Este trabalho foi apoiado por FWO-Vlaanderen, o projeto IOF IOF10 / StarTT / 027 e da Universidade de Ghent Especial Research Grant BOF12 / GOA / 014.

Nota: O seguinte protocolo de transfecção e co-imunoprecipitação é estabelecida para um formato de placa de Petri 9 cm. Outros formatos também são possíveis após a escala do protocolo. 1. Sementeira do rim embrionário humano (HEK) Células 293T <ol><li> Semente da células HEK293T um dia antes da transfecção a 1,2 x 10 6 culas por 9 centímetros de Petri em 12 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina, 0,4 mM de Na-piruvato, 0,1 aminoácidos não essenciais mM, 100 U / ml de penicilina e 0,1 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Crescer as células 16 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Inspeccione visualmente a morfologia e a viabilidade das células com um microscópio de luz invertida antes da transfecção. As células necessitam de ser sub-confluente para a eficiência de transfecção óptima. </li></ol> 2. O cálcio-fosfato de transfecção de células HEK293T Nota: Use 0,5-1 mg de pCAXL-NP ou vazio plasmídeo pCAXL em combinação com 1-3 mg de pCAXL-Mx1 por 9 centímetros prato. Use uma quantidade igual de DNA total plasmídeo em todas as amostras; ajustar com plasmídeo vazio, se necessário. <ol><li> Preparar os seguintes tampões de transfecção: <ol><li> Prepare de Tris-EDTA (TE) com concentrações de 1,0 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e EDTA 0,1 mM, pH 8,0. </li><li> Prepare BS / HEPES com concentrações de 25 mM de HEPES (5,96 g / L, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), NaCl 274 mM (16 g / l), KCl 10 mM (0,74 g / L), NaHPO 4 1,5 mM · 12H 2 O (0,5 g / L) e 11,1 mM de dextrose (2 g / L). Ajustar o pH a 7,05. </li><li> Prepare CaCl2 / com as concentrações de HEPES 1,25 M CaCl 2 2H 2 O (183,8 g / L) e tampão HEPES 125 mM (29,79 g / L). Ajustar o pH a 7,05 com NaOH. </li></ol></li><li> Aquecer os buffers de transfecção, a 37 ° C antes da utilização. </li><li> Preparar as amostras diluindo o plasmídeo de ADN de plasmídeo em 600 ul de TE.Preparar estas misturas em poços de uma placa de 6 poços. </li><li> Adicionar 150 mL de CaCl2 / HEPES de forma sábia soltar para as amostras de plasmídeos e misture pipetando três vezes para cima e para baixo. </li><li> Preparar a solução de transfecção por adição gota a gota, a solução de plasmídeo (DNA TE + + CaCl 2 / HEPES; 750 ul) a 750 ul de tampão de BS / HEPES fornecidos em uma nova placa de 6 poços. Distribuir a solução de plasmídeo uniformemente sobre o poço de tampão contendo completa BS / HEPES. </li><li> Agitar a solução de transfecção sobre um agitador de placas durante 90 segundos a 1000 RPM. </li><li> Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar a solução de transfecção (1,5 ml) gota a gota às células. Usar uma micropipeta P1000 a escorrer a solução de transfecção nas células. Dispersar a mistura sobre a completa nove centímetros de Petri e agitar a placa muito suavemente. </li><li> Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 6 h. Em seguida, retire o meio por aspiração e substitua imediatamente with 12 ml de meio fresco, pré-aquecido. Adicionar cuidadosamente a meio fresco às células para evitar a separação de células. Para isto, segurar a ponta da pipeta contra o lado do poço e suavemente empurrar para fora do meio. </li><li> Incubar as células durante mais 16 horas adicionais a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. Co-imunoprecipitação Nota: Execute o co-imunoprecipitação 24 horas após a transfecção. <ol><li> Preparação do tampão de baixo lise sal e tampão de lavagem de alta sal. <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de 2 M de N-etilmaleimida (NEM) pesando a quantidade de NEM e dissolvendo-o em etanol absoluto. Preparar a solução estoque NEM fresco antes de usar. CUIDADO: NEM é muito tóxico, preparar e usar esta solução estoque em um exaustor. </li><li> Preparar tampão de lise de sal baixo a concentrações de 