The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

1. Wachstum und Ernte von Hefezellen <ol><li> Wenn nicht Abbaukinetik eines endogenen Hefe-Proteins zu analysieren, umwandeln gewünschten Hefestamm (s) mit einem Plasmid, das das interessierende Protein kodiert. Zuverlässige Methoden für die Transformation von Hefe wurden 37 zuvor beschrieben wurde . </li><li> Beimpfen von Hefe in 5 ml geeigneten Medium (beispielsweise eine selektive synthetische definiert (SD) Medium für Plasmiderhaltung von transformierten Zellen oder nicht-selektiven Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Medium für nicht-transformierte Zellen). über Nacht bei 30 ° C inkubieren, drehen. HINWEIS: 30 ° C ist die optimale Wachstumstemperatur für typische Wildtyp - Labor Hefestämme 38. Da jedoch einige mutanten Hefestämmen nicht wachsen optimal bei 30 ° C und einige Proteine ​​unterzogen werden temperaturabhängige Abbau die Temperaturen empirisch 39 bestimmt werden für Hefe Zellwachstum und Cycloheximid chase verwendet sollte. </li><li> Messen Sie the optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) jeder Übernachtkultur. HINWEIS: Die Zellen können in logarithmischen oder stationären Wachstumsphase sein , aber minimal eine Dichte erreicht haben , sollte die Verdünnung bis zu einer OD 600 ermöglichen = 0,2 in 15 ml frisches Medium. </li><li> Verdünne die Nacht - Kulturen auf eine OD 600 - Wert von 0,2 in 15 ml frisches Medium. </li><li> Inkubieren Hefe bei 30 ° C, Schütteln , bis die Zellen mittleren logarithmischen Wachstumsphase (dh eine OD 600 zwischen 0,8 und 1,2) erreichen. </li><li> Während des Zellwachstums Hefe, führen Sie die folgenden in Vorbereitung auf die Cycloheximid chase Verfahren: <ol><li> Stellen Sie einen Wärmeblock, der 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C für die Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid aufnehmen kann. Zugabe von Wasser zu den Vertiefungen der Heizblock eine effiziente Wärmeverteilung zu den Kulturen zu ermöglichen. Fügen Sie Wasser zu jeder Vertiefung, so dass eine 15 ml konischen Röhrchen wird der Wasserspiegel führen zu steigen, aber nicht überlaufen, um die Lippe des Brunnens. </li><li> Legen Sie einen zweiten Wärmeblock, der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf 95 ° C für Eiweißdenaturierung folgende Zell-Lyse aufnehmen kann. </li><li> Pre-warmes frisches Wachstumsmedium (1,1 ml pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden) bis 30 ° C. </li><li> In 50 ul 20x Stop-Mix zu vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen (ein Röhrchen pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden). Die Röhrchen auf Eis. VORSICHT: Natriumazid, ein Bestandteil in 20x Stop-Mix, ist giftig über die orale Einnahme oder Hautkontakt. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Umgang mit Natriumazid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt. </li></ol></li><li> Wenn die Zellen mittleren logarithmischen Wachstum erreicht haben, sammeln 2,5 OD 600 Einheiten jeder Kultur pro Zeitpunkt zu untersuch (zB 7,5 OD 600 Einheiten Proteinmenge zu drei Zeitpunkten zu analysieren). Zentrifuge gesammelten Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 3,000 × g bei Raumtemperatur für 2 min. HINWEIS: Eine OD600 - Einheit entspricht der Menge Hefe , die in 1 ml Kultur bei einer OD 600 von 1,0. V = X OD 600 Einheiten / Mess OD 600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich X OD 600 Einheiten (V) zu ernten kann durch Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt werden. Beispielsweise zur Ernte 7,5 OD 600 Einheiten von Hefe - Zellkultur bei einer OD 600 von 1,0, sammeln 7,5 OD 600 Einheiten / 1,0 = 7,5 ml Hefekultur. </li><li> Resuspendieren jedes Zellpellet in 1 ml 30 ° C (vorgewärmte) frisches Wachstumsmedium pro 2,5 OD 600 Einheiten von Zellen (beispielsweise 3 ml 7,5 OD 600 - Einheiten). </li></ol> 2. Cycloheximide Chase <ol><li> Hefe-Zellsuspensionen durch Inkubation für 5 min bei 30 ° C Heizblock äquilibrieren. </li><li> Bereiten Sie einen Timer von 0:00 aufwärts zu zählen. </li><li> Um die Cycloheximid Jagd, drücken Sie &quot;Start&quot; auf dem Timer beginnen. Schnell,aber sorgfältig, führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Hinzufügen Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 250 ug / ml zur ersten Hefezelle Suspension (beispielsweise hinzu 37,5 ul 20 mg / ml Cycloheximid Lager zu 3 ml der Zellsuspension) und vortex kurz zu mischen. ACHTUNG: Cycloheximid ist ein reizend Haut und ist toxisch bei der oralen Einnahme. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Handhabung Cycloheximid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt. </li><li> Unmittelbar nach Cycloheximid und Verwirbelung Zugabe, Transfer 950 ul (~ 2,4 OD 600 Einheiten) der Hefe - Zellsuspension mit zusätzlichem Cycloheximid zu einem vorher markierten Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul eiskaltes 20x Stop Mix. Vortex, um die Mikrozentrifugenröhrchen, und auf Eis, bis alle Proben gesammelt worden sind. </li><li> Liefert die Hefe-Zellsuspension auf 30 ° C. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis 2.30,3 für jede der verbleibenden Hefezelle Suspensionen in regelmäßigen Zeitintervallen (beispielsweise alle 30 sec, so daß Cycloheximid hinzugefügt # 1 um 0:00, Probe # 2 bei 0.30, Probe # 3 um 1:00 bis Probe usw.). </li><li> Bei jedem nachfolgenden Zeitpunkt, Wirbel Hefezelle Suspensionen und Transfer 950 ul an markierte Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul vorgekühlten 20x Stopp Mix enthält. Vortex und Ort gesammelten Zellen auf Eis. Rück 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C Heizblock. <ol><li> Beispielsweise für die Sammlung von Zellen 30 min nach Zugabe Cycloheximid (unter der Annahme von 30-sec Intervallen zwischen Cycloheximid neben Hefe-Zellsuspensionen zu Beginn des Zeitverlaufs), Vortexen und entfernen 950 &amp; mgr; l der Zellsuspension aus Probe # 1 bei 30:00 . Wiederholen für Probe # 2 bei 30:30, und so weiter. ANMERKUNG: Um zu verhindern, von Hefe Absetzen vortex Zellsuspensionen in 15 ml konische Röhrchen etwa alle 5 min im Verlauf des chase. Alternativ Hefe Zellsuspensions kann in einem kontinuierlich Rühren Wasserbad für die Dauer des Experiments Cycloheximid chase aufrechterhalten werden. </li></ol></li><li> Wenn alle Proben gesammelt worden sind, gesammelt Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 × g bei Raumtemperatur für 30 sec. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen. Die Zellen sind nun bereit für die alkalische Lyse. Alternativ Snap-freeze-Zellen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C pelletiert. </li></ol> 3. Post-alkalische Proteinextraktion (Modified aus 16,40) <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l destilliertes Wasser zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. </li><li> Zugabe von 100 ul 0,2 M NaOH zu jeder Probe. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. </li><li> Inkubieren suspendierten Zellen bei Raumtemperatur für 5 min. In diesem Stadium haben Hefezellen nicht lysiert, und die Proteine ​​wurden nicht 40 freigegeben. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 × g bei Raum Temperamenttur für 30 Sekunden. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. </li><li> Um lysieren Zellen, 100 &amp; mgr; l Laemmli-Probenpuffer zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. HINWEIS: Sequential Inkubation von Zellen mit NaOH und Laemmli-Probenpuffer Freisetzungen Proteine ​​in einer Form kompatibel mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem verwendet wird. </li><li> bei 95 ° C inkubieren 5 min voll Proteine ​​zu denaturieren. HINWEIS: Die Inkubation bei 95 ° C kann nicht für die Analyse von Proteinen geeignet sein , die zur Aggregation neigen (beispielsweise Proteine ​​mit mehreren transmembrane segments). Diese Proteine ​​können unlöslich werden , wenn sie bei erhöhten Temperaturen 41 inkubiert. So kann für die Analyse derartiger Proteine ​​sollten Lysate bei niedrigeren Temperaturen (zB 37 ° C - 70 ° C) inkubiert, für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt. </li><li> Centrifuge Lysate bei 18.000 × g bei room Temperatur 1 min unlösliche Material zu pelletieren. Der Überstand (solubilisiert extrahierte Protein) bereit ist für die Trennung durch SDS-PAGE und anschließendem Western-Blot-Analyse. Alternativ speichern Lysate bei -20 ° C. </li></ol> 4. Repräsentative SDS-PAGE und Western Blot - Verfahren (Angepasst von 16) <ol><li> Lastproteinmolekulargewichtsstandards und empirisch ermittelten Volumen der Lysate auf einem SDS-PAGE-Gel. HINWEIS: Wählen Sie den Prozentsatz von Acrylamid und Bisacrylamid im Gel SDS-PAGE, bezogen auf das Molekulargewicht des Proteins von Interesse. In der Regel niedriger sind Prozentsatz Gele besser geeignet für höhermolekulare Proteine ​​zu lösen. </li><li> Führen Gel bei 200 V, bis die Farbstofffront hat den unteren Rand des Gels erreichte. </li><li> Transferproteine ​​aus dem Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C. </li><li> Block Membran durch Inkubation in Tris-gepufferter Saline (TBS), enthaltend 5% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht. ANMERKUNG: Um das mikrobielle Wachstum in Gegenwart einer Membran über Nacht inkubiert verhindern, wird empfohlen, Natriumazid in der Blockierungslösung bei einer Endkonzentration von 0,02% enthalten. </li><li> Inkubieren Membran mit primärem Antikörper, der spezifisch für Protein von Interesse in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) und 1% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln. HINWEIS: Fluorophore sind lichtempfindlich. Deshalb, um Fluorophoren konjugiert Verdünnungen von Antikörpern sollte im Dunkeln hergestellt werden, und die Inkubation der Membranen in der Gegenwart von Antikörpern gegen Fluorophore und nachfolgende Waschschritte in konjugiert lichtundurchlässigen (beispielsweise folienumwickelte) co auftretenntainers. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Bild Membran mit LI-COR Odyssey CLx und Bild-Studio-Software (oder einem vergleichbaren Bildgeräte und Software), nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Membran Bild Nach dem Erwerb, Inkubation der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für eine Ladekontrollprotein in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, schaukeln. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Bild Membran, wie in Schritt 4.9. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In diesem Dokument wird ein Verfahren Protein Abbaukinetik zur Analyse dargestellt. Diese Technik kann leicht zu einer Reihe von Proteinen, die durch eine Vielzahl von Mechanismen abgebaut angewendet werden. Es ist wichtig zu beachten, daß Cycloheximid chase-Experimente berichten über Abbaukinetik des steady state Pool eines bestimmten Proteins. Andere Techniken können die Abbaukinetik von spezifischen Populationen von Proteinen zu analysieren. Zum Beispiel kann die degradative Schicksal von naszierenden Polypeptiden...

Proteine ​​erfüllen wichtige Funktionen in praktisch jeder zelluläre Prozess. Viele physiologische Prozesse erfordern die Anwesenheit eines spezifischen Proteins (oder Proteine) für einen definierten Zeitraum oder unter bestimmten Umständen. Organismen deshalb überwachen und Proteinmenge regulieren die zelluläre Bedürfnisse 1 erfüllen. Zum Beispiel Cycline (Proteine, die Zellteilung kontrollieren) vorhanden sind , in bestimmten Phasen des Zellzyklus und der Verlust der geregelten cyclin Ebenen hat mit malignen Tumorbildung 2 verbunden. Zusätzlich Proteinspiegel zu regulieren zelluläre Bedürfnisse zu erfüllen, verwenden Zellen zersetzenden Qualitätskontrollmechanismen misfolded, unmontiert oder auf andere Weise anomale Proteinmoleküle 3 zu beseitigen. Kontrolle der Proteinmenge beinhaltet Regulierung sowohl makromolekularen Synthese (Transkription und Translation) und Abbau (RNA Zerfall und Proteolyse). Beeinträchtigte oder übermäßige trägt Proteinabbau zu mehreren PathologienEinschließlich Krebs, Mukoviszidose, neurodegenerativen Erkrankungen und Herz - Kreislauf - Erkrankungen 4-8. Proteolytischen Mechanismen stellen somit vielversprechende therapeutische Ziele für eine Reihe von Krankheiten 12.09. Analyse von Proteinen in einem einzigen Zeitpunkt (zB durch Western - Blot - 13, Durchflusszytometrie 14 oder Fluoreszenzmikroskopie 15) stellt eine Momentaufnahme der steady state Proteinmenge , ohne dass die relativen Beiträge der Synthese oder Abbau offenbaren. Ähnlich wachstums basierten Reporterassays reflektieren steady state - Proteinspiegel über einen längeren Zeitraum ohne 15-20 zwischen den Einflüssen der Synthese und Abbau zu unterscheiden. Es ist möglich , den Beitrag der degradative Prozesse steady state - Proteinspiegel durch Überfluß Vergleich zu schließen , vor und nach der spezifischen Komponenten des Mechanismus degradative Hemmen (beispielsweise durch die pharmakologisch Prote inaktivierendeasome 21 oder ein Gen vermutet , Ausschlagen zu 13 Abbau erforderlich). Eine Änderung in steady state - Proteinspiegel nach Abbauwege sorgt für den Beitrag der Proteolyse zur Kontrolle der Proteinmenge 13 starke Beweise hemmen. Allerdings ist eine solche noch eine Analyse keine Informationen über die Kinetik des Proteinumsatzes bereitstellen. Durch Western - Blot gefolgt Cycloheximide Chase überwindet diese Schwächen , indem Forscher Proteinabbau im Laufe der Zeit von 22 bis 24 sichtbar zu machen. Ferner wird in der Regel durch Western - Blot, radioaktive Isotope und langwierige Immunpräzipitation Schritte sind nicht erforderlich , für Cycloheximid Jagd, im Gegensatz zu vielen häufig verwendeten Puls chase Techniken, die auch durchgeführt werden , zu visualisieren Proteinabbau 25 durchgeführt , da Proteindetektion folgende Cycloheximid Jagd. Cycloheximide wurde zuerst als eine Verbindung mit Anti-Pilz richtige identifiziertBindungen von den grampositiven Bakterium