Name: cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

酵母細胞の1成長と収穫<ol><li>内在性酵母タンパク質の分解速度を分析していない場合は、目的のタンパク質をコードするプラスミドを用いて、所望の酵母菌株（単数または複数）を変換します。酵母の形質転換のための信頼できる方法は、先37に記載されています。 </li><li>適切な培地5mlに酵母を接種する（ 例えば、形質転換細胞または非形質転換細胞のための非選択的な酵母エキス-ペプトン-デキストロース（YPD）培地のプラスミド維持のための選択的な合成に定義（SD）培地）。回転、30℃で一晩インキュベートします。 注：30℃、典型的な野生型実験室酵母株38のための最適な成長温度です。しかし、にいくつかの変異体酵母株は30℃で最適に増殖しないので、いくつかのタンパク質は、温度依存性の分解を受ける、酵母細胞の増殖およびシクロヘキシミドチェイスに使用される温度は、経験的に39を決定すべきです。 </li><li>目を測定します各一晩培養物の600nmで（OD 600）での電子光学密度。 注：細胞は、対数または定常増殖期にあってもよいが、最低限の新鮮な培地15mlにOD 600 = 0.2に希釈を可能にする密度に達している必要があります。 </li><li>新鮮な培地の0.2〜15でミリリットルのOD 600値に一晩培養を希釈します。 </li><li>細胞が中期対数増殖期（ すなわち 、0.8と1.2の間のOD 600）に達するまで振とう、30℃で酵母を培養します。 </li><li>酵母細胞成長の間、シクロヘキシミドチェイス手順の準備のために次の手順を実行します。 <ol><li>シクロヘキシミドの存在下での細胞のインキュベーションを30℃に15ミリリットルを円錐管を収容することができヒートブロックを設定します。文化への効率的な熱分布を可能にするために、ヒートブロックのウェルに水を追加します。 15ミリリットルコニカルチューブは、水位がオーバーフローに上昇するが、しないように十分の唇を引き起こすであろうことを、各ウェルなどに水を追加します。。 </li><li>細胞溶解後のタンパク質の変性、95℃、1.5 mlマイクロチューブを収容可能な第2ヒートブロックを設定します。 </li><li>プリ暖かい新鮮な増殖培地（培養あたりの時点当たり1.1ミリリットルをアッセイする）30℃です。 </li><li> 50μlの20倍ストップ・ミックスを追加するために予め標識マイクロ遠心チューブ（分析対象の培養当たりの時間点につき1チューブ）。氷の上にチューブを入れます。 注意：アジ化ナトリウム、20倍ストップミックス中の成分は、経口摂取または皮膚接触を介して、有毒です。 、準備、保存、およびアジ化ナトリウムを取り扱う際、メーカーの推奨事項に従ってください。偶発的曝露の場合には、メーカーが提供する製品安全データシートを参照してください。 </li></ol></li><li>細胞が中期対数増殖に達したときに、（3つの時点でのタンパク質発現量を解析するために、例えば 、7.5 OD 600単位）アッセイされるべき時点ごとに各培養物の2.5 OD 600単位を収集します。遠心分離機は3,0で15ミリリットルコニカルチューブに細胞を収集しました2分間、室温で00 XG。 注：One OD 600単位はOD 1.0の600で1ミリリットルの培養物中に存在する酵母の量に等しいです。 V = X OD 600単位/ OD 600の測定：X OD 600単位（V）を回収するのに必要な培養液（ml単位）の量は、以下の式を用いて決定することができます。例えば、OD 1.0の600で酵母細胞培養の7.5 OD 600単位を収穫7.5 OD 600単位/ 1.0 = 7.5ミリリットル酵母培養物を収集します。 </li><li> 30の1ミリリットル°C（予め温めておいた）細胞の2.5 OD 600ユニット（ 例えば 、7.5 OD 600ユニットの3ミリリットル）あたりの新鮮な増殖培地中で再懸濁し、各細胞ペレット。 </li></ol> 2.シクロヘキシミドチェイス<ol><li> 30℃のヒートブロックで5分間インキュベートすることによって、酵母細胞懸濁液を平衡化します。 </li><li>午後12時からカウントアップするタイマーを準備します。 </li><li>シクロヘキシミドチェイスを開始するには、Enterキーを押して、タイマーに「スタート」。素早く、しかし、慎重に、次の手順を実行します。 <ol><li>最初の酵母細胞懸濁液に250μgの/ mlの最終濃度になるようにシクロヘキシミドを追加します（ 例えば、細胞懸濁液の3ミリリットルに20ミリグラム/ mlのシクロヘキシミド株式の37.5μlを添加）、および渦が簡単にミックスします。 注意：シクロヘキシミドは、皮膚刺激性であり、経口摂取を介して、有毒です。 、準備、保存、およびシクロヘキシミドを取り扱う際、メーカーの推奨事項に従ってください。偶発的曝露の場合には、メーカーが提供する製品安全データシートを参照してください。 </li><li>すぐにシクロヘキシミドとボルテックスを追加した後、50μlの氷冷20倍ストップミックスを含む前標識されたマイクロ遠心チューブに加え、シクロヘキシミドで酵母細胞懸濁液の950μlの（〜2.4 OD 600ユニット）を転送します。全てのサンプルが収集されるまで氷上にマイクロ遠心管、および場所をボルテックス。 </li><li> 30℃に酵母細胞懸濁液を返します。 </li></ol></li><li>手順を繰り返し2.3を通じて2.3.1午前一時で一定時間間隔（ 例えば、シクロヘキシミドは0時30分で、午後12時で、サンプル＃2を＃1をサンプルに添加されるように30秒ごとに、サンプル＃3で、残りの酵母細胞懸濁液のそれぞれについて0.3 等 。）。 </li><li>その後の各時点で、渦酵母細胞懸濁液と50μlの予冷した20倍ストップ・ミックスを含む標識マイクロ遠心チューブに950μlのを転送します。氷上で回収した細胞をボルテックスし、配置します。 30℃のヒートブロックに15ミリリットルを円錐管を返します。 <ol><li>例えば、30分シクロヘキシミドの添加後の細胞の収集のために、渦（タイムコースの開始時に、酵母細胞懸濁液にシクロヘキシミド添加の間に30秒の間隔を仮定）と30:00でサンプル＃1からの細胞懸濁液950μLを除去します。ように30:30でサンプル＃2のために繰り返し、。 