Name: cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
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The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

1. La crescita e Harvest delle cellule di lievito <ol><li> Se non analizzando la cinetica di degradazione di una proteina endogena lievito, trasformare ceppo di lievito desiderato (s) con un plasmide codificante la proteina di interesse. Metodi affidabili per il lievito di trasformazione sono stati precedentemente descritti 37. </li><li> Seminare lievito in 5 ml di terreno appropriato (ad esempio, definito (SD) mezzo sintetico selettivo per manutenzione plasmide di cellule trasformate o) medium lievito non selettivo extract-peptone-destrosio (YPD per le cellule non trasformate). Incubare per una notte a 30 ° C, rotante. NOTA: 30 ° C è la temperatura di crescita ottimale per tipica wild-type ceppi di laboratorio di lievito 38. Tuttavia, poiché alcuni ceppi di lievito mutanti non crescono in modo ottimale a 30 ° C e alcune proteine ​​subiscono degradazione dipendente dalla temperatura, le temperature utilizzate per la crescita cellulare del lievito e cicloesimide chase dovrebbero essere determinati empiricamente 39. </li><li> misurare °densità ottica e a 600 nm (OD 600) di ogni cultura durante la notte. NOTA: Le cellule possono essere in fase di crescita logaritmica o stazionaria ma avrebbe minimamente raggiunto una densità che permetterà di diluizione ad una OD 600 = 0.2 in 15 ml di mezzo fresco. </li><li> Diluire le culture durante la notte per un valore di 600 OD di 0,2 a 15 ml di terreno fresco. </li><li> Incubare lievito a 30 ° C, agitando fino a quando le cellule raggiungono fase di crescita medio logaritmica (cioè, un OD 600 tra 0,8 e 1,2). </li><li> Durante la crescita delle cellule di lievito, eseguire le seguenti in preparazione per la procedura cicloesimide chase: <ol><li> Impostare un blocco di calore che può ospitare 15 ml provette coniche da 30 ° C per l&#39;incubazione delle cellule in presenza di cicloesimide. Aggiungere l&#39;acqua ai pozzi del blocco di calore per consentire la distribuzione di calore efficiente alle culture. Aggiungere acqua a ciascun pozzetto tale che un tubo da 15 ml causerà il livello dell&#39;acqua a salire a, ma non troppo pieno, il bordo del pozzo. </li><li> Impostare un secondo blocco di calore che può ospitare provette da 1,5 ml microcentrifuga a 95 ° C per la denaturazione proteica seguenti lisi cellulare. </li><li> medio Pre-caldo crescita fresco (1,1 ml per punto di tempo per la cultura per essere analizzati) a 30 ° C. </li><li> Aggiungere 50 ml 20x stop Mix di pre-etichettati microprovette (un tubo per volta punto per ogni cultura deve essere analizzato). Mettere i tubi in ghiaccio. ATTENZIONE: sodio azide, un ingrediente in 20x arresto Mix, è tossico tramite ingestione o contatto dermico. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e sodio azide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore. </li></ol></li><li> Quando le cellule hanno raggiunto una crescita mid-logaritmica, raccogliere 2,5 OD 600 unità di ogni cultura per ogni punto di tempo per essere analizzato (ad esempio, 7,5 OD 600 unità per analizzare l&#39;abbondanza di proteine ​​a tre punti di tempo). Centrifuga raccolte le cellule in 15 ml provette coniche a 3,000 xg a temperatura ambiente per 2 min. NOTA: Un OD 600 unità è uguale alla quantità di lievito presente in 1 coltura ml ad una OD 600 di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere X OD 600 unità (V) può essere determinato utilizzando la seguente equazione: V = X OD 600 unità / OD 600 misurato. Ad esempio, per raccogliere 7,5 OD 600 unità di coltura cellulare di lievito ad una OD 600 di 1,0, raccogliere 7,5 OD 600 unità / 1,0 = 7,5 ml coltura di lievito. </li><li> Risospendere ogni pellet di cellule in 1 ml di 30 ° C (pre-riscaldato) mezzo di crescita fresco per 2,5 OD 600 unità di cellule (ad esempio, 3 ml per 7,5 OD 600 unità). </li></ol> 2. Cycloheximide Chase <ol><li> Equilibrare sospensioni cellulari di lievito mediante incubazione per 5 minuti nel blocco C di calore 30 °. </li><li> Preparare un timer a contare da 0:00. </li><li> Per iniziare l&#39;inseguimento cicloesimide, premere il tasto &quot;Start&quot; sul timer. rapidamente,ma attenzione, effettuare le seguenti operazioni: <ol><li> Aggiungere cicloesimide ad una concentrazione finale di 250 mg / ml di sospensione cellulare prima di lievito (ad esempio, aggiungere 37,5 ml di 20 mg / ml di cicloeximide a 3 ml di sospensione cellulare), e vortex brevemente per miscelare. ATTENZIONE: Cicloeximide è un irritante cutaneo ed è tossico tramite l&#39;ingestione orale. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e cicloesimide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;aggiunta di cicloesimide e vortex, trasferire 950 ul (~ 2,4 OD 600 unità) della sospensione di cellule di lievito con cicloesimide aggiunto ad una provetta di pre-etichettati contenente 50 ml mix 20x fermata ghiacciata. Agitare la provetta, e posto sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti. </li><li> Riportare la sospensione cellulare di lievito a 30 ° C. </li></ol></li><li> Ripetere passaggi 2.3.1 attraverso 2.3.3 Per ciascuno dei restanti sospensioni cellulari di lievito a intervalli di tempo regolari (ad esempio, ogni 30 secondi, in modo tale che viene aggiunto al campione cycloheximide 1 # alle 0:00, Esempio # 2 alle 0:30, Esempio # 3 a 1:00 , ecc.). </li><li> Ad ogni punto di tempo successivo, le sospensioni vortice di cellule di lievito e il trasferimento di 950 ml per provette da microcentrifuga etichettati contenenti 50 ml di pre-raffreddata 20x stop Mix. Vortex e cellule di posizione raccolti su ghiaccio. Rientro 15 ml provette coniche a 30 ° C blocco di calore. <ol><li> Ad esempio, per la raccolta di cellule 30 min dopo l&#39;aggiunta cicloesimide (supponendo 30-sec intervalli tra oltre cicloesimide per sospensioni di cellule di lievito all&#39;inizio del corso tempo), vortex e rimuovere 950 ml di sospensione cellulare da Esempio # 1 a 30:00 . Ripetere per esempio # 2 a 30:30, e così via. NOTA: per impedire sedimentazione di lievito, sospensioni cellulari vortice in 15 ml provette coniche circa ogni 5 min durante tutto il corso della caccia. In alternativa, la sospensione cellula di lievitos può essere mantenuta in un bagno di acqua di continuo agitazione per tutta la durata dell&#39;esperimento cicloesimide caccia. </li></ol></li><li> Quando tutti i campioni sono stati raccolti, pellet raccolte le cellule per centrifugazione a 6.500 xg a temperatura ambiente per 30 sec. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. Le cellule sono ora pronti per lisi alcalina. In alternativa, le cellule pellet in azoto liquido e conservare freeze scatto a -80 ° C. </li></ol> 3. Post-alcalina Protein Extraction (Modificata da 16,40) <ol><li> Aggiungere 100 ml di acqua distillata a ciascun pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù o vortex. </li><li> Aggiungere 100 pl di 0,2 M NaOH per ogni campione. Mescolare pipettando su e giù o vortex. </li><li> Incubare le cellule in sospensione a temperatura ambiente per 5 min. In questa fase, le cellule di lievito non sono state lisate, e proteine ​​non sono stati rilasciati 40. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 18.000 xg a carattere localeature per 30 sec. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. </li><li> Per lisare cellule, aggiungere 100 ml di tampone campione Laemmli a ciascuna pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù o vortex. NOTA: l&#39;incubazione sequenziale delle cellule con il tampone rilascia NaOH e Laemmli proteine ​​in una forma compatibile con dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone di corsa Tris-glicina. </li><li> Incubare a 95 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine ​​completamente. NOTA: incubazione a 95 ° C può non essere adatto per l&#39;analisi di proteine ​​che sono inclini a aggregazione (ad esempio, proteine ​​con diversi segmenti transmembrana). Queste proteine ​​possono diventare insolubile quando incubate a temperature elevate 41. Così, per l&#39;analisi di tali proteine, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio, 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 minuti, come determinato empiricamente. </li><li> lisati centrifugare a 18.000 xga rotemperatura om per 1 min per far sedimentare il materiale insolubile. Il supernatante (proteina estratta solubilizzati) è pronto per separazione mediante SDS-PAGE e successiva analisi western blot. In alternativa, conservare lisati a -20 ° C. </li></ol> 4. Rappresentante SDS-PAGE e Western Blotting procedura (Adattato da 16) <ol><li> Carico proteine ​​standard di peso molecolare e determinato empiricamente volume di lisati su un gel SDS-PAGE. NOTA: Scegliere la percentuale di acrilamide e bis-acrilammide nel gel SDS-PAGE in base al peso molecolare della proteina di interesse. In generale, più bassi gel percentuali sono più adatti per risolvere superiori proteine ​​peso molecolare. </li><li> Eseguire gel a 200 V fino a quando il fronte del colorante ha raggiunto il bordo inferiore del gel. </li><li> Trasferire proteine ​​dal gel di fluoruro di polivinilidene membrana (PVDF) mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C. </li><li> Bloccare membrana incubando in Tris-Buffered Saline (TBS) contenente 5% di latte scremato, dondolo, a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 ° C durante la notte. NOTA: per evitare la crescita microbica in presenza di una membrana incubate durante la notte, si raccomanda di includere azide di sodio nella soluzione di blocco ad una concentrazione finale di 0,02%. </li><li> Incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) e 1% di latte scremato, dondolo, a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo. </li><li> Incubare a membrana con appropriata anticorpo secondario fluoroforo coniugato in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo. NOTA: Fluorofori sono sensibili alla luce. Pertanto, diluizioni di anticorpi coniugati a fluorofori devono essere preparati al buio, e l&#39;incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati a fluorofori e successive fasi di lavaggio dovrebbe avvenire a tenuta di luce (ad esempio, un foglio-avvolto) containers. </li><li> Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo. </li><li> membrana delle immagini con LI-COR Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), seguendo le raccomandazioni del produttore. </li><li> Dopo immagine membrana acquisizione, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per una proteina di controllo di carico in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo. </li><li> Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo. </li><li> Incubare a membrana con appropriata anticorpo secondario fluoroforo coniugato in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo. </li><li> Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo. </li><li> Immagine membrana come al punto 4.9. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In questo documento, un metodo per analizzare la cinetica di degradazione delle proteine ​​è presentato. Questa tecnica può essere facilmente applicata ad una gamma di proteine ​​degradate da una varietà di meccanismi. È importante notare che gli esperimenti cicloesimide chase riferire sulla cinetica di degradazione del pool stato stazionario di una data proteina. Altre tecniche possono essere utilizzate per analizzare la cinetica di degradazione di specifiche popolazioni di proteine. Ad esempio, il destino ...