Streptomyces griseus 26,27 erzeugt. Es ist eine zellpermeable Molekül , das spezifisch eukaryotische cytosolischen hemmt (aber nicht organellären) Übersetzung von der ribosomalen Translokation 28-31 beeinträchtigen. In einem Cycloheximid chase Experiment wird Cycloheximid zu Zellen zugesetzt, und Aliquote der Zellen werden sofort und zu bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe der Verbindung 22 gesammelt. Die Zellen werden lysiert und Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt, typischerweise durch Western-Blot analysiert. Vermindert in Proteinmenge nach der Zugabe von Cycloheximid kann getrost auf den Proteinabbau zurückzuführen. Ein instabiles Protein wird in Hülle und Fülle im Laufe der Zeit ab, während ein relativ stabiles Protein wenig Veränderung in Hülle und Fülle aufweisen wird. Mechanismen der selektiven Proteinabbau wurden in ganz Eukarya hoch konserviert. Vieles von dem, was über den Proteinabbau bekannt ist, wurde zum ersten Mal gelernt, indas Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) 25,32-36. Studien mit Hefe sind wahrscheinlich neue und wichtige Einblicke in Proteinabbau fortzusetzen bereitstellt. Verfahren zur Cycloheximid chase in Hefe durch Western-Blot-Analyse der Proteinmenge, gefolgt Zellen wird hier vorgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="607">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-961-32</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td style="width:105px;">Dot Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028068</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-0450</td>
			<td style="width:167px;">A tube roller is recommended to maintain overnight&#160; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Centrifuge 5430</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td style="width:105px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.205</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22364120</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">Analog Dri-Bath Heaters</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1172011AQ</td>
			<td style="width:167px;">It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &#176;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Heating block for 12 x 15-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-473-70</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-9Q</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td style="width:105px;">Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IPFL00010</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">459250</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Regulation der Proteinmenge ist entscheidend für nahezu jeden zellulären Prozess. Protein Fülle spiegelt die Integration der Geschwindigkeiten der Proteinsynthese und Proteinabbau. Viele Tests auf Proteinmenge Berichterstattung (zB Single-Zeitpunkt Western - Blot, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder wachstumsbasierten Reporter - Assays) keine Diskriminierung der relativen Auswirkungen der Übersetzung und Proteolyse auf Protein - Ebene ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid durch Western - Blot gefolgt Chase speziell Proteinabbau im Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) zu analysieren. In diesem Verfahren werden Hefezellen in Gegenwart des Translationsinhibitor Cycloheximid inkubiert. Aliquots von Zellen unmittelbar nach und in bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe von Cycloheximid gesammelt. Die Zellen werden lysiert und die Lysate werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt for Westernblot-Analyse von Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt. Die Cycloheximid chase Verfahren ermöglicht die Visualisierung der Abbaukinetik der Steady-State-Population einer Vielzahl von zellulären Proteinen. Das Verfahren kann die genetische Anforderungen und Umwelteinflüsse auf den Proteinabbau zu untersuchen, verwendet werden.

Zu Cycloheximid chase Methodik, die Stabilität der deg1 -Sec62 (Abbildung 1), ein Modell Hefe endoplasmatischen Retikulum (ER) -assoziierten Degradation (ERAD) -Substrat wurde 42-44 veranschaulichen analysiert. In ERAD, Qualitätskontrolle Ubiquitin-Ligase-Enzyme kovalent an die ER-Membran lokalisiert Ketten des kleinen Proteins Ubiquitin an anomale Proteine ​​anhängen. Solche polyubiquitylated Proteine ​​werden anschließend aus dem ER und ...

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Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.8K Aufrufe.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Serie: Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.