注：チェイスの過程を通じて約15ミリリットルで、5分ごとにコニカルチューブをボルテックス細胞懸濁液を酵母の沈降を防止するために。あるいは、酵母細胞懸濁液Sはシクロヘキシミドチェイス実験の期間中、連続的に撹拌水浴中で維持することができます。 </li></ol></li><li>全てのサンプルが収集されたら、ペレットを30秒間、室温にて6,500×gでの遠心分離によって細胞を収集しました。ピペッティングまたは吸引により上清を取り除きます。細胞は、今、アルカリ溶解のための準備が整いました。また、スナップ凍結液体窒素とストア内のペレット化した細胞を-80℃で。 </li></ol> 3.ポストアルカリ性タンパク質抽出（16,40から変更されました） <ol><li>各細胞ペレットに100μlの蒸留水を加えます。ピペッティングまたはボルテックスによって再懸濁します。 </li><li>各試料に0.2 M NaOHを100μLを加えます。ピペッティングまたはボルテックスにより混和します。 </li><li>インキュベートは、室温で5分間、細胞を懸濁しました。この段階において、酵母細胞は溶解されていない、およびタンパク質40をリリースしていません。 </li><li>部屋の気性で18,000×gで遠心分離により細胞をペレット化30秒間ature。ピペッティングまたは吸引により上清を取り除きます。 </li><li>細胞を溶解し、各細胞ペレットにレムリ試料緩衝液100μlを加えます。ピペッティングまたはボルテックスによって再懸濁します。 注：トリス - グリシンランニング緩衝系を使用して、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）と互換性のある形でのNaOHとのLaemmli試料バッファを解放タンパク質と細胞の連続インキュベーション。 </li><li>完全タンパク質を変性するために95℃で5分間インキュベートします。 注：95℃でのインキュベーションは、凝集しやすいタンパク質の分析には適していない（ 例えば 、いくつかの膜貫通セグメントを有するタンパク質）。高温41でインキュベートした場合、これらのタンパク質は不溶性になることがあります。経験的に決定されたとして30分、 - 10 -したがって、そのようなタンパク質の分析のために、溶解物は、より低い温度（70℃、例えば 37℃）でインキュベートする必要があります。 </li><li> ROで18,000×gで遠心分離した溶解物不溶性物質をペレット化するために1分間オム温度。上清（可溶化抽出したタンパク質）をSDS-PAGEおよびその後のウエスタンブロット分析による分離のために準備ができています。また、-20℃で保存溶解物。 </li></ol> 4.代表的SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング手順（16から適応） <ol><li>負荷タンパク質分子量標準およびSDS-PAGEゲル上に溶解物の経験的に決定されたボリューム。 注：目的のタンパク質の分子量に基づいて、SDS-PAGEゲル中のアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの割合を選択します。一般的に、低いパーセンテージのゲルは、より高い分子量のタンパク質を解決するために適しています。 </li><li>色素の先端がゲルの下端に達するまで、200 Vでゲルを実行します。 </li><li> 4℃で90分 - ポリフッ化ビニリデン（PVDF）60 20 Vで湿潤転写によって膜にゲルから転送タンパク質。 </li><li> （TBトリス緩衝生理食塩水でインキュベートすることにより、膜をブロックS）、5％スキムミルクを含む1時間または4℃で一晩、室温で、ロッキング。 注：一晩インキュベートした膜の存在下で微生物の増殖を防ぐためには、0.02％の最終濃度でブロッキング溶液にアジ化ナトリウムを含むことが推奨されます。 </li><li>室温で1時間、揺動、0.1％のTween-20（TBS / T）及び1％のスキムミルクを含むTBS中で目的のタンパク質に特異的な一次抗体と共に膜をインキュベートします。 </li><li>ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。 </li><li>ロッキング、室温で1時間1％スキムミルクを含むTBS / Tで適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートします。 注：フルオロフォアは、光に敏感です。したがって、フルオロフォアに結合した抗体の希釈液は、暗闇の中で準備する必要があり、かつ蛍光団およびその後の洗浄工程に結合した抗体の存在下での膜のインキュベーションは、（ 例えば、アルミホイルにくるまれた）遮光に起こるべき共同ntainers。 </li><li>ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。 </li><li>画像膜メーカーの推奨に従って、LI-CORのオデッセイCLX及び画像Studioソフトウェア（または同等のイメージング機器やソフトウェア）を使用。 </li><li>膜の画像を取得した後、ロッキング、1時間室温で1％スキムミルクを含むTBS / Tでローディングコントロールタンパク質に特異的な一次抗体で膜をインキュベートします。 </li><li>ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。 </li><li>ロッキング、室温で1時間1％スキムミルクを含むTBS / Tで適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートします。 </li><li>ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。 </li><li>ステップ4.9のように、画像の膜。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この論文では、タンパク質分解の動態を分析するための方法が提供されます。この技術は、容易に様々なメカニズムにより分解タンパク質の範囲に適用することができます。シクロヘキシミドチェイス実験は、所定のタンパク質の定常状態プールの分解速度について報告することに留意することが重要です。他の技術は、タンパク質の特定の集団の分解速度を分析するために使用されてもよ?...

