فإن الكتاب أود أن أشكر موظفي مرفق ديكين اسماك الزرد جامعة لتوفير الرعاية الممتازة تربية مستمرة. ويدعم من قبل YG زمالة ألفرد ديكين أبحاث ما بعد الدكتوراه ومنحة بحثية من جامعة ديكين الوسطى. ويدعم من قبل حركة تحرير السودان زمالة التطوير الوظيفي NHMRC. ويدعم ACW بمنحة تمكين NHMRC. ويدعم جميع الكتاب من قبل مركز البحوث البحوث الاستراتيجية الجزيئية والطبية في جامعة ديكين.

الجزء 1: المعالجة الكيميائية للالأجنة الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة الزرد بعد الإخصاب. احتضان 28.5 ° C في المتوسط ​​في E3 في 100 × 15 ملم أطباق بتري ملاحظة: للفي الموقع التهجين أو النفط تلطيخ-O الأحمر، يتم إضافة 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) في تركيز النهائي من 0.2 مم إلى تمنع تشكيل الصباغ، 1 ولكن ليس من الضروري لتحليل فرس البحر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدراسات الدوائية، إضافة الكيميائية المطلوبة في التركيز على النهائي المناسبة لتطوير الأجنة الزرد في حوالي 26 ساعة الإخصاب آخر (HPF) مع ملاحظة السيارة فقط المكافحة المناسبة: لحساسة للضوء مثبطات الدوائية، يمكن أن يسمح لتطوير الأجنة في وقبل الظلام لتحليلها. </li></ol> الجزء 2: لايف الشخصي الأيض باستخدام فرس البحر XF 24 محلل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل كل تشغيل، وفرس البحر XF خرطوشة محلل ال 24 التي تضم H 2 O و <sيتم معايرة يصل&gt; + fluorophores من خلال عملية مؤتمتة التي يؤديها محلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة XF 24 جزيرة جيدا 24. يعمل التسلسل التالي التجريبية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منذ استهلاك الأكسجين حساسة للتقلبات درجة الحرارة، وتستخدم أربعة آبار للسيطرة على تقلبات درجات الحرارة ممكن عبر اللوحة. هذه الآبار لا تحتوي على أجنة، ولكن تمتلئ مع 700 ميكرولتر من E3 المتوسطة (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتلئ المتبقية 20 بئرا (انظر الجزء 2.2) مع 700 ميكرولتر من E3 المتوسطة وجنين واحد كل (2B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تجربة، ومعالجة 10 الأجنة مع السيارة فقط (التحكم) و 10 تعامل مع مثبط الكيميائية (المعالجة). وتناوبت السيطرة والمعالجة الأجنة (مثل جيدا A2: جنين السيطرة؛ A3 جيدا: الجنين المعالجة: A4 جيدا: جنين السيطرة؛ جيدا A5 الجنين المعالجة، الخ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف شاشة التقاط جزيرة على رأس. كل بئر لضمان أن تبقى العينة في غرفة القياس في جميع أنحاء مقايسة (الشكل 2B) ملاحظة: المعالجة كيميائيا الأجنة البقاء مع حلها الكيميائية الأصلية في جميع أنحاء الإجراء بأكمله، ولا حاجة لتغسل المادة الكيميائية قبل تشغيل محلل فرس البحر البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء مرة واحدة، يتم تحميل لوحة في محلل فرس البحر وبدء الفحص. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات. يتم تنفيذ بشكل روتيني تحليلين مختلفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج القاعدية التنفس التنفس / الحد الأقصى (تقريبا مدة 90 دقيقة). تغييرات في التنفس ضعف التمثيل الغذائي القاعدي دعم، في حين تنفس القصوى هي مقياس لإجمالي الطاقة الإنتاجية الطاقة والتغييرات في هذه المعلمة المرتبطة مع عدد من الدول على حد سواء المرضية والفسيولوجية. ويحسب أيضا قدرة الجهاز التنفسي الغيار، أو القدرة على نظام لزيادة إنتاج ATP،من هذا الاختبار من قبل الطرح من القاعدية من التنفس القصوى. يتم تنفيذ ثلاثة يكرر كل مزيج (2 دقيقة) / الانتظار (1 دقيقة) / قياس (2 دقيقة) دورة لتأسيس أول التنفس القاعدية. في نهاية الدورة الثالثة، تتم إضافة تركيز النهائي من 2.5 ميكرومتر من FCCP (الميتوكوندريا protonophore / uncoupler) إلى كل جانب السماح قياس التنفس الأقصى. ثم يتم تكرار دورة القياس 5 إلى 8 مرات (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ATP البرنامج تسرب دوران / بروتون (مدة حوالي 60 دقيقة). التنفس بسبب دوران ATP يمثل وظيفة رئيسية من الميتوكوندريا في شكل ATP الإنتاج، في حين يرتبط ارتباطا لا انفصام التنفس بسبب تسرب بروتون، أو التنفس فكت، مع غيرها من المعالم وظيفة الميتوكوندريا بما في ذلك التنفس والقاعدية على رد الفعل تشكيل أنواع الاكسجين. ويمثل التنفس بسبب دوران ATP عن طريق الفرق في التنفس بعد إضافة أوليغوميسين ميكرومتر 25 (مثبط لATP سينسيز) مقارنة التنفس القاعدية. فكت التنفس، أو التنفس بسبب تسرب بروتون، يتم تحديدها من قبل حساب الفرق بين أوليغوميسين بوساطة التنفس والتنفس بعد إضافة روتينون ميكرومتر 25 (المانع I المعقدة). وتتكرر دورات قياس 8 مرات بعد إضافة كل مثبط الميتوكوندريا. </li></ol></li></ol> في نهاية أشواط، يعني القيم من السيطرة 10 و 10 الأجنة المعالجة كيميائيا وتحسب. الجزء 3: النفط الأحمر-O تلوين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وdechorionated الأجنة في 50 HPF باستخدام ملقط غرامة وإصلاحها في PFA 4٪ بين عشية وضحاها في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ نفط الأحمر-O تلطيخ، كما هو موضح سابقا 2 (انظر الشكل 4). </li></ol>

