هذا البروتوكول سهل الأداء. وتسمح مرحلة الاستنساخ بالحصول على عدد أكبر من استنساخات تي من عينات جديدة. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة تحليل النمط الظاهري ووظيفة الخلايا التائية.
إثبات الإجراء سيكون ماري كريستوفر، طالبة دكتوراه من مختبري. للحث على استنساخ الخلايا التائية، استخدم مسمار الكيس مع الصمام الخالي من الإبر لفتح كيس معطف برتقالي مشع في غطاء تدفق صفح. نقل ما يصل إلى 50 ملليلتر من الدم من الحقيبة إلى قارورة T-150، وإضافة 70 ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى القارورة.
طبقة بعناية 30 ملليلتر من الدم المخفف على 20 ملليلتر من التدرج الكثافة في كل من أربعة أنابيب مخروطية 50 ملليلتر، وفصل الخلايا حسب الكثافة التدرج الطرد المركزي. يستنشق بعناية supernatant، ونقل PBMC من كل أنبوب في أنبوب واحد جديد 50 ملليلتر. استخدم برنامج تلفزيوني لجلب الحجم النهائي إلى 50 ملليلتر وجمع PBMC عن طريق الطرد المركزي.
بعد غسل الثانية في ظل نفس الظروف، تعليق الخلايا المغذية معزولة في 10 ملليلتر من الخلايا ثقافة المتوسطة للعد، وإضافة 25 ملليلتر من 70 ملليلتر خلية ثقافة المتوسطة تكملها 50 وحدة من محلول IL-2 في كل من اثنين من أنابيب 50 ملليلتر. ثم إضافة خلايا التغذية إلى أنبوب واحد في 2 في 10 إلى الخلايا 6 لكل ملليلتر من خلية الثقافة المتوسطة تكملها IL-2 التركيز. لإعداد ثقافة الخلايا الليمفاوية T، تجمع استنساخ الخلية T التي تحتوي على قوارير من قارورة عينة الصمام الاستنهالي في أنبوب واحد 50 ملليلتر، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
غسل بيليه ثلاث مرات في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل، قبل إعادة تعليق الخلايا في 1 ملليلتر من الخلايا ثقافة المتوسطة للعد. تمييع الخلايا إلى 1 في 10 إلى الخلايا 3 لكل تركيز ملليلتر، وإضافة 500 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب متوسط ثقافة الخلية تكملها IL-2 دون الخلايا المغذية. أضف تعليق الخلية المغذية إلى طبق بيتري بلاستيكي 100 في 15 ملليلتر، وأضف 100 ميكرولتر من الخلايا المغذية إلى كل بئر من العدد المناسب من لوحات U-bottom ذات 96 بئرا للتجربة.
ثم أضف الخلايا التائية إلى طبق بيتري، وأضف 100 ميكرولتر من الخلايا التائية إلى كل خلية مغذية تكملها بشكل جيد لمدة أسبوع واحد حضانة في حاضنة ثقافة الخلية. عزل PBMC أمر حيوي للحصول على الخلايا المغذية وتمكين الكشف وتوصيف الكريات البيض المتسللة في عينات الصمام الأبهري. بعد أسبوعين من الحضانة، يمكن الحصول على استنساخ الخلايا التائية.
هنا ، يتم عرض مخطط gating لتحليل الخلايا التائية الفرعية في المرضى الذين يعانون من مرض الصمام الأبهري الكالسيوم. كما لوحظ في هذا المريض، كان هناك خلايا CD4+ T أكثر من خلايا CD8+ T. يؤكد تحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية غير الملونة أن نفس علامات الخلايا التائية موجودة في عينات الصمام الأصلي واستنساخها.
إذا ما أخذت هذه البيانات معا، فإنها تشير إلى وجود خلايا T في الصمامات الأبهرية المتكلسة مع الكريات البيض CD45+، مما يشير إلى أن مرض الصمام الأبهري الكالسيومي مرتبط بتنشيط الجهاز المناعي والنشاط الالتهابي. هذا الأسلوب هو تنوعا جدا. ويمكن تطبيقه على بروتوكولات مختلفة يحتاج الباحث إلى أن يكون قادرا على عزل الخلايا عن الأنسجة، من أجل التوصيف الوظيفي.
ضع في اعتبارك أنه من المهم العمل في ظل ظروف معقمة لتجنب التلوث ، ومراقبة الخلايا تحت المجهر بشكل نقدي.