タンパク質は、事実上すべての細胞プロセスにおいて重要な機能を実行します。多くの生理学的プロセスは時間のまたは特定の状況下で定義された期間に特定のタンパク質（またはタンパク質）の存在を必要とします。生物は、したがって、監視および携帯ニーズ1を満たすために、タンパク質存在量を調節します。例えば、サイクリン（細胞分裂を調節するタンパク質）は、細胞周期の特定の相に存在し、規制サイクリンレベルの損失は、悪性腫瘍の形成2に関連しています。細胞のニーズを満たすためにタンパク質レベルを調節することに加えて、細胞は、誤って折り畳まれ、組み立てられていない、またはそうでなければ異常なタンパク質分子3を除去するために分解品質管理機構を採用します。タンパク質存在量の制御は、巨大分子の合成（転写および翻訳）および分解（RNAの崩壊とタンパク質分解）の両方の調節を伴います。障害または過剰なタンパク質分解は、複数の病理に貢献します、癌、嚢胞性線維症、神経変性疾患、および心血管障害4-8を含みます。タンパク質分解のメカニズムは、したがって、病気9-12の範囲のための有望な治療標的を表します。 単一時点でのタンパク質の分析は、（ 例えば 、ウェスタンブロットで13、フローサイトメトリー14、または蛍光顕微鏡15）の合成や分解の相対的な寄与を明らかにすることなく定常状態のタンパク質存在量のスナップショットを提供します。同様に、増殖に基づくレポーターアッセイは、合成および分解15~20の影響を区別することなく、長期間にわたる定常状態タンパク質レベルを反映します。前の存在量を比較することにより、薬理学的proteを不活性化することによって、例えば、分解機構（の特定の成分を阻害した後の定常状態タンパク質レベルの分解過程の寄与を推定することが可能ですasome 21または分解13に必要とされることが仮定遺伝子）をノックアウト。分解経路を阻害した後の定常状態のタンパク質レベルの変化は、タンパク質発現量13の制御にタンパク質分解の寄与のための強力な証拠を提供します。しかし、このような分析は、依然としてタンパク質代謝回転の動態に関する情報を提供していません。ウェスタンブロッティングに続いてシクロヘキシミドチェイスは、研究者は、時間22-24かけてタンパク質分解を視覚化することを可能にすることによって、これらの弱点を克服します。シクロヘキシミドチェイス以下のタンパク質の検出は、通常、ウエスタンブロット法、放射性同位体と長い免疫沈降ステップによって行われるためさらに、また、タンパク質分解25を可視化するために行われている多くの一般的に使用されるパルスチェイス技術とは異なり、シクロヘキシミドチェイスのために必要とされていません。 シクロヘキシミドは、最初の抗真菌適切有する化合物として同定されました26,27 グリセウスグラム陽性菌ストレプトミセスによって生成ネクタイ。これは、具体的には、リボソームの転位28-31を損なうことにより、真核生物の細胞質ゾル（しかしオルガネラない）翻訳を阻害する細胞透過性分子です。シクロヘキシミドチェイス実験において、シクロヘキシミドを細胞に添加し、細胞のアリコートを、化合物22の添加後すぐに、特定の時点で収集されます。細胞を溶解し、そして各時点でのタンパク質の存在量は、典型的には、ウェスタンブロットによって分析します。シクロヘキシミドの添加後のタンパク質存在量の減少は、自信を持って、タンパク質の分解に起因することができます。比較的安定したタンパク質が豊富でほとんど変化を示すであろうしながら、不安定なタンパク質は、時間をかけて豊富に減少します。 選択的なタンパク質分解のメカニズムは非常に真核生物を通じて保存されています。タンパク質分解について知られていることの多くは、最初に学習されましたモデル単細胞真核生物、 サッカロマイセス・セレビシエ （出芽酵母）25,32-36。酵母を用いた研究は、タンパク質分解に新規で重要な洞察を提供し続ける可能性が高いです。タンパク質量のウェスタンブロット分析を行った酵母細胞におけるシクロヘキシミド追跡するための方法がここに提示されています。