<ol>
	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الزرد هو نموذج راسخة الوراثية لكل من الأمام (ENU الطفرات) وعكس (الفلاحة، الزنك الاصبع نوكلياز المستهدفة طرق المغادرة، morpholino ضربة قاضية) النهج الوراثية 3،4، في حين يمكن أيضا وظيفة الجينات في الأجنة الزرد يكون قد تم حظره بسهولة أو تنشيط استخدام المركبات الدوائية انتقائية محددة للمنتجات المشفرة. نظرا لتنميتها الخارجية وصغر حجمها، والأجنة الزرد هي مناسبة خاصة للتحليل الأيض. ومع ذلك، وقياس قوية من الملف التمثيل الغذائي وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي في الأجنة الزرد لم يتحقق، مع واحد فقط وصف الأولية أفادت 5. كان مصمما أصلا للدراسات تحليل فرس البحر الأيض خلية القاعدة وثبت لإعطاء نتائج دقيقة وموثوق بها 6. تطبيق هذه المنهجية الجديدة إلى الأجنة الزرد كبير، ومن المرجح أن تزيد من رقعة استخدام هذا النموذج للدراسات التمثيل الغذائي. في هذه الدراسة، أن نبرهن قياس مجموعة من المعلمات في التنفس الأجنة الزرد باستخدام محلل فرس البحر، بما في ذلك التنفس القاعدية، والتنفس القصوى، والقدرة التنفسية الغيار، والدوران ATP وتسرب بروتون. كما نقوم بتوفير مثال على الكيفية التي يمكن بها ارتباطا هذه القياسات الفسيولوجية الأخرى مع المعلمات، في هذه الحالة تراكم الدهون، واستخدام مثبطات الدوائية في فحص هذا النظام. جنبا إلى جنب مع استخدام الأجنة وراثيا تغيير، وهذا يوفر منصة قوية لفهم العوامل التجريبية التي تؤثر على عملية التمثيل الغذائي. وهناك مجموعة متنوعة من التطبيقات لهذه المنهجية الجديدة، مع ضعف الميتوكوندريا هو متورط في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، مثل داء السكري 7، السمنة 8، التصلب المتعدد 9، أمراض باركنسون 10، مرض الزهايمر 11 و نوع من السرطانات 12. الأهم من ذلك، يايتم تنفيذ العمل اور في الجسم الحي، حيث كل التأثيرات البيئية - مثل السيتوكينات وغيرها ذات الصلة بالتنمية النمو - تنشط، وبالتالي توفير وجهة نظر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الجسم الحي التنفس والتمثيل الغذائي الملف. كما يتم أيضا إجراء روتيني شاشات الكيميائية في النوع البري ومتحولة الأجنة الزرد الخلفية (الشكل 1)، والمستحضرات الصيدلانية الرواية التي يمكن التنفس تأثير، وظيفة الميتوكوندريا أو الأيض التعرف عليها بسهولة باستخدام محلل فرس البحر. ويمكن استخدام نتائج إنشاؤها باستخدام محلل فرس البحر جنبا إلى جنب مع غيرها من المقايسات لتقديم معلومات إضافية. وهذا يمكن أن تشمل تحليل الفسيولوجية، مثل النفط تلوين الأحمر، أو تحليل الجزيئي، كما هو الحال في الموقع التهجين لعلامات محددة مثل خلية شحمية cebpα، Pparα، Pparγ، FAS الخ. لا تزال هناك بعض القيود على هذه المنهجية. على الرغم من أن كنا وغيرها قادرة على استخدام أوليغوميسين إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافلدى عودتهم ATP الإنتاج وتسرب بروتون على الأجنة الشباب 5 (انظر الشكل 3)، في الأجنة أقدم من 60 أوليغوميسين HPF العلاج غير فعال. نعتقد أن أقدم أجنة في أوليغوميسين لا يمكن نشر بسهولة من الأصغر سنا في الأجنة جعل من المستحيل تفسير النتائج. منذ أوليغوميسين النتائج إلزامية لتحديد التنفس بسبب دوران ATP التنفس وفكت، نقوم حاليا بالتحقيق في تركيزات أعلى من أوليغوميسين لكبار السن الأجنة. ومع ذلك، antimycin A العلاجات تبقى فعالة لفترة أطول، مع القياسات الأخرى، مثل التنفس القاعدية، التنفس والقدرة التنفسية القصوى الغيار، لا يمكن أن يؤديها في الأجنة الزرد أقدم، HPF يصل إلى 68 (لا تظهر). ومن أوجه القصور في استخدام محلل فرس البحر الحالي هو الإعداد المساحة الفعلية داخل كل لوحة القبض على جزيرة جيدا، بحيث تكون مناسبة فقط للأجنة ويرقات اسماك الزرد الشباب. ولذلك، وأداء metabolجيم الدراسات بشأن النظام الغذائي الناجم عن السمنة في الأسماك البالغة، على سبيل المثال، ليس ممكنا من الناحية الفنية حتى الآن. ومع ذلك، قد يدفع هذه الدراسة تطوير لوحات صممت خصيصا لصغار الأسماك أو الكبار مما يؤدي إلى تمديد نطاق التحليلات ممكن.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> XF 24 محلل تدفق خارج الخلية </td><td> فرس البحر العلوم البيولوجية </td><td> 100737-101 </td><td> 24 شكل جيد </td></tr><tr><td> جزيرة التقاط صفيحة ميكروسكوبية </td><td> فرس البحر العلوم البيولوجية </td><td> 101122-100 </td><td> 24 شكل جيد </td></tr><tr><td> XF Calibrant الحل </td><td> فرس البحر العلوم البيولوجية </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF الفحص متوسطة </td><td> فرس البحر العلوم البيولوجية </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> النفط الأحمر-O </td><td> سيغما الدريخ </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P7629 </td><td>/ zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (وسط الجنينية) </td><td> أدلى النفس </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100X15 ملم أطباق بتري </td><td> صقر </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> سيجما </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> أوليغوميسين </td><td> سيجما </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> سيجما </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

