Name: cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
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The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

1. Wachstum und Ernte von Hefezellen <ol><li> Wenn nicht Abbaukinetik eines endogenen Hefe-Proteins zu analysieren, umwandeln gewünschten Hefestamm (s) mit einem Plasmid, das das interessierende Protein kodiert. Zuverlässige Methoden für die Transformation von Hefe wurden 37 zuvor beschrieben wurde . </li><li> Beimpfen von Hefe in 5 ml geeigneten Medium (beispielsweise eine selektive synthetische definiert (SD) Medium für Plasmiderhaltung von transformierten Zellen oder nicht-selektiven Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Medium für nicht-transformierte Zellen). über Nacht bei 30 ° C inkubieren, drehen. HINWEIS: 30 ° C ist die optimale Wachstumstemperatur für typische Wildtyp - Labor Hefestämme 38. Da jedoch einige mutanten Hefestämmen nicht wachsen optimal bei 30 ° C und einige Proteine ​​unterzogen werden temperaturabhängige Abbau die Temperaturen empirisch 39 bestimmt werden für Hefe Zellwachstum und Cycloheximid chase verwendet sollte. </li><li> Messen Sie the optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) jeder Übernachtkultur. HINWEIS: Die Zellen können in logarithmischen oder stationären Wachstumsphase sein , aber minimal eine Dichte erreicht haben , sollte die Verdünnung bis zu einer OD 600 ermöglichen = 0,2 in 15 ml frisches Medium. </li><li> Verdünne die Nacht - Kulturen auf eine OD 600 - Wert von 0,2 in 15 ml frisches Medium. </li><li> Inkubieren Hefe bei 30 ° C, Schütteln , bis die Zellen mittleren logarithmischen Wachstumsphase (dh eine OD 600 zwischen 0,8 und 1,2) erreichen. </li><li> Während des Zellwachstums Hefe, führen Sie die folgenden in Vorbereitung auf die Cycloheximid chase Verfahren: <ol><li> Stellen Sie einen Wärmeblock, der 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C für die Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid aufnehmen kann. Zugabe von Wasser zu den Vertiefungen der Heizblock eine effiziente Wärmeverteilung zu den Kulturen zu ermöglichen. Fügen Sie Wasser zu jeder Vertiefung, so dass eine 15 ml konischen Röhrchen wird der Wasserspiegel führen zu steigen, aber nicht überlaufen, um die Lippe des Brunnens. </li><li> Legen Sie einen zweiten Wärmeblock, der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf 95 ° C für Eiweißdenaturierung folgende Zell-Lyse aufnehmen kann. </li><li> Pre-warmes frisches Wachstumsmedium (1,1 ml pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden) bis 30 ° C. </li><li> In 50 ul 20x Stop-Mix zu vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen (ein Röhrchen pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden). Die Röhrchen auf Eis. VORSICHT: Natriumazid, ein Bestandteil in 20x Stop-Mix, ist giftig über die orale Einnahme oder Hautkontakt. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Umgang mit Natriumazid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt. </li></ol></li><li> Wenn die Zellen mittleren logarithmischen Wachstum erreicht haben, sammeln 2,5 OD 600 Einheiten jeder Kultur pro Zeitpunkt zu untersuch (zB 7,5 OD 600 Einheiten Proteinmenge zu drei Zeitpunkten zu analysieren). Zentrifuge gesammelten Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 3,000 × g bei Raumtemperatur für 2 min. HINWEIS: Eine OD600 - Einheit entspricht der Menge Hefe , die in 1 ml Kultur bei einer OD 600 von 1,0. V = X OD 600 Einheiten / Mess OD 600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich X OD 600 Einheiten (V) zu ernten kann durch Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt werden. Beispielsweise zur Ernte 7,5 OD 600 Einheiten von Hefe - Zellkultur bei einer OD 600 von 1,0, sammeln 7,5 OD 600 Einheiten / 1,0 = 7,5 ml Hefekultur. </li><li> Resuspendieren jedes Zellpellet in 1 ml 30 ° C (vorgewärmte) frisches Wachstumsmedium pro 2,5 OD 600 Einheiten von Zellen (beispielsweise 3 ml 7,5 OD 600 - Einheiten). </li></ol> 2. Cycloheximide Chase <ol><li> Hefe-Zellsuspensionen durch Inkubation für 5 min bei 30 ° C Heizblock äquilibrieren. </li><li> Bereiten Sie einen Timer von 0:00 aufwärts zu zählen. </li><li> Um die Cycloheximid Jagd, drücken Sie &quot;Start&quot; auf dem Timer beginnen. Schnell,aber sorgfältig, führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Hinzufügen Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 250 ug / ml zur ersten Hefezelle Suspension (beispielsweise hinzu 37,5 ul 20 mg / ml Cycloheximid Lager zu 3 ml der Zellsuspension) und vortex kurz zu mischen. ACHTUNG: Cycloheximid ist ein reizend Haut und ist toxisch bei der oralen Einnahme. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Handhabung Cycloheximid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt. </li><li> Unmittelbar nach Cycloheximid und Verwirbelung Zugabe, Transfer 950 ul (~ 2,4 OD 600 Einheiten) der Hefe - Zellsuspension mit zusätzlichem Cycloheximid zu einem vorher markierten Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul eiskaltes 20x Stop Mix. Vortex, um die Mikrozentrifugenröhrchen, und auf Eis, bis alle Proben gesammelt worden sind. </li><li> Liefert die Hefe-Zellsuspension auf 30 ° C. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis 2.30,3 für jede der verbleibenden Hefezelle Suspensionen in regelmäßigen Zeitintervallen (beispielsweise alle 30 sec, so daß Cycloheximid hinzugefügt # 1 um 0:00, Probe # 2 bei 0.30, Probe # 3 um 1:00 bis Probe usw.). </li><li> Bei jedem nachfolgenden Zeitpunkt, Wirbel Hefezelle Suspensionen und Transfer 950 ul an markierte Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul vorgekühlten 20x Stopp Mix enthält. Vortex und Ort gesammelten Zellen auf Eis. Rück 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C Heizblock. <ol><li> Beispielsweise für die Sammlung von Zellen 30 min nach Zugabe Cycloheximid (unter der Annahme von 30-sec Intervallen zwischen Cycloheximid neben Hefe-Zellsuspensionen zu Beginn des Zeitverlaufs), Vortexen und entfernen 950 &amp; mgr; l der Zellsuspension aus Probe # 1 bei 30:00 . Wiederholen für Probe # 2 bei 30:30, und so weiter. ANMERKUNG: Um zu verhindern, von Hefe Absetzen vortex Zellsuspensionen in 15 ml konische Röhrchen etwa alle 5 min im Verlauf des chase. Alternativ Hefe Zellsuspensions kann in einem kontinuierlich Rühren Wasserbad für die Dauer des Experiments Cycloheximid chase aufrechterhalten werden. </li></ol></li><li> Wenn alle Proben gesammelt worden sind, gesammelt Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 × g bei Raumtemperatur für 30 sec. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen. Die Zellen sind nun bereit für die alkalische Lyse. Alternativ Snap-freeze-Zellen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C pelletiert. </li></ol> 3. Post-alkalische Proteinextraktion (Modified aus 16,40) <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l destilliertes Wasser zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. </li><li> Zugabe von 100 ul 0,2 M NaOH zu jeder Probe. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. </li><li> Inkubieren suspendierten Zellen bei Raumtemperatur für 5 min. In diesem Stadium haben Hefezellen nicht lysiert, und die Proteine ​​wurden nicht 40 freigegeben. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 × g bei Raum Temperamenttur für 30 Sekunden. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. </li><li> Um lysieren Zellen, 100 &amp; mgr; l Laemmli-Probenpuffer zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. HINWEIS: Sequential Inkubation von Zellen mit NaOH und Laemmli-Probenpuffer Freisetzungen Proteine ​​in einer Form kompatibel mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem verwendet wird. </li><li> bei 95 ° C inkubieren 5 min voll Proteine ​​zu denaturieren. HINWEIS: Die Inkubation bei 95 ° C kann nicht für die Analyse von Proteinen geeignet sein , die zur Aggregation neigen (beispielsweise Proteine ​​mit mehreren transmembrane segments). Diese Proteine ​​können unlöslich werden , wenn sie bei erhöhten Temperaturen 41 inkubiert. So kann für die Analyse derartiger Proteine ​​sollten Lysate bei niedrigeren Temperaturen (zB 37 ° C - 70 ° C) inkubiert, für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt. </li><li> Centrifuge Lysate bei 18.000 × g bei room Temperatur 1 min unlösliche Material zu pelletieren. Der Überstand (solubilisiert extrahierte Protein) bereit ist für die Trennung durch SDS-PAGE und anschließendem Western-Blot-Analyse. Alternativ speichern Lysate bei -20 ° C. </li></ol> 4. Repräsentative SDS-PAGE und Western Blot - Verfahren (Angepasst von 16) <ol><li> Lastproteinmolekulargewichtsstandards und empirisch ermittelten Volumen der Lysate auf einem SDS-PAGE-Gel. HINWEIS: Wählen Sie den Prozentsatz von Acrylamid und Bisacrylamid im Gel SDS-PAGE, bezogen auf das Molekulargewicht des Proteins von Interesse. In der Regel niedriger sind Prozentsatz Gele besser geeignet für höhermolekulare Proteine ​​zu lösen. </li><li> Führen Gel bei 200 V, bis die Farbstofffront hat den unteren Rand des Gels erreichte. </li><li> Transferproteine ​​aus dem Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C. </li><li> Block Membran durch Inkubation in Tris-gepufferter Saline (TBS), enthaltend 5% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht. ANMERKUNG: Um das mikrobielle Wachstum in Gegenwart einer Membran über Nacht inkubiert verhindern, wird empfohlen, Natriumazid in der Blockierungslösung bei einer Endkonzentration von 0,02% enthalten. </li><li> Inkubieren Membran mit primärem Antikörper, der spezifisch für Protein von Interesse in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) und 1% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln. HINWEIS: Fluorophore sind lichtempfindlich. Deshalb, um Fluorophoren konjugiert Verdünnungen von Antikörpern sollte im Dunkeln hergestellt werden, und die Inkubation der Membranen in der Gegenwart von Antikörpern gegen Fluorophore und nachfolgende Waschschritte in konjugiert lichtundurchlässigen (beispielsweise folienumwickelte) co auftretenntainers. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Bild Membran mit LI-COR Odyssey CLx und Bild-Studio-Software (oder einem vergleichbaren Bildgeräte und Software), nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Membran Bild Nach dem Erwerb, Inkubation der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für eine Ladekontrollprotein in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, schaukeln. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Bild Membran, wie in Schritt 4.9. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In diesem Dokument wird ein Verfahren Protein Abbaukinetik zur Analyse dargestellt. Diese Technik kann leicht zu einer Reihe von Proteinen, die durch eine Vielzahl von Mechanismen abgebaut angewendet werden. Es ist wichtig zu beachten, daß Cycloheximid chase-Experimente berichten über Abbaukinetik des steady state Pool eines bestimmten Proteins. Andere Techniken können die Abbaukinetik von spezifischen Populationen von Proteinen zu analysieren. Zum Beispiel kann die degradative Schicksal von naszierenden Polypeptiden...