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1% de NP40 e um cocktail de inibidores de protease (1 dissolver mesat em 50 ml de tampão de lise). Adicionar NEM até uma concentração final de 25 mM (isto é, diluir 1:80). Mantenha no gelo após a adição dos inibidores da protease e NEM. Nota: Sempre adicionar os inibidores da protease e NEM imediatamente antes da utilização. </li><li> Preparar um tampão de lavagem de alto teor salino a concentrações de 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM e 1% de NP40. Note-se que o tampão de lavagem de alto teor salino não contém NEM. </li></ol></li><li> Preparação de lisados ​​celulares. <ol><li> Remover o meio e lava-se as células com 2 ml de fosfato de gelo frio tamponado salino (PBS). Adicionar muito suavemente o tampão de lavagem, como células HEK293T desprendem facilmente. </li><li> Retire o PBS e adicionar 600 mL de tampão de lise sal baixo gelada por 9 centímetros de Petri. </li><li> Incubar as placas durante 20 min em gelo. Certifique-se de que as placas são mantidas horizontal, para assegurar a cobertura completa da superfície da placa com tampão de lise. Agitar suavemente as placas a cada 5 minutos. </li><li> Recolhe-se o lisado celular numa microcentrífuga de 1,5 mltubo e centrifuga-se durante 3 min a 4 ° C e 16.000 xg para sedimentar a fracção insolúvel. </li><li> Transferir a fracção solúvel, isto é, o lisado de células para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e manter em gelo. Imediatamente continuar com o protocolo de co-imunoprecipitação, para evitar a dissociação das proteínas que interagem. Executar todas as etapas seguintes, tanto quanto possível em gelo ou a 4 ° C para limitar a actividade proteolítica nos lisados. </li></ol></li><li> Geração de complexos imunes. Nota: Neste passo, a proteína de interesse está ligado pelo anticorpo apropriado. Para estudar a interacção NP-Mx1, utilizar um anticorpo monoclonal anti-NP do rato. <ol><li> Para cada amostra, misturar 135 ul de lisado com 2 ul de anticorpo monoclonal anti-NP e 113 ul de tampão de lise de sal baixo (volume total de 250 uL). Armazenar o lisado remanescente à temperatura de -20 ° C para posterior análise, tais como Western blotting, para documentar os níveis de expressão da intera supôsparceiros ction nas células transfectadas. Nota: Em alternativa, medir a concentração de proteína do ligado (por exemplo, com o reagente de Bradford) e utilizar uma quantidade fixa de proteína total, por exemplo, 400 ug, para cada lisado. </li><li> Incubar a mistura de anticorpo-lisado durante 3 horas numa roda giratória a 4 ° C. Este passo pode ser estendido para uma incubação de um dia para o outro. </li></ol></li><li> Preparação dos grânulos de proteína G. Nota: As esferas de proteína G são transportados e armazenados em etanol a 20% para a preservação. O grânulo-lama é normalmente constituída por 50% de partículas e estes grânulos têm de ser lavadas antes de serem usadas para imunoprecipitar os complexos imunes. <ol><li> Utilizar 50 ul de pérolas, isto é, 100 ul de talão-lama, para cada amostra. Lava-se a quantidade de esferas necessárias para todas as amostras do ensaio de co-imunoprecipitação de um tubo. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 ml para facilitar a pipetagem do grânulo-lama. </li><li> Centrifugar a proteína G talão-lama em 8.000 xg e 4 ° C durante 30 seg. Remover a solução de etanol e adicionar um volume igual de tampão de lise de baixa sal. Centrifugar a proteína G do grânulo-suspensão a 8000 xg e 4 ° C durante 30 seg e o sobrenadante remover suavemente. Repita este passo de lavagem 3 vezes. Nota: O tampão de lise de baixa sal usado para lavar as pérolas não necessitam de conter inibidores da protease ou NEM. </li><li> Estimar o volume de proteína G pérolas e adicione um volume igual de tampão baixo lise sal para fazer um novo 50% grânulo-lama em tampão baixo lise sal. </li><li> Para cada amostra, transferir 100 ul de talão-suspensão em um tubo de 1,5 ml fresco microcentrífuga e armazenar em gelo até à