The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

1. Croissance et récolte des cellules de levure <ol><li> Dans le cas contraire l&#39;analyse de la cinétique de dégradation d&#39;une protéine endogène de levure, transformer la souche (s) de levure désirée avec un plasmide codant pour la protéine d&#39;intérêt. Des méthodes fiables pour la transformation de la levure ont été décrits précédemment 37. </li><li> Inoculer levure dans 5 ml de milieu approprié (par exemple, synthétique défini (SD) milieu sélectif pour le maintien du plasmide des cellules transformées ou des levures non-sélective extrait-peptone-dextrose (YPD) moyen pour les cellules non transformées). Incuber une nuit à 30 ° C, en rotation. NOTE: 30 ° C est la température optimale de croissance pour de type sauvage typique des souches de laboratoire de levure 38. Cependant, parce que certaines souches de levure mutantes ne se développent pas de façon optimale à 30 ° C et certaines protéines subissent une dégradation dépendant de la température, les températures utilisées pour la croissance des cellules de levure et de poursuite de la cycloheximide doivent être déterminées empiriquement 39. </li><li> Mesure ee densité optique à 600 nm (DO 600) de chaque culture d&#39;une nuit. REMARQUE: Les cellules peuvent être en phase de croissance logarithmique ou stationnaire , mais aurait au minimum atteint une densité qui permet une dilution à une DO600 = 0,2 dans 15 ml de milieu frais. </li><li> Diluer les cultures d&#39;une nuit à une DO 600 valeur de 0,2 à 15 ml de milieu frais. </li><li> Incuber la levure à 30 ° C, en agitant jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique moyenne ( par exemple, une DO600 comprise entre 0,8 et 1,2). </li><li> Au cours de la croissance des cellules de levure, effectuer les opérations suivantes en préparation de la procédure de poursuite de cycloheximide: <ol><li> Définir un bloc chauffant qui peut recevoir 15 ml tubes coniques à 30 ° C pendant l&#39;incubation des cellules en présence de cycloheximide. Ajouter de l&#39;eau dans les puits du bloc thermique pour permettre une distribution efficace de la chaleur vers les cultures. Ajouter de l&#39;eau à chaque puits de telle sorte qu&#39;un tube conique de 15 ml provoquera le niveau d&#39;eau monte, mais sans déborder, la lèvre du puits,. </li><li> Définir un second bloc de chaleur qui peut recevoir 1,5 ml microtubes à 95 ° C pour la dénaturation des protéines suivantes lyse cellulaire. </li><li> milieu de croissance frais Préchauffer (1,1 ml par point de temps par la culture à doser) à 30 ° C. </li><li> Ajouter 50 ul 20x Arrêter Mix pré-étiquetés microtubes (un tube par point de temps par la culture à doser). Placer les tubes sur la glace. ATTENTION: L&#39;azoture de sodium, un ingrédient 20x Arrêter Mix, est toxique par ingestion ou par contact cutané. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation de l&#39;azoture de sodium. En cas d&#39;exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant. </li></ol></li><li> Lorsque les cellules ont atteint une croissance de mi-logarithmique, recueillir 2,5 OD 600 unités de chaque culture par point de temps à analyser (par exemple, 7,5 OD 600 unités pour analyser l&#39; abondance de protéines à trois points de temps). Centrifugeuse recueilli les cellules dans 15 ml tubes coniques à 3,000 g à la température ambiante pendant 2 min. REMARQUE: une unité DO600 est égale à la quantité de levure présente dans 1 ml de culture à une DO600 de 1,0. Le volume de la culture (en ml) nécessaire pour récolter X OD 600 unités (V) peut être déterminée en utilisant l&#39;équation suivante: V = X OD 600 unités / OD 600 mesurée. Par exemple, la récolte de 7,5 unités DO 600 de la culture de cellules de levure à une DO600 de 1,0, de recueillir 7,5 DO 600 unités / 1,0 = 7,5 ml de culture de levure. </li><li> Resuspendre chaque culot cellulaire dans 1 ml de 30 ° C (préchauffée) milieu de croissance frais par 2,5 OD 600 unités de cellules (par exemple, 3 ml pour 7,5 OD 600 unités). </li></ol> 2. cycloheximide Chase <ol><li> Equilibrer suspensions de cellules de levure par incubation pendant 5 min dans le bloc C de chaleur de 30 °. </li><li> Préparer une minuterie pour compter de 0:00. </li><li> Pour commencer la chasse de cycloheximide, appuyez sur &quot;Démarrer&quot; sur la minuterie. Rapidement,mais soigneusement, procédez comme suit: <ol><li> Ajouter la cycloheximide à une concentration finale de 250 ug / ml à la suspension de cellules de levure (par exemple, ajouter 37,5 ul de 20 mg / ml de bouillon de cycloheximide à 3 ml de suspension cellulaire), et le vortex brièvement pour mélanger. ATTENTION: cycloheximide est un irritant cutané et est toxique par ingestion orale. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation cycloheximide. En cas d&#39;exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant. </li><li> Immédiatement après l&#39; addition de cycloheximide et tourbillonnement, transférer 950 pi (~ 2,4 unités DO 600) de la suspension de cellules de levure avec du cycloheximide ajouté à un microtube contenant préétiqueté 50 ul 20x mélange d&#39; arrêt glacée. Vortex du tube à centrifuger et placer sur la glace jusqu&#39;à ce que tous les échantillons ont été recueillis. </li><li> Retour à la suspension de cellules de levure à 30 ° C. </li></ol></li><li> Répéter les étapes 2.3.1 à 2.3.3 Pour chacune des autres suspensions de cellules de levure à des intervalles de temps réguliers (par exemple, toutes les 30 secondes, de telle sorte que le cycloheximide est ajouté à l&#39; échantillon n ° 1 à 0:00, l&#39; échantillon n ° 2 à 0:30, l&#39; échantillon n ° 3 à 1:00 etc.). </li><li> A chaque point de temps suivant, des suspensions de cellules de levure de vortex et transfert 950 pi à microtubes étiquetés contenant 50 pi pré-réfrigérés 20x Arrêter Mix. Vortex et de placer les cellules recueillies sur la glace. Retour 15 ml tubes coniques à 30 ° C bloc de chaleur. <ol><li> Par exemple, pour la collecte de cellules 30 minutes après l&#39;addition de cycloheximide (en supposant que 30 s intervalles entre l&#39;addition de cycloheximide à des suspensions de cellules de levure au début du cours du temps), vortexer et retirer 950 pi de suspension cellulaire de l&#39;échantillon n ° 1 à 30:00 . Répétez l&#39;opération pour l&#39;échantillon n ° 2 à 30:30, et ainsi de suite. REMARQUE: Pour empêcher la sédimentation de la levure, des suspensions de cellules de vortex dans 15 ml tubes coniques environ toutes les 5 min pendant toute la durée de la chasse. En variante, la suspension de cellules de levures peut être maintenue dans un bain d&#39;eau en agitant de façon continue pendant toute la durée de l&#39;expérience de chasse à la cycloheximide. </li></ol></li><li> Quand tous les échantillons ont été collectés, culot recueilli les cellules par centrifugation à 6500 x g à température ambiante pendant 30 sec. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration. Les cellules sont maintenant prêts pour la lyse alcaline. Alternativement, snap-gel cellules sédimentées dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. Extraction des protéines post-alcaline (Modifié à partir de 16,40) <ol><li> Ajouter 100 ul d&#39;eau distillée à chaque culot cellulaire. Resuspendre par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement. </li><li> Ajouter 100 ul de NaOH 0,2 M à chaque échantillon. Mélanger par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement. </li><li> Incuber les cellules en suspension à température ambiante pendant 5 min. A ce stade, les cellules de levure n&#39;a pas été lysées et les protéines ont pas été libérés 40. </li><li> cellules à pellets par centrifugation à 18.000 xg à la chambre humeurature pendant 30 sec. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration. </li><li> À lyser les cellules, ajouter 100 ul de tampon d&#39;échantillon de Laemmli à chaque culot cellulaire. Resuspendre par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement. NOTE: incubation séquentielle de cellules avec un tampon d&#39;échantillon libère NaOH et Laemmli protéines sous une forme compatible avec dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide-sulfate (SDS-PAGE) en utilisant un système tampon de course Tris-glycine. </li><li> Incuber à 95 ° C pendant 5 min pour dénaturer complètement les protéines. REMARQUE: L&#39; incubation à 95 ° C ne peut pas être adapté à l&#39; analyse des protéines qui sont sujettes à l&#39; agrégation (par exemple, des protéines ayant plusieurs segments transmembranaires). Ces protéines peuvent devenir insolubles lorsqu&#39;ils sont incubés à des températures élevées 41. Ainsi, pour l&#39;analyse de ces protéines, des lysats doivent être incubées à des températures plus basses (par exemple 37 ° C - 70 ° C) pendant 10 - 30 minutes, comme déterminé de manière empirique. </li><li> lysats Centrifugeuse à 18.000 xg à rotempérature om pour 1 min à pellet matière insoluble. Le surnageant (extrait protéique solubilisé) est prêt pour une séparation par SDS-PAGE et après une analyse Western Blot. Alternativement, lysats conserver à -20 ° C. </li></ol> 4. Représentant SDS-PAGE et de la procédure Western Blot (Adapté de 16) <ol><li> protéine de charge des étalons de poids moléculaire et un volume déterminé de façon empirique de lysats sur un gel SDS-PAGE. REMARQUE: Choisir le pourcentage d&#39;acrylamide et de bis-acrylamide dans le gel SDS-PAGE sur la base du poids moléculaire de la protéine d&#39;intérêt. En général, la baisse des gels de pourcentage sont mieux adaptés à la résolution de protéines de poids moléculaire élevé. </li><li> Gel de fonctionner à 200 V jusqu&#39;à ce que le front de colorant ait atteint le bord inférieur du gel. </li><li> Transfert des protéines du gel au fluorure de polyvinylidène (PVDF) par virement humide à 20 V pour 60-90 min à 4 ° C. </li><li> Bloquer la membrane par incubation dans du Tris-solution saline tamponnée (TBS) contenant 5% de lait écrémé, à bascule, à la température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant la nuit. Remarque: pour empêcher la croissance microbienne en présence d&#39;une membrane incubée pendant une nuit, il est recommandé d&#39;inclure azoture de sodium dans la solution de blocage à une concentration finale de 0,02%. </li><li> Incuber membrane avec un anticorps primaire spécifique pour la protéine d&#39;intérêt dans TBS avec 0,1% de Tween-20 (TBS / T) et 1% de lait écrémé, à bascule, à la température ambiante pendant 1 