The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

הערה: פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות מאוניברסיטת אריזונה משרד להתנהגות אחראית של מחקר ואושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים 1. גידול דג הזברה ותחזוקת העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני עובר E3 8. כדי להפוך את פתרון מניות 60x, לפזר 34.8 גרם NaCl, 1.6 גר &#39;KCl, CaCl 5.8g 2 ● 2H 2 O, וגרם 9.78 MgCl 2 ● 6H 2 O ב1.95 L ddiH 2 O. התאם ל- pH 7.2 באמצעות NaOH וHCl התאם נפח 2 ליטר באמצעות ddiH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום עובר 1x E3, לדלל 16.5 מיליליטר 60x המניה ב 1 L ddiH20. הוספה 100 μl 1% מתילן כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רבייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכר הבית והמנייה נקבה להרהר (7-18 חודשים של גיל) בנפרד על מנת למקסם את הפוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את האורות 1 - 2 שעות לפני היום לפני ביצים הרצויות. הזדווגות להגדיר (זכר 1 ו1 - 2 נקבות) בגכלובי רוסינג כפי שתוארו קודם לכן 9. כלובי חצייה לאפשר לביצים לברוח טריפה כשהם עוברים דרך הבסיס המחורר של להכניס את הטנק שבו הדגים הבוגרים מתקיימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי:. לרבייה מתוזמן, (כפי שניתן היו דרוש למחקרים שכלל הזרקת morpholino), להפריד את הזכר ונקבת דג על ידי מחלק פלסטיק שקוף, הסר זה בבוקר כדי לגרום הנחת מתוזמן של הביצים והפריה. לmorpholino לימודים, לבצע חישובי כוח להעריך את מספר הדגים עובריים הנדרשים לטיפול. ללא הערכה של גודל אפקט או וריאציה, משפט ראשוני ניתן להפעיל עם n = 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הביצים מהכלוב מעבר לצלחת פטרי (100 - צלחת פטרי 150 עוברים / 10 סנטימטרים). לאפשר את הביצים להתיישב לתחתית הצלחת ויוצקים את המים. הסר את כל מים שנותרו בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה. להוסיף בחזרה בינוני עובר E3 שנעשה בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך AFפיפטה הצולעת המלוטשת חד פעמית לביצת עתיד והעברת דגים. בעזרת מספריים, לחתוך פיפטה העברה חד פעמית סיימה בסיום 0.25 מיליליטר. כדי להסיר את קצוות גסים, פולני להבת קצה החתך מעל מבער בונזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דגים עובריים עד 4 ימים לאחר הפריה (DPF) ב -10 סנטימטרים בצלחות פטרי במדיום עובר E3 דג הזברה על 28.5 ○ ג פעמיים בכל יום, להשתמש בלהבה מלוטשת סיימה פיפטה העברה חד פעמית כדי להסיר כל ביצים מופרות או עוברים מתים (מראה אטום לבן). ברגע שכל יום, להחליף בינוני עובר E3. יוצקים את מדיום עובר E3, להסיר נוזל שנותר בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה, ולהוסיף גב בינוני מחומם מראש (28.5 ○ C) E3 עובר. </li></ol> 2. הכן Assay פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון assay לפי טבלת 1. פתרון assay סינון סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני assay ייזום, לחמם את פתרון assay סטרילי ב28.5 ○ גאמבטיית מים. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מַרכִּיב </td><td> % מסך הכל </td><td> נפח (μl / 10 מיליליטר) </td></tr><tr><td> העובר בינוני 60x E3 </td><td> 1.667 </td><td> 166.7 </td></tr><tr><td> deionized זוגי H (DDI) 2 0 </td><td> 96.233 </td><td> 9,623.3 </td></tr><tr><td> Alamar הכחול </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 מ&quot;מ NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. Assay בינוני .3 בצע Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את עוברי דג הזברה 3 פעמים עם מדיום עובר סטרילי המסונן E3. מערבבים את כל עוברי דג הזברה קיימא מהמצמד לתוך כוס. סינון סטרילי 75 מיליליטר בינוני עובר E3. בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה, מחדשלהעביר כמה שיותר מבינוני עובר E3 מעוברי דג הזברה ככל האפשר. להוסיף חזרה 20 מיליליטר בינוני עובר סטרילי מסונן E3. להסיר ולהחליף בינוני עובר E3 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת דגים 1 לכל 93 בארות של שחור 96-גם צלחת צדדית ברור תחתונה. מעבירים את הדג לצלחת העוברי על ידי בנפרד לכידת עובר בתוך להבה מלוטשת סיימה פיפטה העברת פלסטיק חד פעמית (שלב 1.5) ובעדינות ולהוציא לתוך הבאר. העבר את מדיום עובר E3 נלקח מהכוס המכילה דגים שטפו לתוך 3 הבארות ריקות. הדבר מבטיח כי בארות ריקות נחשפו לאותו מים כבארות המכילות דגים. שתי הבארות המכילות דגים ובארות ריקות