Proteine ​​erfüllen wichtige Funktionen in praktisch jeder zelluläre Prozess. Viele physiologische Prozesse erfordern die Anwesenheit eines spezifischen Proteins (oder Proteine) für einen definierten Zeitraum oder unter bestimmten Umständen. Organismen deshalb überwachen und Proteinmenge regulieren die zelluläre Bedürfnisse 1 erfüllen. Zum Beispiel Cycline (Proteine, die Zellteilung kontrollieren) vorhanden sind , in bestimmten Phasen des Zellzyklus und der Verlust der geregelten cyclin Ebenen hat mit malignen Tumorbildung 2 verbunden. Zusätzlich Proteinspiegel zu regulieren zelluläre Bedürfnisse zu erfüllen, verwenden Zellen zersetzenden Qualitätskontrollmechanismen misfolded, unmontiert oder auf andere Weise anomale Proteinmoleküle 3 zu beseitigen. Kontrolle der Proteinmenge beinhaltet Regulierung sowohl makromolekularen Synthese (Transkription und Translation) und Abbau (RNA Zerfall und Proteolyse). Beeinträchtigte oder übermäßige trägt Proteinabbau zu mehreren PathologienEinschließlich Krebs, Mukoviszidose, neurodegenerativen Erkrankungen und Herz - Kreislauf - Erkrankungen 4-8. Proteolytischen Mechanismen stellen somit vielversprechende therapeutische Ziele für eine Reihe von Krankheiten 12.09. Analyse von Proteinen in einem einzigen Zeitpunkt (zB durch Western - Blot - 13, Durchflusszytometrie 14 oder Fluoreszenzmikroskopie 15) stellt eine Momentaufnahme der steady state Proteinmenge , ohne dass die relativen Beiträge der Synthese oder Abbau offenbaren. Ähnlich wachstums basierten Reporterassays reflektieren steady state - Proteinspiegel über einen längeren Zeitraum ohne 15-20 zwischen den Einflüssen der Synthese und Abbau zu unterscheiden. Es ist möglich , den Beitrag der degradative Prozesse steady state - Proteinspiegel durch Überfluß Vergleich zu schließen , vor und nach der spezifischen Komponenten des Mechanismus degradative Hemmen (beispielsweise durch die pharmakologisch Prote inaktivierendeasome 21 oder ein Gen vermutet , Ausschlagen zu 13 Abbau erforderlich). Eine Änderung in steady state - Proteinspiegel nach Abbauwege sorgt für den Beitrag der Proteolyse zur Kontrolle der Proteinmenge 13 starke Beweise hemmen. Allerdings ist eine solche noch eine Analyse keine Informationen über die Kinetik des Proteinumsatzes bereitstellen. Durch Western - Blot gefolgt Cycloheximide Chase überwindet diese Schwächen , indem Forscher Proteinabbau im Laufe der Zeit von 22 bis 24 sichtbar zu machen. Ferner wird in der Regel durch Western - Blot, radioaktive Isotope und langwierige Immunpräzipitation Schritte sind nicht erforderlich , für Cycloheximid Jagd, im Gegensatz zu vielen häufig verwendeten Puls chase Techniken, die auch durchgeführt werden , zu visualisieren Proteinabbau 25 durchgeführt , da Proteindetektion folgende Cycloheximid Jagd. Cycloheximide wurde zuerst als eine Verbindung mit Anti-Pilz richtige identifiziertBindungen von den grampositiven Bakterium Streptomyces griseus 26,27 erzeugt. Es ist eine zellpermeable Molekül , das spezifisch eukaryotische cytosolischen hemmt (aber nicht organellären) Übersetzung von der ribosomalen Translokation 28-31 beeinträchtigen. In einem Cycloheximid chase Experiment wird Cycloheximid zu Zellen zugesetzt, und Aliquote der Zellen werden sofort und zu bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe der Verbindung 22 gesammelt. Die Zellen werden lysiert und Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt, typischerweise durch Western-Blot analysiert. Vermindert in Proteinmenge nach der Zugabe von Cycloheximid kann getrost auf den Proteinabbau zurückzuführen. Ein instabiles Protein wird in Hülle und Fülle im Laufe der Zeit ab, während ein relativ stabiles Protein wenig Veränderung in Hülle und Fülle aufweisen wird. Mechanismen der selektiven Proteinabbau wurden in ganz Eukarya hoch konserviert. Vieles von dem, was über den