Le proteine ​​svolgono funzioni cruciali praticamente in ogni processo cellulare. Molti processi fisiologici richiedono la presenza di una specifica proteina (o proteine) per un determinato periodo di tempo o in particolari circostanze. Organismi quindi controllare e regolare l&#39;abbondanza di proteine ​​per soddisfare le esigenze cellulari 1. Ad esempio, cicline (proteine ​​che controllano la divisione cellulare) sono presenti in specifiche fasi del ciclo cellulare, e la perdita di livelli di ciclina regolamentati è stata associata con la formazione di tumore maligno 2. Oltre a regolare i livelli di proteine ​​per soddisfare le esigenze cellulari, le cellule utilizzano meccanismi di controllo della qualità degradativi di eliminare mal ripiegate, non montati, o in altro modo aberranti molecole proteiche 3. Controllo di abbondanza di proteine ​​comporta regolazione sia la sintesi macromolecolari (trascrizione e traduzione) e la degradazione (RNA decadimento e proteolisi). degradazione delle proteine ​​deteriorate o eccessivo contribuisce a molteplici patologie, Tra cui il cancro, fibrosi cistica, malattie neurodegenerative, disturbi cardiovascolari e 4-8. Meccanismi proteolitici rappresentano quindi bersagli terapeutici promettenti per una serie di malattie 9-12. L&#39;analisi delle proteine ​​in un unico punto di tempo (ad esempio, da Western Blot 13, citometria a flusso 14, o microscopia a fluorescenza 15) fornisce un&#39;istantanea di costante abbondanza di proteine ​​stato senza rivelare i relativi contributi di sintesi o degradazione. Allo stesso modo, le analisi giornalista di crescita a base riflettono costanti i livelli di proteina stato più di un periodo di tempo prolungato senza discriminazioni tra le influenze di sintesi e degradazione 15-20. È possibile dedurre il contributo dei processi degradativi a livelli proteici stato stazionario confrontando abbondanza prima e dopo inibendo componenti specifici del meccanismo degradativa (ad esempio, dal farmacologicamente inattivando la proteasome 21 o buttare giù un gene ipotizzato per essere necessari per la degradazione 13). Un cambiamento nei livelli di proteina regime permanente dopo inibendo percorsi degradativi fornisce una forte evidenza per il contributo della proteolisi per il controllo delle proteine ​​dell&#39;abbondanza 13. Tuttavia, una tale analisi ancora non fornisce informazioni per quanto riguarda la cinetica del turnover proteico. Chase Cycloheximide seguita da western blotting supera queste debolezze, consentendo ai ricercatori di visualizzare la degradazione delle proteine ​​nel tempo 22-24. Inoltre, poiché la rilevazione delle proteine ​​seguente cycloheximide Chase è in genere eseguita da western blotting, isotopi radioattivi e passaggi immunoprecipitazione lunghi non sono necessari per cycloheximide caccia, a differenza di molte tecniche di inseguimento di impulso comunemente utilizzate, che sono anche eseguite per visualizzare la degradazione delle proteine ​​25. Cycloheximide è stato identificato come un composto anti-fungine correttalegami prodotte dai Streptomyces batterio gram-positivo griseus 26,27. Si tratta di una molecola cellula-permeabile che inibisce specificamente citosolico eucariote (ma non organelli) Traduzione alterando ribosomiale traslocazione 28-31. In un esperimento cicloesimide chase, cycloheximide viene aggiunta alle cellule, e aliquote di cellule vengono raccolti immediatamente e in punti temporali specifici seguenti aggiunta del composto 22. Le cellule sono lisate, e l&#39;abbondanza di proteine ​​in ogni punto viene analizzato, in genere western blot. Diminuisce in abbondanza di proteine ​​dopo l&#39;aggiunta di cycloheximide può essere tranquillamente attribuita alla degradazione delle proteine. Una proteina instabile diminuirà in abbondanza nel tempo, mentre una proteina relativamente stabile esporrà piccolo cambiamento in abbondanza. Meccanismi di degradazione delle proteine ​​selettivo sono state altamente conservata in tutta Eukarya. Molto di ciò che si conosce la degradazione delle proteine ​​primo è stato appreso inil modello eucariote unicellulare, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito) 25,32-36. Studi con il lievito sono suscettibili di continuare a fornire spunti nuovi ed importanti nella degradazione delle proteine. Un metodo per cicloesimide inseguimento in cellule di lievito seguita da Western blot di abbondanza di proteine ​​è presentato qui.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>A tube roller is recommended to maintain overnight&amp;nbsp; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&amp;nbsp;</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heaters</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &amp;deg;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td></tr><tr><td>Heating block for 12 x 15 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td></tr><tr><td>Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Regolamento di abbondanza di proteine ​​è fondamentale per praticamente ogni processo cellulare. Proteina abbondanza riflette l&#39;integrazione delle aliquote di sintesi proteica e la degradazione delle proteine. Molti saggi di relazioni su abbondanza di proteine ​​(per esempio, in tempo unico punto western blotting, citometria a flusso, microscopia a fluorescenza, o saggi di crescita giornalista-based) non consentono la discriminazione degli effetti relativi di traduzione e proteolisi sui livelli di proteine. Questo articolo descrive l&#39;uso di cycloheximide caccia seguita da Western blotting per analizzare specificamente degradazione delle proteine ​​nel modello eucarioti unicellulari, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito). In questo procedimento, cellule di lievito vengono incubate in presenza di cicloesimide inibitore traduzionale. Aliquote di cellule vengono raccolte subito dopo e in punti temporali specifici seguenti aggiunta di cicloesimide. Le cellule sono lisate, e lisati sono separati da gel di poliacrilammide for analisi Western Blot di abbondanza di proteine ​​in ogni punto. La procedura cicloeximide chase permette la visualizzazione della cinetica di degradazione della popolazione stato stazionario di una varietà di proteine ​​cellulari. La procedura può essere utilizzata per studiare i requisiti genetici per e influenze ambientali sulla degradazione delle proteine.