وثمة هدف نموا في مجال التمثيل الغذائي هو تحديد تأثير الوراثة على جوانب مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا. وفهم هذه العلاقات تساعد على فهم المسببات الكامنة وراء مجموعة من الأمراض المرتبطة مع ضعف الميتوكوندريا، مثل السكري والسمنة. التطورات الحديثة في الأجهزة، وتمكين رصد المعلمات وظيفة الميتوكوندريا متميزة في خطوط الخلايا أو الأنسجة إإكسبلنتس. هنا نقدم طريقة لتحليل السريع وحساسة من المعلمات وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي خلال التنمية الجنينية الزرد باستخدام فرس البحر العلوم البيولوجية XF 24 محلل تدفق خارج الخلية. يستخدم هذا البروتوكول لقطة جزيرة microplates حيث يتم وضع الجنين واحد في كل بئر، مما يسمح للقياس الطاقة الحيوية، بما في ذلك: (ط) التنفس القاعدية، (الثاني) التنفس الميتوكوندريا القاعدية (الثالث) التنفس الميتوكوندريا بسبب دوران ATP، (الرابع) الميتوكوندريا فكت التنفس أو العلاقات العامةأطأن تسرب و(رابعا) الحد الأقصى التنفس. يمكن استخدام هذا النهج التنفس الزرد الجنينية يمكن مقارنة بين المعلمات نوع البرية والأجنة المعدلة وراثيا (متحولة، الإفراط في التعبير الجيني أو ضربة قاضية الجين) أو تلك التلاعب دواء. من المتوقع أن نشر هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع أدوات جديدة لتحليل الأسس الجينية للاضطرابات التمثيل الغذائي في الجسم الحي في هذا النموذج الحيواني الفقاريات ذات الصلة.