h. </li><li> Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule. </li><li> Incuber membrane avec un anticorps secondaire approprié fluorophore conjugué dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule. NOTE: Les fluorophores sont sensibles à la lumière. Par conséquent, des dilutions d&#39;anticorps conjugués à des fluorophores doivent être préparées dans l&#39;obscurité, et l&#39; incubation de membranes en présence d&#39;anticorps conjugués à des fluorophores et des étapes de lavage ultérieures devraient se produire dans lightproof (par exemple, une feuille enveloppée) containers. </li><li> Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule. </li><li> membrane d&#39;image en utilisant LI-COR Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l&#39;équipement d&#39;imagerie comparable et logiciel), suivant les recommandations du fabricant. </li><li> Après l&#39;acquisition de l&#39;image de la membrane, incuber la membrane avec un anticorps primaire spécifique pour une protéine de contrôle de chargement dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule. </li><li> Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule. </li><li> Incuber membrane avec un anticorps secondaire approprié fluorophore conjugué dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule. </li><li> Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule. </li><li> Membrane d&#39;image comme à l&#39;étape 4.9. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dans cet article, un procédé d&#39;analyse de la cinétique de dégradation des protéines est présentée. Cette technique peut être appliquée facilement à une large gamme de protéines dégradées par une variété de mécanismes. Il est important de noter que les expériences de chasse de cycloheximide rapport sur la cinétique de dégradation de la piscine de l&#39;état d&#39;équilibre d&#39;une protéine donnée. D&#39;autres techniques peuvent être utilisées pour analyser la cinétique de la dégradation ...

Les protéines remplissent des fonctions cruciales dans pratiquement tous les processus cellulaire. De nombreux processus physiologiques nécessitent la présence d&#39;une protéine spécifique (ou protéines) pendant une période de temps définie ou dans des circonstances particulières. Les organismes surveillent donc et régulent l&#39; abondance de protéines pour répondre aux besoins cellulaires 1. Par exemple, des cyclines (protéines qui contrôlent la division cellulaire) sont présents à des phases spécifiques du cycle cellulaire et la perte des niveaux de cycline réglementés a été associée à la formation de tumeurs malignes 2. En plus de la régulation des niveaux de protéines pour répondre aux besoins cellulaires, les cellules utilisent des mécanismes de contrôle de la qualité de dégradation pour éliminer un repliement des molécules de protéines unassembled, ou autrement aberrantes 3. Le contrôle de l&#39;abondance des protéines implique la régulation à la fois la synthèse macromoléculaire (transcription et traduction) et de la dégradation (de désintégration de l&#39;ARN et la protéolyse). la dégradation des protéines avec facultés affaiblies ou excessive contribue à de multiples pathologies, Y compris le cancer, la fibrose kystique, des maladies neurodégénératives et des troubles cardio - vasculaires 4-8. Mécanismes protéolytiques représentent donc des cibles thérapeutiques prometteuses pour une gamme de maladies 9-12. Analyse des protéines à un seul point du temps (par exemple, par western blot 13, cytométrie en flux 14, ou la microscopie à fluorescence 15) donne un aperçu de la protéine abondance à l&#39;état stable sans révéler la contribution relative de la synthèse ou de dégradation. De même, des dosages de rapporteur à base de croissance reflètent stables les taux de protéines de l&#39; État sur ​​une période de temps prolongée sans discrimination entre les influences de la synthèse et la dégradation 15-20. Il est possible de déduire la contribution des processus de dégradation à des niveaux de protéines de l&#39; état ​​d&#39; équilibre en comparant l&#39; abondance avant et après l&#39; inhibition des composants spécifiques du mécanisme de dégradation (par exemple, en inactivant pharmacologiquement la proteasome 21 ou assommant un gène hypothétique d&#39;être requis pour la dégradation 13). Un changement dans les niveaux de protéines de l&#39; état ​​d&#39; équilibre après l&#39; inhibition des voies de dégradation fournit des preuves solides pour la contribution de la protéolyse au contrôle de la protéine abondance 13. Cependant, une telle analyse ne fournit toujours pas d&#39;informations sur la cinétique de renouvellement des protéines. Chase cycloheximide suivie par western blot surmonte ces faiblesses en permettant aux chercheurs de visualiser la dégradation des protéines dans le temps 22-24. En outre, parce que la détection de la protéine suivante chase cycloheximide est généralement effectuée par Western blot, les isotopes radioactifs et les étapes d&#39;immunoprécipitation longues ne sont pas nécessaires pour la chasse de cycloheximide, contrairement à de nombreuses techniques de chasse d&#39;impulsions couramment utilisés, qui sont également effectuées pour visualiser la dégradation des protéines 25. Cycloheximide a d&#39;abord été identifié comme étant un composé