צריכה להיות לפחות חצי מלאה (200 μl) בסיומו של שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עובר E3 עם פתרון assay בכל 96 הבארות, כולל בארות ריקות. צעד זה צריך להתבצע בטור 1 בזמן לכל אחד מ -12 העמודים בצלחת גם 96. שימוש בטיפ נאה טרנס חד פעמיפיפטה FER, להסיר בינוני עובר E3 מכל טוב בטור אחד של הצלחת (8 בארות). יש להיזהר שלא לגעת בעובר דג הזברה. להוסיף 300 μl של פתרון assay היטב כל אחד מהמים שהוסרו. חזור על הסרת בינונית עובר E3 והחלפה עם פתרון assay לכל 12 העמודים של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי לבדוק את שינוי קצב חילוף חומרים בתגובה למתחם, להפוך את פתרון שהוא פי 100 (100X) ריכוז הטיפול הרצוי. ראוי לציין, להבטיח כי הפתרון 100x אינו עולה על 10% DMSO להגביל את ריכוז DMSO הסופי ללא יותר מ -0.1%. הוסף 3 μl של פתרון 100x לכל אחד מבארות הטיפול. הערה: לבצע חישובי כוח להעריך את מספר בארות טיפול. עם זאת, ללא אומדן הגודל של תגובה או וריאציה, משפט ראשוני ניתן להפעיל במתחם 8 טופל ו8 בארות שליטה ברכב שטופל המכילות דגים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של שליטה ברכב לביקורת (ללא DRUטיפול ז) בארות המכילות דגים. כדי להבטיח שתגובת הניאון למתחם היא תוצאה של פעולות בתוך הדגים, חלים טיפולים תרופתיים ורכב עד 3 בארות ריקות בצלחת גם 96. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו צלחת מלאה דגים על קורא צלחת ניאון עם גל עירור ב530 ננומטר ואורך גל פליטה ב590 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום לחממת humidified מוגדרת 28.5 ○ C (לשמור על צלחת בחושך לאורך assay כדי למנוע photobleaching של פתרון assay). Assay ניתן להפעיל לתקופות הזמן שנעו בין שעות 1 עד 24 שעות. משך assay תלוי במטרה של המחקר. לבדיקת התגובה למתחם קצר משחק שאינו יציב זמן קצר עשוי להיות מתאים ביותר. עם זאת, לבדיקות יציבה מתחם או בדיקות של השפעות גנטיות, למקסם את משך assay עדיף לנצל את היתרונות הקשורים לאות המצטברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת זמן שנקבע מראש (ראה שלב 3.6 כדי לקבוע עיתוי)לקרוא הקרינה של צלחת מלא דגים שוב עם אותן ההגדרות כמו שלב 3.5. </li></ol> 4. להעריך את השינוי היחסי בקרינה הקשורים לטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב שינוי בקרינה של כל אחד גם על ידי הפחתת הקרינה בזמן 0 מהקרינה בסיומו של המחקר. ולס ללא דגים (חסר) צריך להיות ערכים ליד 0, הרבה מתחת לערכים מבארות המכילות דגים. שינוי בקרינה = הקרינה במסקנה - הקרינה בזמן 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לברר את השינוי היחסי בקרינה, לחשב את השינוי הממוצע בקרינה לבארות שליטה אז לחלק את השינוי בקרינה של כל אחד גם על ידי השינוי הממוצע בקרינה של בארות השליטה. ראוי לציין, בקרות יכולות להיות גם בקרות רכב או בקרות גנטיות. <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li><li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter/driver+genes+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+engineering.">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545 (2014).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile.">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li><li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish.">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li><li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals.">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li><li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish.">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish, A practical approach. , (2002).</li><li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature.">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li><li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity.">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li><li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost.">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li><li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner.">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li><li>Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549 (2012).</li><li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+obesogenic+test:+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity.">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