<html> ونحن مهتمون في فهم دور جينات معينة على عملية التمثيل الغذائي، وخصوصا معدل التنفس واستقلاب الشحوم. لذلك، نحن يعاملون البرية الأجنة الزرد نوع ابتداء من HPF 26 مع مثبط لانزيم محدد بالعقاقير المشفرة بواسطة واحد من هذه الجينات. في 50 HPF، تم تحليل نصف السيارة والأجنة المانع المعالجة باستخدام وظيفة الميتوكوندريا فرس البحر، في حين كانت ثابتة النصف المتبقي في PFA 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في وقت لاحق وملطخة لترسب الدهون مع النفط-O الأحمر. أدت المعاملة مع مثبط إنزيم معين ل~ 2 أضعاف في زيادة التنفس القاعدية (الشكل 4A)، والذي كان مرتبطا مع زيادة في ترسب الدهون خاصة في الدماغ الانتهائي وتحت الحويصلة الأذنية (الشكل 4B، C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. التمثيل التخطيطي للعلاج الكيميائي للأجنة الزرد. Wildtype والأجنة وراثيا الزرد التلاعب، أو المعالجة الدوائية هي الخلفية. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> الشكل 2. XF24 جزيرة لوحة اقامة. (A) تحتوي على أربعة آبار المتوسطة الجنينية فقط التحكم في درجة الحرارة (تميزت X) وغيرها تحتوي على جنين واحد / أيضا. (B) عن قرب من بئر واحد (C6) تظهر بنسبة 50 HPF الجنين نوع البرية تعامل مع السيارة (DMSO) التي تغطيها شاشة التقاط جزيرة (رأس السهم). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="الشكل 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> الشكل 3. Respiratالمعلمات لايون البرية الأجنة الزرد بكتابة 50 HPF. (A) بالنسبة لكل قياس، يتم تقديم متوسط ​​الأجنة 20 فرد. التنفس القاعدية (يعني: 299،7؛ SD: 75،7؛ SEM: 16.9)، والتنفس القصوى (يعني: 387،4؛ SD: 93.3؛ SEM: 20.9)، سعة الجهاز التنفسي الغيار (يعني: 87.7؛ SD: 72.0؛ SEM: 16.1). (B) بالنسبة لكل قياس، يتم تقديم متوسط ​​عدد 20 نتيجة الفردية. الميتوكوندريا التنفس القاعدية؛ التنفس الميتوكوندريا بسبب دوران ATP؛ الميتوكوندريا التنفس والتنفس فكت غير الميتوكوندريا. MT: الميتوكوندريا؛ SRC: سعة الجهاز التنفسي الغيار؛ SD: الإنحراف المعياري، SEM: الخطأ المعياري للمتوسط. يتم عرض النتائج في بمول من استهلاك O 2 / دقيقة / الجنين. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. الدعوة موجهةsentative نتائج التعرض للمواد الكيميائية على التنفس وترسب الدهون القاعدية. (A، B) 50 HPF الجنين ملطخة النفط-O الأحمر في طريقة العرض الجانبي. حضنت الجنين مع مثبط انتقائي (B) يعرض أكثر تلطيخ النفط-O الأحمر في الدماغ الانتهائي (رأس السهم) وتحت الحويصلة الأذنية (السهم) مقارنة جنين السيطرة على السيارة المعاملة. (C) بصل التنفس يظهر ~ 2 أضعاف في زيادة الأجنة المعالجة كيميائيا (ن = 10 الأجنة لكل مجموعة). يتم عرض النتائج في بمول من O 2 / دقيقة / الجنين.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos at JoVE.com

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

الزرد الفقاريات تمثل نموذجا القوية التي كانت غير مستغلة للدراسات التمثيل الغذائي. نحن هنا وصف وسيلة سريعة لقياس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; الملف الشخصي التمثيل الغذائي من الزرد النامية التي تسمح للمقارنة بين مختلف معلمات الدالة الميتوكوندريا بين الأجنة وراثيا أو دواء التلاعب، وبالتالي زيادة إمكانية تطبيق هذا الكائن الحي.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

metabolic-profile-analysis-of-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

19.8K Views.  School of Medicine, Deakin University. الزرد الفقاريات تمثل نموذجا القوية التي كانت غير مستغلة للدراسات التمثيل الغذائي. نحن هنا وصف وسيلة سريعة لقياس في الجسم الحي الملف الشخصي التمثيل الغذائي من الزرد النامية التي تسمح للمقارنة بين مختلف معلمات الدالة الميتوكوندريا بين الأجنة وراثيا أو د...

Video: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

حقيقية النواة التحليل الشخصي Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycans التصوير في الأجنة التي وصفها اسماك الزرد الاستقلابية والكيمياء Bioorthogonal انقر

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...