anti-fongique appropriéeliens produits par les Streptomyces bactérie à Gram positif griseus 26,27. Elle est une molécule cellulaire perméable qui inhibe spécifiquement cytosoliques eucaryotes (mais pas des organites) en altérant la traduction ribosomique translocation 28-31. Dans une expérience de chasse à la cycloheximide, le cycloheximide est ajouté aux cellules, et des aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement et à des moments spécifiques après l&#39; addition du composé 22. Les cellules sont lysées, et l&#39;abondance de protéines à chaque point de temps est analysé, typiquement par western blot. Des diminutions de l&#39;abondance des protéines après l&#39;addition de cycloheximide peuvent être en toute confiance attribuée à la dégradation des protéines. Une protéine instable va diminuer en abondance au fil du temps, tandis que d&#39;une protéine relativement stable présentera peu de changements dans l&#39;abondance. Mécanismes de dégradation sélective des protéines ont été hautement conservée tout au long de Eukarya. Une grande partie de ce qui est connu à propos de la dégradation des protéines a été appris en premierle modèle eucaryote unicellulaire, Saccharomyces cerevisiae (levure de bourgeonnement) 25,32-36. Des études avec des levures sont susceptibles de continuer à fournir des idées nouvelles et importantes dans la dégradation des protéines. Une méthode pour la chasse de cycloheximide dans les cellules de levure suivie d&#39;une analyse western blot de protéines abondance est présentée ici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="607">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-961-32</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td style="width:105px;">Dot Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028068</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-0450</td>
			<td style="width:167px;">A tube roller is recommended to maintain overnight&#160; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Centrifuge 5430</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td style="width:105px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.205</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22364120</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">Analog Dri-Bath Heaters</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1172011AQ</td>
			<td style="width:167px;">It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &#176;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Heating block for 12 x 15-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-473-70</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-9Q</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td style="width:105px;">Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IPFL00010</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">459250</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Règlement de la protéine abondance est cruciale pour pratiquement tous les processus cellulaire. Abondance des protéines reflète l&#39;intégration des taux de synthèse des protéines et la dégradation des protéines. De nombreux essais de rapports sur la protéine abondance (par exemple, un seul point de temps western blot, cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, ou des dosages de rapporteur basées sur la croissance) ne permettent pas la discrimination des effets relatifs de la traduction et de la protéolyse sur les niveaux de protéines. Cet article décrit l&#39;utilisation de chasse cycloheximide suivie par western blot pour analyser spécifiquement la dégradation des protéines dans le eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe). Dans cette procédure, les cellules de levure sont incubées en présence du cycloheximide inhibiteur de la traduction. Des portions aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement après et à des moments spécifiques après l&#39;addition de cycloheximide. Les cellules sont lysées, et les lysats sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide for analyse par transfert Western de protéines abondance à chaque point de temps. La procédure de poursuite de cycloheximide permet la visualisation de la cinétique de dégradation de la population de l&#39;état d&#39;équilibre d&#39;une variété de protéines cellulaires. La procédure peut être utilisée pour étudier les exigences génétiques pour et les influences environnementales sur la dégradation des protéines.

Pour illustrer la méthodologie de poursuite de cycloheximide, la stabilité de deg1 -Sec62 (Figure 1), un modèle de levure réticulum endoplasmique (RE) dégradation -Associated (ERAD) substrat, a été analysé 42-44. Dans DGAER, des enzymes ubiquitine ligase de contrôle de qualité fixer de manière covalente des chaînes de la petite protéine ubiquitine à des protéines aberrantes localisées sur la membrane du RE. De telles protéines polyubi...

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Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

L&#39;analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.8K vues.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Croissance dosage à base de Reporter-une analyse systématique de la dégradation des protéines

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.