זיהום בחיידקים או פטריות יגביל מאוד יישום של assay זה. מתילן הכחול במדיום עובר E3 מגביל את האפשרות של זיהום פטרייתי. לאורך עובר גידול זה קריטי, כי הטיפול נלקח כדי להסיר עוברים מתים פעמיים בכל יום. בנוסף, זה חיוני כדי לשטוף ביסודיות את העוברים עם מדיום עובר E3 סטרילי ביום הח?...

העכבר הוא כיום המודל הדומיננטי למחקר השמנה. מרווח הדור הקצר וכלים גנטיים זמינים בעכבר היו אח ורע עד כה. עם זאת, דג הזברה יש גם מרווח קצר דור (3 - 4 חודשים) ועולה אפילו העכבר בקלות המניפולציה גנטית 1,2. דג הזברה שומרת כמעט 90% מהגנים של יונקים, ואילו עלה בהרבה על העכבר במספר הצאצאים והפוטנציאל לשימוש במסכים גנטיים וסמים 3. כדי לנצל את הפוטנציאל של מודל דג הזברה ללימודים בהשמנה יתר, מבחני חייבים להיות מפותחים כדי לחקור גורמים המשפיעים על ויסות משקל גוף, כוללים הוצאה אנרגיה. כמעובדים מטבוליטים באמצעות β-חמצון וחמצן מחזור חומצת tricarboxylic הוא נצרך וNADH 2 מיוצר. לפיכך, NADH 2 הוא מדד ישיר לשטף של מטבוליטים דרך מסלולים מטבוליים (חמצון המטבוליט). בpoikilotherms, H + לדלוף דרך הממברנה של המיטוכונדריה הפנימית, שuncouples NADH 2 חמצון מסינתזת ATP, היא 4 - 5 פי נמוך יותר מאשר בhomeotherms 4. בהתאם לכך, בNADH דג הזברה 2 קשורים מאוד הדוק לייצור ATP באמצעות זרחון חמצוני. בזאת, אנו מתארים assay המודד NADH 2 ייצור בדג הזברה זחל כמדד להוצאת האנרגיה 5. צריכת חמצן היא תקן הזהב למדידת הוצאות אנרגיה. ובכל זאת, כדי לנצל את פוטנציאל תפוקה הגבוה של דג הזברה הטוב ביותר, מבחני של הוצאה האנרגיה חייבים להיות נוחים לתפוקה גבוהה. מערכות צריכת חמצן שתלוי בחדר סגור במחזור המערכת מוגבלות בתפוקה במספר התאים זמינים 6. O האוויר הפתוח 2 הצריכה / CO 2 מבחני הפקה גם יושמו ב5,7 דג הזברה. בסיס צלחת אלה באוויר פתוח 96-היטבמערכות ד נוחות לתפוקה גבוהה. למרבה הצער, חילוף גזים עם הסביבה מגביל את רגישות של מבחני אלה. לאחרונה פרסמו את היישום של assay המנטר NADH 2 באמצעות מחוון חיזור alamarBlue 5. assay זה מתגבר על המגבלות בתפוקה וברגישות משותפת לניתוחים של צריכת חמצן בדג הזברה. דג הזברה הופכת מודל חשוב יותר ויותר ללימודים של הומאוסטזיס אנרגיית גוף כולו. בחלקו, כי דג הזברה הם נוחים לשימוש במסכים גנטיים קדימה ומסכי סמים. יתר על כן, ממוקד מניפולציה גנטית, כולל מציאה ולדפוק ב, יכול להיות מיושם במהירות. הראינו בעבר כי assay זה יכול להיות משולב עם יישום תרופת אמבטיה ומציאה גנטית או נוקאאוט לזהות תרכובות וגנים שמשנים את קצב חילוף חומרים 5. יתר על כן, assay זה נועד לנצל את היתרונות הגלומים לתפוקה הגבוהה דג הזברה. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="966">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">AlamarBlue</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10-230-103</td>
			<td style="width:307px;">Manufactured by Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-26</td>
			<td>Manufactured by Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-771-9AM</td>
			<td>Manufactured by Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Black sided clear bottom 96-well plates</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-320-785</td>
			<td>Manufactured by E&#38;K Scientific Products Inc.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput danio rerio energy expenditure assay