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>A tube roller is recommended to maintain overnight&amp;nbsp; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&amp;nbsp;</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heaters</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &amp;deg;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td></tr><tr><td>Heating block for 12 x 15 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td></tr><tr><td>Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

タンパク質存在量の調節は、事実上すべての細胞プロセスに不可欠です。タンパク質の存在量は、タンパク質合成およびタンパク質分解の速度の統合を反映しています。多くのタンパク質存在量に関するレポートアッセイ（ 例えば 、単一の時点ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、または増殖に基づくレポーターアッセイ）は、タンパク質レベルでの翻訳とタンパク質分解の相対的効果の差別を許しません。この記事では、具体的には、モデル単細胞真核生物、 サッカロマイセス・セレビシエ （出芽酵母）にタンパク質分解を分析するためのウェスタンブロッティングに続いてシクロヘキシミドチェイスの使用を記載しています。この手順では、酵母細胞は、翻訳阻害剤シクロヘキシミドの存在下でインキュベートされます。細胞のアリコートを後シクロヘキシミドの添加後の特定の時点ですぐに収集されます。細胞を溶解し、そして溶解物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されるFO各時点でのタンパク質量のウェスタンブロット分析をrは。シクロヘキシミドチェイス手順は、種々の細胞タンパク質の定常状態の人口の分解動態の可視化を可能にします。手順は、タンパク質分解のための遺伝的要件および環境の影響を調査するために使用することができます。

シクロヘキシミド追跡方法を説明するために、Deg1 -Sec62の安定性（ 図1）、モデル酵母の小胞体（ER）関連分解（ERAD）基板は、42〜44を分析しました。 ERADでは、品質管理ユビキチンリガーゼ酵素は共有結合ER膜に局在異常なタンパク質に小さなタンパク質のユビキチン鎖を取り付けます。このようなポリユビキチン化タンパク質は、その後、...

Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

タンパク質分解中のシクロヘキシミドチェイス分析<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.8K ビュー.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

ビデオ: Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

発生生物学

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

特定および効率的なタンパク質枯渇を達成するための分解性の調整

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

免疫・感染学

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

生物学

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

Saccharomyces cerevisiae Yeast as a Model Organism

出芽酵母入門

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

Education

JoVE Science Education

基礎生物学

生物学Ⅰ：酵母、ショウジョウバエ、線虫

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

ミスフォールディング傾向タンパク質分解アッセイ:シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質分解のモニタリング技術

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

タンパク質分解中のシクロヘキシミドチェイス分析

要約

さらに動画を探す

この動画の章

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

特定および効率的なタンパク質枯渇を達成するための分解性の調整

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

mRNAの崩壊料金の測定で

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

出芽酵母入門

ミスフォールディング傾向タンパク質分解アッセイ:シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質分解のモニタリング技術

タンパク質分解中のシクロヘキシミドチェイス分析

要約

さらに動画を探す

この動画の章

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

特定および効率的なタンパク質枯渇を達成するための分解性の調整

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

mRNAの崩壊料金の測定で

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

出芽酵母入門

ミスフォールディング傾向タンパク質分解アッセイ:シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質分解のモニタリング技術

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で