Proteinabbau bekannt ist, wurde zum ersten Mal gelernt, indas Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) 25,32-36. Studien mit Hefe sind wahrscheinlich neue und wichtige Einblicke in Proteinabbau fortzusetzen bereitstellt. Verfahren zur Cycloheximid chase in Hefe durch Western-Blot-Analyse der Proteinmenge, gefolgt Zellen wird hier vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>A tube roller is recommended to maintain overnight&amp;nbsp; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&amp;nbsp;</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heaters</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &amp;deg;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td></tr><tr><td>Heating block for 12 x 15 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td></tr><tr><td>Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Regulation der Proteinmenge ist entscheidend für nahezu jeden zellulären Prozess. Protein Fülle spiegelt die Integration der Geschwindigkeiten der Proteinsynthese und Proteinabbau. Viele Tests auf Proteinmenge Berichterstattung (zB Single-Zeitpunkt Western - Blot, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder wachstumsbasierten Reporter - Assays) keine Diskriminierung der relativen Auswirkungen der Übersetzung und Proteolyse auf Protein - Ebene ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid durch Western - Blot gefolgt Chase speziell Proteinabbau im Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) zu analysieren. In diesem Verfahren werden Hefezellen in Gegenwart des Translationsinhibitor Cycloheximid inkubiert. Aliquots von Zellen unmittelbar nach und in bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe von Cycloheximid gesammelt. Die Zellen werden lysiert und die Lysate werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt for Westernblot-Analyse von Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt. Die Cycloheximid chase Verfahren ermöglicht die Visualisierung der Abbaukinetik der Steady-State-Population einer Vielzahl von zellulären Proteinen. Das Verfahren kann die genetische Anforderungen und Umwelteinflüsse auf den Proteinabbau zu untersuchen, verwendet werden.

Zu Cycloheximid chase Methodik, die Stabilität der deg1 -Sec62 (Abbildung 1), ein Modell Hefe endoplasmatischen Retikulum (ER) -assoziierten Degradation (ERAD) -Substrat wurde 42-44 veranschaulichen analysiert. In ERAD, Qualitätskontrolle Ubiquitin-Ligase-Enzyme kovalent an die ER-Membran lokalisiert Ketten des kleinen Proteins Ubiquitin an anomale Proteine ​​anhängen. Solche polyubiquitylated Proteine ​​werden anschließend aus dem ER und ...

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Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

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Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.8K Aufrufe.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Serie: Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Tuning Degradation, um eine spezifische und effiziente Proteinerschöpfung zu erreichen

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Immunologie und Infektion

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biologie

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

Saccharomyces cerevisiae Yeast as a Model Organism

Eine Einführung in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

Lehre

JoVE Science Education

Grundlegende Biologie

Modellorganismen I: Hefe, Drosophila und C. elegans

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Assay für den Abbau von fehlgefalteten Proteinen: Eine Technik zur Überwachung des Abbaus fehlgefalteter Proteine mittels Cycloheximid-Behandlung und Detergenzfraktionierung

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in

Zusammenfassung

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