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב עם יתרונות הגלומים שיש לו את הפוטנציאל להפוך את דג הזברה מודל מיושם באופן נרחב למחקר של הומאוסטזיס אנרגיה והשמנת יתר. גדליו הקטנים של דג הזברה מאפשר למבחנים בעוברים להתנהל במתכונת צלחת 96 או 384 גם, טכנולוגיות מבוססות Morpholino וCRISPR לקדם קלות המניפולציה גנטית, וטיפול תרופתי על ידי יישום אמבטיה הוא בת קיימא. יתר על כן, דג הזברה הן אידיאלי עבור מסכי גנטיים קדימה ומאפשרים לגילוי גנים חדש. בהתחשב בחידוש היחסי של דג הזברה כמודל להשמנה, יש צורך לפתח כלים שמנצלים באופן מלא את היתרונות הללו. בזאת, אנו מתארים שיטה למדידת הוצאה אנרגטית באלפי דג הזברה העוברית בו-זמנית. פיתחנו פלטפורמת microplate בעלי החיים שלמה שבו אנו משתמשים 96-גם צלחות לבודד את הדגים בודדים ואנו מעריכים NADH 2 ייצור מצטבר באמצעות כדאיות תרבית תאים הזמינות המסחרית מחדשסוכן alamarBlue. בpoikilotherms היחסים בין NADH 2 ייצור והוצאת אנרגיה קשור בחוזקה. assay ההוצאה אנרגיה זו יוצר פוטנציאל למסך במהירות מניפולציות תרופתיות או גנטיות הישירות לשנות הוצאה אנרגיה או לשנות את התגובה לתרופה שימושית (למשל רגישות לאינסולין).

פתרון assay אינו מגדיל הקרינה בהיעדר דגים עובריים (איור 1). עם זאת, assay הוא רגיש מאוד לשינויים קטנים בקצב חילוף חומרים בתוך הבאר. דגים יחידים בתוך היטב יוצרים אות שונה באופן משמעותי מבארות ריקות בתוך שעה 1 (P &lt;0.0001). איור 2 מספק ייצוג חזותי של אותות שנוצרו ע...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay at JoVE.com

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

12.6K Views.  Vanderbilt University Medical Center. Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery. 

Video: High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection גרוס פיין epithelia של האוזן הפנימית חושית למבוגרים דג הזברה ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

טיפול קבוע ותחזוקה של דג זברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) מעבדה: מבוא

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...