של MX1, ובכך לייצב את יחסי הגומלין בין MX1 וNP. עם זאת, השפעה ישירה של nem על acti GTPasevity של MX1 הוא סביר, כnem נדרש גם כדי לזהות את יחסי הגומלין בין השפעת NP וGTPase מוטציות לא פעילה של חלבון MX1 14. ברור, יש צורך במחקר נוסף כדי לפענח את ההשפעה של nem על האינטראקציה NP-MX1. לסיכום, פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation המתואר מאפשר לחקור את האינטראקציה בין החלבונים אנטי MX1 והיעד הנגיפי שלה, חלבון NP שפעת. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור אינטראקציות חלשות או חולפות אחרות שתלויים בייצוב של תצורות חלבון ספציפיות. אינטראקציה בין חלבונים התלויים בתצורות ספציפיות תוארה קודם לכן, למשל, למחייב חלבוני סידן כגון calmodulin 19. לבסוף, התפקיד מועיל של nem יכול לשמש גם בשיטות אחרות המזהות חלבונים אינטראקציות, כגון מבחני שיתוף שקיעה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-ethylmaleimide היא תרכובת אורגנית שיכול לשמש כדי לשנות באופן בלתי הפיך קבוצות תיאול חופשיות, למשל לעכב פרוטאזות ציסטאין (איור 1). החלבון אנטי MX1 מעכב שפעת שכפול נגיף על ידי אינטראקציה עם nucleoprotein ויראלי. פרוטוקול שיתוף immunopre...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein at JoVE.com

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

co-immunoprecipitation-mouse-mx1-protein-with-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K Views.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Video: Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...