utilização. Ter cuidado para voltar a suspender o grânulo-lama antes de se dividir, como estas pérolas sedimentam rapidamente para o fundo do tubo. </li></ol></li><li> Immunoprecipitation dos complexos imunes pela proteína G pérolas e sua eluição. <ol><li> Antes de utilizar as esferas de proteína G para a imunoprecipitação, todos os tubos de centrifugação de 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C everificar, por inspecção visual de que existe uma quantidade igual de pérolas presente em todas as amostras. Se for necessário ajustar a quantidade de grânulos em algumas das amostras e centrifugar novamente. Descartar o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar as proteínas G perla peletizadas. </li><li> Resumidamente, centrifugar os complexos imunes (isto é., Os lisados ​​com anticorpo, 250 ul) durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C para recolher a amostra completa, na parte inferior do tubo. Transferir os complexos imunes para as esferas de proteína G (50 uL). </li><li> Incubar 60 min sobre uma roda giratória a 4 ° C. Não incubar estes complexos imunitários mais do que 75 minutos com os grânulos para reduzir a ligação não específica de proteínas para as esferas de proteína G. </li><li> Centrifuga-se as esferas de proteína G (com complexos imunes ligados) durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C e remove-se os sobrenadantes. Tenha cuidado para não perturbar as proteínas G perla peletizadas. Opcional: armazenar estes sobrenadantes a 4 ° C ou -20 ° C para posterior análise,por exemplo, para estimar a quantidade de proteína não ligada. </li><li> Lavam-se as esferas de proteína G para aproximadamente 5 min com 900 ul de tampão de lise de sal elevado. Certifique-se de que as pérolas são completamente ressuspenso no tampão de lavagem para a lavagem óptima. Centrifuga-se as esferas de proteína G durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Repita este passo de lavagem 4 vezes. Tenha cuidado para não perturbar as esferas de proteína G peletizadas para evitar a perda de material imunoprecipitado. </li><li> Após o último passo de lavagem, adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x para os grânulos e aquecer a suspensão durante 10 min a 95 ° C para eluir as (co) proteínas imunoprecipitadas. <ol><li> Preparar 10 ml de tampão de Laemmli 6x com 1 g de dodecil sulfato de sódio, 3,5 ml de glicerol, 3,5 ml de 1 M de Tris-HCl a pH 6,8 e 420 ul de β-mercaptoetanol. Ajustar para um volume total de 10 ml por adição de água destilada. Dilui-se 3 vezes em água destilada para obter tampão Laemmli 2x. CUIDADO: &amp;# 946; mercaptoetanol é tóxico, preparar e usar tampão Laemmli em um exaustor. </li></ol></li><li> Após o aquecimento, centrifugar os grânulos de proteína G durante 30 segundos a 8000 xg e armazenar as amostras a 4 ° C (a curto prazo) ou -20 ° C (a longo prazo). </li></ol></li></ol> 4. Analisar o (co-) imunoprecipitou Proteínas <ol><li> Visualizar as proteínas presentes no ligado celular e o eluato de co-imunoprecipitação por SDS-PAGE e western blotting 20 21,22. Tipicamente carregar metade do eluato em gel de Laemmli. Tenha cuidado para não perturbar as esferas proteína G peletizadas quando recolha de amostras para carregamento de gel. Mx1 e expressão NP foram revelados com um anti-Mx1 e anticorpo anti-NP, respectivamente 14. As bandas foram detectadas com base quimioluminescência-HRP e um programador de película de raios-X. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O estudo da interacção entre proteínas antivirais e seus alvos virais é muito importante para compreender os detalhes do mecanismo antiviral destas proteínas. Isso pode dar novos insights sobre como os vírus e seus hospedeiros co-evoluído e ser a base para o desenvolvimento de novas estratégias antivirais. O protocolo de co-imunoprecipitação optimizado descrito aqui permite o estudo da interacção entre a proteína de rato e a sua Mx1 alvo viral, a proteína NP da gripe. O aspecto mais importante deste protoc...