Per illustrare la metodologia caccia cicloesimide, la stabilità del Deg1 -Sec62 (figura 1), un substrato modello di lievito reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD), è stato analizzato 42-44. In ERAD, il controllo di qualità enzimi ubiquitina ligasi covalente attribuiscono catene del piccolo ubiquitina proteine ​​di proteine ​​aberranti localizzate alla membrana ER. Tali proteine ​​polyubiquitylated vengono successi...

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Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

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Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.8K Views.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

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Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

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Immunologia e infezioni

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biologia

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

Determinazione della durata della fase S mediante incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

Saccharomyces cerevisiae Yeast as a Model Organism

Introduzione a Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

Didattica

JoVE Science Education

Biologia di base

Biologia I: lieviti, drosophila e c. elegans

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Saggio di degradazione delle proteine incline al ripiegamento errato: una tecnica per monitorare la degradazione delle proteine mal ripiegate utilizzando il trattamento con cicloesimide e il frazionamento dei detergenti

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine in

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione

Misura di mRNA Decay Prezzi in

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in

Determinazione della durata della fase S mediante incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina in Saccharomyces cerevisiae

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Introduzione a Saccharomyces cerevisiae

Saggio di degradazione delle proteine incline al ripiegamento errato: una tecnica per monitorare la degradazione delle proteine mal ripiegate utilizzando il trattamento con cicloesimide e il frazionamento dei detergenti

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in

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Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

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Misura di mRNA Decay Prezzi in

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in

Determinazione della durata della fase S mediante incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina in Saccharomyces cerevisiae

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Introduzione a Saccharomyces cerevisiae

Saggio di degradazione delle proteine incline al ripiegamento errato: una tecnica per monitorare la degradazione delle proteine mal ripiegate utilizzando il trattamento con cicloesimide e il frazionamento dei detergenti

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine in

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