Resistência myxovirus (Mx) proteínas são uma parte importante da defesa imune inata contra patógenos virais. Estas proteínas são grandes GTPases dinamina-like que são induzidos por tipo I e tipo III interferons. Os genes Mx correspondentes estão presentes em quase todos os vertebrados em uma ou várias cópias e dos seus produtos de genes inibir uma vasta variedade de vírus, incluindo Orthomyxoviridae (por exemplo., O vírus da gripe), Rhabdoviridae (por exemplo., O vírus da estomatite vesicular), Bunyaviridae (por exemplo. , La Crosse vírus) e Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana-1) 1-4. Não está claro como estas proteínas reconhecer uma ampla gama de vírus tais, sem qualquer sequência primária compartilhada aparente motivos na estes vírus. Analisando a interação de proteínas Mx com seus alvos virais, potencialmente envolvendo complexos de ordem superior com outros fatores de célula hospedeira, irá ajudar a compreender os mecanismos moleculares tchapéu evoluíram na corrida armamentista entre os vírus e seus hospedeiros. A interação entre as proteínas de mamíferos e Mx alvos virais tem sido estudado mais extensivamente para MxA humano. MxA humano pode inibir a replicação de muitos vírus, incluindo o vírus influenza A orthomyxovirus e vírus Thogoto. MxA liga os complexos de ribonucleoproteína vírus Thogoto (vRNPs), impedindo assim a sua entrada nuclear, o que resulta no bloqueio da infecção 5. Esta interacção entre MXA e Thogoto vRNPs vírus tem sido demonstrado com a co-sedimentação e de co-imunoprecipitação experiências 6-9. Como proteínas Mx dificultar vírus da gripe A é menos clara. Um problema principal é que não é fácil de demonstrar uma interacção entre uma proteína Mx e um produto de gene da influenza. Um relatório demonstrou uma interação entre MxA humana e da proteína NP em influenza A células infectadas pelo vírus 10. Essa interação só poderia ser demonstrado por co-immunoprecipitation se as células terem sido tratadas com as de reticulação reagentes ditiobis (propionato de succinimidilo), antes de lise, sugerindo que a interacção é transitória e / ou fraco. Estudos mais recentes têm mostrado que a sensibilidade diferencial Mx de estirpes diferentes de influenza A é determinado pela origem da proteína NP 11,12. Em linha com esta, os vírus da gripe A pode escapar do controle, em parte, Mx por mutação resíduos específicos na proteína NP 13. Isto sugere que o principal alvo dos vírus influenza para acolhimento Mx é a proteína NP, provavelmente NP montados em complexos vRNP. No entanto, nenhum desses estudos mais recentes demonstraram uma interacção entre a gripe NP ou vRNP e MxA quer humano ou de ratinho Mx1. Recentemente, demonstrou, pela primeira vez, uma interacção entre o NP de influenza e da proteína Mx1 rato com um protocolo de co-imunoprecipitação optimizado 14, a qual é descrita aqui em detalhe. Em geral, a co-immunoprecipitation é uma das abordagens bioquímicas mais freqüentemente utilizados para investigar as interações proteína-proteína. Esta técnica é muitas vezes preferido ao longo técnicas alternativas, por exemplo, de leveduras duplamente híbrido, uma vez que permite investigar interacções proteína-proteína no seu ambiente natural. Co-imunoprecipitação pode ser levada a cabo em proteínas expressas endogenamente, se os anticorpos contra as proteínas de interesse estão disponíveis. Alternativamente, as proteínas de interesse podem ser expressos na célula através de transfecção ou infecção e um tag de afinidade pode ser usado. Além das vantagens acima mencionadas, o protocolo de co-imunoprecipitação descrita permite a detecção de interacções proteína fracos e / ou transientes. O principal componente neste protocolo optimizado é a adição de N-etilmaleimida (NEM) em tampão de lise celular. NEM é um reagente de alquilação, que reage com grupos tiol livres tais como presentes em cisteínas, a um pH de 6,5-7,5, para formar uma tio-éster estável(Figura 1). A pH mais elevado, a NEM também pode reagir com grupos amino ou sofrer hidrólise 15. NEM é normalmente utilizado para bloquear os grupos tiol livres, a fim de evitar a formação de ligações dissulfureto ou inibir a actividade enzimática. Por exemplo, a NEM é muitas vezes usado para bloquear enzimas desumoylating, que são proteases de cisteína. No protocolo de co-imunoprecipitação descrita, NEM foi inicialmente incluído no tampão de lise, porque tinha sido relatado que o sumoilação de proteínas de influenza podem influenciar a interacção entre as proteínas virais 16. Inesperadamente, a adição de NEM provou ser a chave para documentar a interacção entre NP de influenza e rato Mx1 por co-imunoprecipitação. Não está claro porque a adição de NEM é crucial para detectar a interacção NP-Mx1. Possivelmente, a interacção é muito transiente e / ou fraco. NEM poderia estabilizar a interacção, por exemplo, ao preservar uma conformação específica de Mx1, uma proteína viral, ou ainda um terceiro compo desconhecidonente. Tal efeito estabilizante de NEM foi observada antes, por exemplo, para a interacção entre a ribonucleótido-redutase M1 e o seu inibidor gemcitabina (F2dC) 17. Mx1 e NP ambos contêm múltiplos resíduos de cisteína que poderiam ser modificados por NEM. Por exemplo, um estudo recente da Rennie et al. Demonstraram que uma stalkless MxA variante contém três resíduos de cisteína expostos solventes que podem ser modificados por iodoacetamide. Mutação destes resíduos para serines não influenciou a atividade enzimática da MxA, mas impediu a agregação mediada por dissulfeto 18. À medida que estas cisteínas são conservadas em Mx1, isto sugere que os análogos em cisteínas Mx1 pode ser modificada por NEM e, como tal influência sua conformação ou solubilidade. Além disso, a NEM também pode afectar a actividade de GTPase de Mx1, que é essencial para a actividade anti-gripe de Mx1, e assim estabilizar a interacção entre Mx1 e NP. No entanto, um efeito directo de NEM na GTPase actividade de Mx1 é improvável, como NEM também é necessária para detectar a interação entre a gripe NP e GTPase mutantes inativos da proteína Mx1 14. Claramente, é necessária mais investigação para desvendar o efeito de NEM na interação NP-Mx1. Em resumo, o protocolo de co-imunoprecipitação descrita permite estudar a interacção entre a proteína antiviral Mx1 e seu alvo viral, a proteína NP da gripe. Este protocolo poderia também ser utilizada para estudar outras interacções fracas ou transientes que dependem da estabilização de conformações de proteínas específicas. Interacção proteína-proteína que dependem conformações específicos têm sido descritos antes, por exemplo, para as proteínas de ligação ao cálcio, tais como a calmodulina 19. Finalmente, o papel benéfico de NEM também pode ser usado noutros métodos que detectam interacções proteína-proteína, tais como ensaios de co-sedimentação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-etilmaleimida é um composto orgânico que pode ser utilizado para modificar irreversivelmente grupos tiol livres, por exemplo, para inibir as proteases de cisteína (Figura 1). A proteína antiviral Mx1 inibe a replicação do vírus da gripe A, interagindo com a nucleoproteína virai. O protocolo de co-imunoprecipitação otimizado aqui descrito permite estudar essa interação NP-Mx1. Células HEK293T foram transfectadas com vectores de expressão para a prote?...

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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